CN107475193B - Padi4刺激的dc-cik细胞组合物及应用 - Google Patents

Padi4刺激的dc-cik细胞组合物及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107475193B
CN107475193B CN201710756393.2A CN201710756393A CN107475193B CN 107475193 B CN107475193 B CN 107475193B CN 201710756393 A CN201710756393 A CN 201710756393A CN 107475193 B CN107475193 B CN 107475193B
Authority
CN
China
Prior art keywords
padi4
cells
cik
cell
padi
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710756393.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107475193A (zh
Inventor
常晓天
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pujian Bio Wuhan Technology Co ltd
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201710756393.2A priority Critical patent/CN107475193B/zh
Publication of CN107475193A publication Critical patent/CN107475193A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107475193B publication Critical patent/CN107475193B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了PADI4刺激的DC‑CIK细胞组合物及应用。属于肿瘤的免疫治疗技术领域，本发明通过研究PADI4作为肿瘤标记物在DC‑CIK细胞免疫治疗中的潜在作用，提供了一种PADI4刺激的DC‑CIK细胞组合物及其用于肿瘤治疗的应用。PADI4蛋白可以明显促进DC成熟、CIK细胞增殖和细胞毒性，PADI4刺激的DC‑CIK细胞显著抑制肿瘤生长，表明PADI4通过促进DC成熟与CIK细胞增殖和细胞毒性作用对肿瘤生长产生影响。PADI4可能成为增强细胞免疫治疗的强吸引力的目标抗原。

Description

PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及肿瘤微环境和肿瘤的免疫治疗技术领域，尤其涉及PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物及其用于肿瘤治疗的应用。
背景技术
树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是体内最强大的抗原递呈细胞。DCs将肿瘤抗原递呈给T淋巴细胞，促进Th细胞(helper T cell)、细胞毒性T细胞的生成和效应T细胞的活化诱导免疫反应。DCs肿瘤微环境中发挥关键作用。在抗肿瘤反应中，DCs是体内功能最强的专职抗原递呈细胞。DCs通过调节浸润细胞毒性T淋巴细胞反应的程度和持续时间调节抗肿瘤反应(M.Tang,J.Diao,M.S.Cattral,Cell Mol.Life Sci.74,761-776(2017))。细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer，CIK)是一组以CD3和CD56为标记的异构细胞，具有T细胞强大的抗肿瘤活性和非MHC限制的自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)肿瘤杀伤能力。DCs和CIK细胞可以通过细胞毒作用增强免疫应答和肿瘤细胞杀伤，成为细胞免疫治疗中应用最多的细胞类型。DCs的先天抗原递呈能力可以增强CIK的细胞毒性，有效弥补其特异性的不足。因此,与单独用DCs或CIK细胞治疗相比，DCs和CIK细胞的联合应用作为一种更有效的治疗策略，可显著增加对靶细胞毒性作用，已被用于治疗恶性肿瘤如前列腺癌、胰腺癌和肺癌等(S.B.Shi,T.H.Ma,C.H.Li,X.Y.Tang,Tumori.98,314-319(2012)；Y.Cui,X.Yang,W.Zhu,J.Li,X.Wu,Y.Pang,Oncol.Lett.6,537-541(2013)；Y.Yuanying,N.Lizhi,M.Feng,W.Xiaohua,Cryobiology 67,235-240(2013)；R.Zhong,B.Han,Zhong H.A，Tumour Biol.35,987-994(2014)；D.Gao,C.Li,X.Xie,P.Zhao,X.Wei,W.Sun,H.C.Liu,A.Alexandrou,PLoS One 9,e93886(2014)；H.Li,C.Wang,J.Yu,S.Cao,F.Wei,Cytotherapy 11,1076-1083(2009))。例如,在非小细胞肺癌的治疗中，与DCs或CIK细胞疗法相比，DC-CIK细胞治疗可以显著改善无进展生存和整体生存并提高疾病控制的比例(S.Wang,Z.Wang,Immunopharmacol.28,22-28(2015))。
在临床治疗中，体外培养的肿瘤细胞和肿瘤组织裂解物的全抗原常用于负载DCs，使DCs具有靶向性杀伤能力。此外，在DCs或DC-CIK细胞免疫疗法中，肿瘤RNA、多肽(如CEA，MUC1和P53)和前列腺酸性磷酸酶是DC抗原表位体外致敏常用的肿瘤标记物(A.Nencioni,P.Brossart,Cellular immunotherapy with dendritic cells in cancer:currentstatus.Stem Cells 22,501-513(2004))。现有技术中也公开了多种负载肿瘤标记物的DC-CIK细胞治疗，如CN201710090026.3公开了DC-CIK细胞和抗PD-1抗体组合物及其用途，CN201610031085.9公开了负载Oncopox-IL-24的人DC-CIK免疫活性细胞及其用途。然而，在肿瘤组织中肿瘤特异性蛋白经常会因表达量低而不足以诱导强大的免疫反应。此外，不同患者肿瘤组织中蛋白质表达谱存在明显的个体性差异，导致治疗效果显著不同。因此，为了制作可用于多种肿瘤的DC-CIK细胞疫苗，负载DCs的理想的肿瘤标记物应在各种肿瘤组织中具有广泛的表达谱并且表达量足够高。
肽基精氨酸脱亚胺酶4(Protein arginine deiminases isoform 4，PADI4)是一种通过将精氨酸转换成瓜氨酸参与转录后蛋白修饰的酶。发明人前期已证实PADI4在许多人类肿瘤组织表达很高，包括宫颈鳞状细胞癌、胃癌、肺癌、卵巢浆液性乳头状腺癌和甲状腺乳头状癌(X.Chang,J.Han,L.Pang,Y.Zhao,Y.Yang,Z，BMC Cancer 9,40(2009))。并且，PAD抑制剂可成为治疗肿瘤的潜在药物(Y.Wang,P.Li,S.Wang,J.Hu,X.A.Chen,J.Wu,J.Biol.Chem.287,25941-25953(2012))。
发明内容
针对上述现有技术DC-CIK细胞免疫治疗的现状，本发明致力于开发新的提高DC-CIK治疗效率的潜在肿瘤标记物。在发明人前期研究的基础上，本发明试验了PADI4作为肿瘤标记物在DC-CIK细胞免疫治疗中的潜在作用，从而提出了本发明。
本发明的目的之一在于提供一种PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物。
本发明的目的之二在于提供PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物的制备方法。
本发明的目的之三在于提供PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物的用途。
为实现上述发明目的，具体的，本发明涉及以下技术方案:
首先，本发明公开了一种PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物及其制备方法。
所述细胞组合物是由有效剂量的DC-CIK细胞和PADI4蛋白组成，或者由有效剂量的DC-CIK细胞和高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物组成。
优选的，所述PADI4蛋白为重组表达PADI4蛋白，如PADI4的原核表达蛋白。
优选的，高表达PADI4的肿瘤细胞为通过基因工程手段使得PADI4基因在肿瘤细胞细中过表达的肿瘤细胞系。
PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物的制备方法为：PADI4蛋白或高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物先与DCs共培养，负载PADI4后的DC再与CIK细胞共培养，获得PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物。
优选的，PADI4蛋白或高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物先与DCs共培养24h及以上促进DCs成熟。
优选的，负载PADI4后的DC与CIK细胞共培养6天及以上。
优选的，PADI4蛋白或高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物DCs共培养进行PADI4的负载过程中，PADI4蛋白与DC的比例为20μg/106个细胞的浓度。
其次，本发明公开了PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物在癌症细胞免疫治疗中的应用。
具体的，本发明公开了PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物在制备治疗癌症或延缓癌症进展的免疫药物中的应用。
所述癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、食管癌、肝癌、肾癌、结直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌等适于DC-CIK治疗的癌症类型。优选的，所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、食管癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、宫颈鳞状细胞癌、胃癌、肺癌、卵巢浆液性乳头状腺癌和甲状腺乳头状癌。
优选的，所述癌症处于中晚期阶段。
本发明还公开了PADI4用于制备促进DC成熟和/促进CIK细胞增殖和细胞毒性的试剂中的用途。所述试剂为PADI4蛋白或高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物。
本发明取得了以下有益效果：
本发明用基因工程方法建立PADI4重组DNA质粒，将该工程质粒导入培养的肿瘤细胞系细胞，然后用高表达PADI4蛋白的肿瘤细胞裂解物刺激DC-CIK，结果，受激活成熟DC的比例增加了10％，CIK细胞增殖升高了53％，对肿瘤细胞的杀伤能力升高了12％，用该DC-CIK治疗荷瘤小鼠，小鼠肿瘤体积减少了18.3％；本发明采用纯化的PADI4重组蛋白刺激DC-CIK，结果，成熟的DC比率升高了112％，小鼠肿瘤体积降低了35％。结果表明，PADI4可能成为提高DC-CIK治疗效率的潜在肿瘤标记物。PADI4刺激的DC-CIK可以大大提高DC-CIK的治疗效率。
附图说明
图1.使用流式细胞术检测DC细胞中的CD11c，CD40，CD80，CD83和CD86表达。将DC细胞与转染不同表达质粒的ECA-109细胞的裂解物一起孵育。表达质粒包括RFP质粒(OE-RFP)(a)，TXNDC5质粒(OE-TXNDC5)(b)，PADI4质粒(OE-PADI4)(c)，流式细胞术结果的统计学分析(d)。
图2.CIK细胞增殖，活力和细胞毒性的检测。(a)用负载RFP-过表达(OE-RFP)，TXNDC5-过表达(OE-TXNDC5)或PADI4-过表达(OE-PADI4)ECA-109细胞的裂解物的DC细胞与CIK细胞共培养，台盼蓝染色后CIK细胞计数。(b)台盼蓝染色后分析CIK细胞活力。(c)CCK8试剂盒测定用DC-CIK细胞处理后的ECA-109细胞的数量。星号表示与负载PADI4-过表达细胞的裂解物的DC-CIK细胞组和与对照组DC-CIK细胞之间的显着差异。*表示p<0.05。
图3.检测荷瘤小鼠中DC-CIK细胞的治疗效率。将ECA-109细胞注射到裸鼠中构建荷瘤小鼠模型。在注射肿瘤细胞后28天，29天，30天和31天时，分别将RFP-过表达或PADI4-过表达的ECA-109细胞的裂解物诱导的DC-CIK细胞注射到荷瘤小鼠中。(a)在ECA-109细胞注射后44天时，从荷瘤小鼠中切下肿瘤组织。(b)在肿瘤细胞注射后44天时，用MRI测量肿瘤的形状和大小。(c)肿瘤细胞注射后28d，36d，40d和44d，用游标卡尺测量并分析总肿瘤体积。
图4.使用流式细胞术检测DC细胞上的CD11c，CD40，CD80，CD83和CD86表达。DC细胞分别负载(a)d-rPADI4和(b)rPADI4。(c)上述FCM结果的统计分析。星号表示用rPADI4诱导的DC细胞组与对照组之间的显着差异。*表示p<0.05。
图5.CIK细胞增殖，活力和细胞毒性的检测。用负载rPADI4的DCs诱导CIK细胞。用负载d-rPADI4的DCs诱导的CIK细胞作为对照。(a)在与DCs共培养后CIK细胞计数。(b)与DCs共培养后分析CIK细胞的存活力。(c)CCK8试剂盒检测DC-CIK细胞对ECA-109肿瘤细胞的细胞毒性作用。用负载d-rPADI4的DCs诱导的CIK细胞作对照。星号表示两组之间的显着差异。*表示p<0.05。
图6.测量荷瘤小鼠中DC-CIK细胞的治疗效率。将ECA-109细胞注射到裸鼠中构建荷瘤小鼠模型。在ECA-109细胞注射后28d，29d，30d和31d，将DC-CIK细胞注射到荷瘤小鼠中。用负载rPADI4的DC诱导CIK细胞。用负载d-rPADI4DC诱导的CIK细胞作为对照。(a)在ECA-109细胞注射后44天，从荷瘤小鼠中切下肿瘤组织。(b)在肿瘤细胞注射后44天，用MRI测量肿瘤的形状和大小。(c)肿瘤细胞注射后28天，36天，40天和44天时用游标卡尺测量分析总肿瘤体积。
图7.检测ECA-109细胞中重组PADI4和TXNDC5蛋白的表达水平。(a)将PADI4或TXNDC5cDNA插入到pcDNA3.1-PADI4-RFP质粒中，并转染到ECA-109细胞中表达。使用免疫印迹分析检测PADI4，TXNDC5和RFP表达。(b)通过实时定量PCR检测PADI4的相对mRNA水平。(c)通过实时PCR检测TXNDC5的相对mRNA水平。星号表示与对照组的显着差异，**表示p<0.01。
图8.使用流式细胞术检测CD3+CD4+，CD3+CD8+和CD3+CD16+CD56+CIK细胞。用负载RFP-过表达(OE-RFP)(a)，TXNDC5-过表达(OE-TXNDC5)(b)或PADI4-过表达ECA-109细胞的裂解物的DCs诱导CIK细胞(OE-PADI4)(c)。流式细胞术结果的统计学分析(d)。
图9.使用SDS-PAGE检测大肠杆菌中PADI4的重组表达。将PADI4基因插入到pGEx-4T1质粒中，并在大肠杆菌BL21中表达。PADI4蛋白以可溶形式表达，并使用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化。使用蛋白酶K消化重组PADI4蛋白。使用具有考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE检查重组PADI4蛋白(r-PADI4)和消化的重组蛋白(d-PADI4)。
图10.使用流式细胞仪检测CD3+CD4+，CD3+CD8+和CD3+CD16+CD56+CIK细胞。(a)用负载d-rPADI4的DCs诱导CIK细胞。(b)用负载rPADI4的DCs诱导CIK细胞。(c)FCM结果的统计分析。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，目前还未有关于PADI4作为提高DC-CIK治疗效率的肿瘤标记物的报道。基于此，本发明通过PADI4作为提高DC-CIK治疗效率的标志物进行实验，提出了本发明。
本发明的一个具体实施方式中公开了PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物。
所述细胞组合物是由有效剂量的DC-CIK细胞和PADI4蛋白组成，或者由有效剂量的DC-CIK细胞和高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物组成。
优选的实施例中，所述PADI4蛋白为重组表达PADI4蛋白，如PADI4的原核表达蛋白。具体的，PADI4的原核表达蛋白通过将PADI4基因克隆到原核表达载体，利用大肠杆菌进行可溶性表达并纯化，获得重组表达PADI4蛋白。
本发明优选的实施例中，高表达PADI4的肿瘤细胞为通过基因工程手段使得PADI4基因在肿瘤细胞细中过表达的肿瘤细胞系。例如可用于过表达PADI4基因的肿瘤细胞系包括但不限于A549肺腺癌细胞、U87人脑胶质瘤细胞、kasumi-1急性骨髓细胞白血病细胞系、K562人慢性髓系白血病细胞、SW480人结肠癌细胞、PC-3人前列腺癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞系、Hepg2人肝癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、SK-OV-3人卵巢腺癌细胞、ECA-109食管癌细胞系等。
本发明的一个具体验证例利用ECA-109食管癌细胞系进行，利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所述引物扩增PADI4(cDNA全长为1,992bp，编码包含663个氨基酸的蛋白)，插入表达载体转染ECA-109食管癌细胞系，获得高表达PADI4的肿瘤细胞。
高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物的制备方法为：细胞冻融裂解，裂解液离心过滤灭菌，收集上清液。
本发明的另一个实施方式中公开了PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物的制备方法：PADI4蛋白或高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物先与DCs共培养，负载PADI4后的DC再与CIK细胞共培养，获得PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物。
优选的实施例中，PADI4蛋白或高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物先与DCs共培养24h及以上促进DCs成熟。
更优选的实施例为，负载PADI4后的DC与CIK细胞共培养6天及以上。
优选的，PADI4蛋白或高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物DCs共培养进行PADI4的负载过程中，PADI4蛋白与DC的比例为20μg/106个细胞的浓度。
本发明的实施方式还公开了PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物在癌症细胞免疫治疗中的应用。
具体的，本发明公开了PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物在制备治疗癌症或延缓癌症进展的免疫药物中的应用。
所述癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、食管癌、肝癌、肾癌、结直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌等适于DC-CIK治疗的癌症类型。优选的，所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、食管癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、宫颈鳞状细胞癌、胃癌、肺癌、卵巢浆液性乳头状腺癌和甲状腺乳头状癌。
优选的，所述癌症处于中晚期阶段。
本发明的实施方式中还公开了PADI4蛋白用于制备促进DC成熟和/促进CIK细胞增殖和细胞毒性的试剂中的用途。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
1、材料和方法
外周血由年轻健康的志愿者捐赠(25-35岁，n＝12，女性＝6)。除外任何重大疾病史者。志愿者均是来自千佛山医院的学生和工作人员。本发明研究已由中国济南千佛山医院伦理委员会批准，并取得了所有志愿者关于同意参与这项研究的知情同意书。
PADI4在ECA-109细胞中的过表达
利用TRIzol试剂(Beyotime生物技术，上海，中国)从EC组织中提取总RNA。随后RNA被反向转录成第一链cDNA。PADI4cDNA全长为1,992bp，编码包含663个氨基酸的蛋白。PADI4的完整cDNA序列通过以下特定PCR引物对进行扩增:
PADI4-EcoRI-Fex:TACTCAGAATTCATGGCCCAGGGGACATTG(SEQ ID NO:1),
PADI4-AscI-Rex:TACTCAGGCGCGCCGAGGGCACCATGTCCA(SEQ ID NO:2)。其中限制酶消化位点用下划线标记。PCR条件如下:94℃预变性3分钟；94℃30s，55℃45s，72℃90s，35个循环；最后72℃10分钟。PCR产物被插入pcDNA3.1-RFP。RFP作为一个报告基因插入pcDNA3.1。使用PolyJetTMDNA体外转染试剂(美国马里兰州SignaGen)将质粒pcDNA3.1-PADI4-RFP转染入ECA-109细胞。转染的细节过程如下:用50μL RPMI-1640无血清培养基(Gibco,奥克兰,新西兰，含1％青霉素-链霉素)稀释6μL PolyJetTM转染试剂，轻轻混合。另外，单独用50μL RPMI-1640无血清培养基(含1％青霉素-链霉素)稀释2ug质粒，轻轻混合。这些混合物室温孵育10分钟。将稀释的转染溶试剂和质粒溶液温和混匀，在室温下孵育10分钟。DNA-脂质体混合物随后加入到含1000μL RPMI 1640完全培养基的孔中,细胞培养24小时。之后原培养基被替换为RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素),37℃，5％二氧化碳环境再培养48h。然后收取转染的细胞用于进一步的实验。TXNDC5被用作非特异性对照。全长TXNDC5cDNA为1,299bp，编码含432个氨基酸残基的蛋白质。TXNDC5的完整cDNA序列是通过使用一对特异性引物PCR扩增：
TXNDC5-BamHI-Fex:TACTCAGGATCCCATGGAAGATGCCAAA(SEQ ID NO:3)
TXNDC5-AscI-Fex:TACTCAGGCGCGCCGAAAGTTCGTCTTTCGC(SEQ ID NO:4)。采用如上方法构建pcDNA3.1-TXNDC5-RFP质粒。
制备ECA-109细胞裂解物
将PADI4、TXNDC5或RFP重组质粒成功转染成ECA-109细胞后，细胞在1500rpm离心5分钟，重悬于1mLPBS。细胞悬液通过5个循环的冻融(-80℃/37℃)裂解。裂解液以12000rpm离心15分钟，过滤灭菌。收集上清液，用Bradford法测定蛋白浓度。
重组PADI4蛋白的原核表达
利用TRIzol试剂从EC组织中提取总RNA。提取的RNA被逆转录成第一链cDNA。然后,cDNA被用作模板来扩增全长PADI4，使用以下特定PCR引物对:
PADI4-EcoRI-Fex:TACTCAGAATTCATGGCCCAGGGGACATTG(SEQ ID NO:5)
PADI4-SalI-Rex:TACTCAGTCGACTCAGGGCACCATGTTCCA(SEQ ID NO:6)。PCR条件如下94℃预变性3分钟；94℃30s,55℃45s,72℃90s，35个循环；最后72℃10分钟。PCR产物测序,插入到pGEx-4T1表达载体。pGEx-4T1是一种常用的原核表达载体，具有氨苄青霉素抗性和GST标记，用于纯化重组蛋白。随后将重组质粒转化为大肠杆菌BL21宿主细胞。使用异丙基-β-D-硫代半乳糖甘酶(0.1mM)诱导重组PADI4表达，16℃过夜。PADI4重组蛋白(r-PADI4)以可溶性形式表达，用谷胱甘肽琼脂糖珠子提纯。蛋白质浓度是用Bradford蛋白测定试剂盒(Beyotime，中国)确定的。内毒素浓度计算使用QCL-1000TM鲎变形细胞溶解产物(LAL)试验(美国Walkersville Lonza)。PADI4重组蛋白使用蛋白酶K消化(工作浓度:50μg/毫升)，58℃，2h。消化PADI4重组蛋白(d-rPADI4)在95℃，1小时，然后加热使酶失活。r-PADI4和d-rPADI4经SDS-聚丙烯酰胺凝胶和考马斯亮蓝染色验证。
外周血单核细胞的制备(PBMCs)
全血2000rpm离心20分钟，弃血浆上清。以1:1的比率将这些颗粒细胞重新悬浮在PBS中，随后在50ml的无菌离心管中用密度梯度离心法，2000rpm离心30分钟，分离颗粒细胞。收集白膜层，在50毫升的PBS中被重新悬浮，在1500rpm中离心15分钟。颗粒细胞在50ml的PBS中被重新悬浮，1300rpm离心15分钟。在丢弃上清液后得到PBMC细胞。用50毫升PBS重悬单核细胞，计数并用台盼蓝染料观察。
单核细胞衍生DCs的制备
使用CD14微珠(Miltenyi,Germany)纯化PBMCs，并用流式细胞仪验证单核细胞的纯度。诱导单核细胞分化成DCs,计数纯化CD14+单核细胞数，用rpmi-1640培养基(含有1％青霉素和链霉素，10％FBS,1mM谷氨酰胺,1000U/ml人rGM-CSF，1000U/ml人rIL-4)培养在37℃含5％的二氧化碳湿润的环境中。
每2天更换一半培养基，连续培养6天后收集MDDCs。MDDCs的纯度为>99％，如FCM检测CD11c的表达一样。
促进DC的成熟
用RPMI-1640培养基(含有1％青霉素和链霉素，10％FBS,1mM谷氨酰胺,1000U/ml人类rGM-CSF，1000U/ml人类rIL-4)，在37℃含5％的二氧化碳湿润的环境中培养六天后,将PADI4-过表达的ECA-109的细胞裂解产物或20μg/ml rPADI4加入到MDDC培养基,细胞继续培养24h进DC的成熟。以TXNDC5-或RFP-过表达的ECA-109细胞作为PADI4-过表达细胞裂解液诱导DC的对照，而消化的rPADI4(d-rPADI4)则用于rPADI4的DC诱导对照。刺激后，收集MDDCs。细胞表面分子的表达，包括CD11c、CD40、CD80、CD83和CD86，分别用CD11c-PeCy5、CD40-APC、CD80-PeCy7、CD83-FITC和CD86-PE抗体采用流式细胞术进行检测。
CIK细胞的制备
PBMCs用RPMI-1640培养基(含有1％青霉素和链霉素，10％FBS)，在37℃含5％的二氧化碳湿润的环境中培养。培养第一天,1000U/mlγ干扰素(IFN-γ；BioLegend，美国)被添加到培养基中。24h后，50ng/ml抗CD3抗体，300U/ml IL-2和100U/ml IL-1α被添加到培养基中。含有1％青霉素/链霉素，10％FBS，1mM谷氨酰胺和300U/ml IL-2的新鲜培养基，每两天添加到细胞中，比例为1:1。
流式细胞术
MDDCs 1100rpm离心10分钟。丢弃后上层清液,用MAC缓冲液(含有0.5％的FBS和2mM EDTA的PBS)清洗并重悬MDDCs，用PE-cy5标记的抗CD11c抗体、APC标记的抗CD40抗体,PE-cy7标记的抗CD80抗体、FITC-标记的抗CD83抗体或PE标记的抗CD86抗体，避光室温下30分钟。在使用mac缓冲液清洗后，MDDCs用200ml 1％的多聚甲醛固定，并通过FCM进行分析。采用台盼蓝染色进行细胞增殖和活性分析细胞1100rpm离心10分钟。在丢弃上清液后，细胞在PBS中被重新悬浮。然后,90μl细胞悬液与10μl台盼蓝染液(0.4％)混匀，显微镜下细胞计数。死细胞染蓝色，活细胞不染色。
MDDCs与CIK细胞共培养
MDDCs和CIK细胞按照上述程序制备并培养6天rPADI4或PADI4-过表达ECA-109细胞裂解产物作为抗原负载MDDCs(20μg/106个细胞的浓度)。MDDCs用RPMI-1640培养基(含有1％青霉素和链霉素，10％FBS)，在37℃含5％的二氧化碳湿润的环境中培养。培养24小时后，将TNF-α(500U/ml)添加到培养基中,再培养24h。收集MDDC，并与CIK细胞以1:10的比例共培养；在补充有300U/ml IL-2(山东春季药业有限公司，中国济南)，1％青霉素/链霉素和10μl的RPMI-1640培养基中培养约105个MDDC细胞10％FBS在5％CO2的加湿环境中，37℃下6天。在培养6天后，每1天将1％青霉素/链霉素，10％FBS，1mM谷氨酰胺(Sigma-Aldrich，中国上海)和300U/ml IL-2的完整培养基加入细胞中。收获共培养细胞用于进一步分析。
体外T细胞毒性试验
ECA-109细胞计数，接种于96孔板(5×103细胞/孔)，培养温度为37℃，5％的二氧化碳培养环境。培养24小时后,丢弃培养基。在ECA-109细胞中加入100μL的MDDCs+CIK细胞(5×105细胞/毫升)。ECA-109细胞为贴壁细胞，MDDCs+CIK细胞为悬浮细胞。再培养24h后，丢弃含MDDCs+CIK细胞的上清液，ECA-109细胞仍留在瓶壁，并用PBS洗涤。然后,每个孔内加入110μL Cell Counting Kit-8(CCK8)溶液混合物(Dojindo、日本)(100μL RPMI-1640完全培养基﹢10μL CCK8溶液)，孵育2h。用酶标仪测量450nm处的吸光度。DC诱导的CIK细胞对ECA-109细胞的细胞毒性效应用以下公式进行分析:细胞毒性＝(1-(Ae-Ab)/(Ac-Ab))×100％。在这个公式中，Ae是实验组的吸光度，Ac是控制组的吸光度，Ab是一个空白的孔吸光度。
用PADI4刺激的DC-CIK细胞治疗肿瘤
20只5周BALB/c裸鼠(Vitalriver，北京，中国)注射200μL ECA-109细胞悬液(107细胞/mL在PBS)构建荷瘤的动物模型。裸鼠随机分为两组。如上所述20μg过表达PADI4的ECA-109被反复冻融后刺激DCs。DCs和CIK细胞进行共培养。在裸鼠注射ECA-109细胞后的28天，29天，30天和31天时，注射200μL的DC-CIK细胞(107细胞/mL在PBS中)。如上所述，20μg过表达RFP的ECA-109细胞的裂解物刺激的DC-CIK作为对照。在注射肿瘤细胞后第44天，脱颈处理小鼠。在处死前，用核磁共振成像(MRI)检查肿瘤的形状和体积。用游标卡尺测量肿瘤的直径。肿瘤大小使用以下公式计算：V＝L×S2/2(L:肿瘤长径,S:肿瘤短直径)。用电子天平测量肿瘤的重量
统计分析
数据由双尾的t检验进行分析，当P<0.05时，有显著统计学差异。为了验证结果，每个实验都用三份样本进行了三次实验。
2、试验结果
PADI4表达对DC发育的影响
转染质粒使ECA-109过表达TXNDC5和PADI4。过表达TXNDC5的ECA-109作为非特异性基因的对照，过表达RFP(红色荧光蛋白)的ECA-109作为阴性对照。实时定量荧光PCR(Real-time PCR，qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot，WB)分析TXNDC5、PADI4和RFP的表达水平。结果显示，与阴性对照组相比，转染了PADI4表达质粒的ECA-109细胞组中PADI4在RNA水平和蛋白水平的表达显著增加。(如图7所示)与阴性对照组相比，转染了TXNDC5表达质粒的ECA-109细胞组TXNDC5(Thioredoxin Domain Containing 5)的表达显著增加。
为了验证PADI4表达对于DC细胞表型的影响，将过表达PADI4的ECA-109细胞裂解物(20μg/mL)加入到DC细胞培养体系。孵育24h后，加入TNF-α(500U/mL)，继续培养。流式细胞术(FCM)检测DC细胞表面CD11c、CD40、CD80、CD83和CD86的表达水平。用过表达RFP、TXNDC5或PADI4的ECA-109细胞的裂解物刺激DC细胞后，CD11c+DC细胞各组的比例均为99.9％，表明DC细胞的纯度很高。RFP、TXNDC5和PADI4三组的CD40+DC细胞百分比分别为51.9％、50.1％和61.0％，表明过表达PADI4的ECA-109细胞的裂解物可以提高CD40+DC的比例。RFP、TXNDC5和PADI4三组的CD80+DC细胞百分比分别为98.1％、98.1％和97.9％。RFP、TXNDC5和PADI4三组的CD83+DC细胞百分比分别为64.2％,66.8％和66.0％。RFP、TXNDC5和PADI4三组的CD86+DC细胞百分比分别为99.2％,97.8％和99.0％。以上结果表明PADI4未对CD80+、CD83+和CD86+DC细胞产生显著影响。(结果如图1所示)。
本发明使用过表达TXNDC5的ECA-109细胞作为非特异性对照。TXNDC5在许多肿瘤中都表达升高，在肿瘤的形成中发挥着重要的作用。然而，过表达的TXNDC5没有明显促进DC成熟、CIK细胞增殖或CIK细胞毒性。这些结果表明PADI4作为肿瘤标志物特异性的增强了DC-CIK细胞的细胞毒性。这也证实了是ECA-109细胞上的PADI4而不是其他蛋白提高了食管癌的治疗效率。
PADI4表达对CIK细胞发育和细胞毒性的影响。
为了检测PADI4的表达对DC-诱导CIK细胞发育的影响，将负载ECA-109细胞裂解物的DC细胞与CIK细胞共培养。流式细胞术检测CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+CIK细胞的比例。当CIK细胞与负载过表达RFP的ECA-109细胞裂解物的DC细胞共培养时，CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+CIK细胞的比例分别是：12.2％，84.1％和39.37％。当CIK细胞与负载过表达TXNDC5的ECA-109细胞裂解物的DC细胞共培养时，CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+CIK细胞的比例分别是：13.3％，82.8％和39.37％。当CIK细胞与负载过表达PADI4的ECA-109细胞裂解物的DC细胞共培养时，CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+CIK细胞的比例分别是：14.3％，82.5％和39.37％。以上结果表明，与两个对照组相比，过表达PADI4的ECA-109细胞裂解物并未显著影响CIK细胞的表型(如图8所示)。
与DC细胞共培养后，统计CIK细胞的数量，台盼蓝染色分析细胞生存能力。与负载过表达RFP的ECA-109细胞裂解物的DC细胞共培养后，CIK细胞数量为：5.26×107。与负载过表达TXNDC5的ECA-109细胞裂解物的DC细胞共培养后，CIK细胞数量为：5.44×107。与负载过表达PADI4的ECA-109细胞裂解物的DC细胞共培养后，CIK细胞数量为：8.06×107。以上结果表明，与非特异性对照组和阴性对照组相比，过表达PADI4的ECA-109细胞组可以显著增加CIK细胞的增殖(如图2a所示)。台盼蓝染色法检测细胞生存能力。与负载过表达RFP的ECA-109细胞裂解物的DC细胞共培养后，CIK细胞生存比例为98.03％。与负载过表达TXNDC5的ECA-109细胞裂解物的DC细胞共培养后，CIK细胞生存比例为97.87％。与负载过表达TXNDC5的ECA-109细胞裂解物的DC细胞共培养后，CIK细胞生存比例为97.5％。以上结果表明，与两个对照组相比，过表达PADI4的ECA-109细胞裂解物并未显著影响CIK细胞的生存能力(如图2b所示)。以上结果表明，过表达PADI4的ECA-109细胞可以促进DC细胞-诱导的CIK细胞的增殖，但对CIK细胞的表型和生存能力无显著的影响。
为了检测PADI4的表达对DC-诱导CIK细胞体外毒性的影响，将负载ECA-109细胞裂解物的DCs与CIK细胞共培养。用CCK8检测DC-CIK细胞对ECA-109细胞的毒性作用。负载过表达RFP的ECA-109细胞的裂解物DC-CIK细胞作为阴性对照组。负载过表达TXNDC5的ECA-109细胞的裂解物DC-CIK细胞作为非特异性对照组。RFP、TXNDC5和PADI4各组组DC-CIK对ECA-109细胞的细胞毒作用分别为：80.96％，80.36％和90.69％。以上结果表明，过表达PADI4的ECA-109细胞可以显著提高DC-CIK细胞对ECA-109细胞的细胞毒作用(如图2c所示)。
PADI4诱导-DC-CIK细胞对荷瘤小鼠治疗效率的影响。
为了检测PADI4诱导-DC-CIK细胞对荷瘤小鼠治疗效率的影响，先用ECA-109细胞构建裸鼠成瘤模型，然后用过表达RFP或PADI4的ECA-109细胞的裂解物分别诱导DC-CIK细胞，将细胞分别注射到荷瘤裸鼠体内，44天后，磁共振成像(MRI)检测肿瘤形状和大小的变化。RFP诱导-DC-CIK细胞组老鼠的平均瘤体积为1204mm3而PADI4诱导组的平均老鼠的平均瘤体积为980mm3。在注射治疗后的28、32、36、40和44天分别用游标卡尺检测肿瘤总体积的变化。结果显示：与对照组相比，过表达PADI4的ECA-109细胞可以显著提高DC-CIK的对于荷载ECA-109细胞瘤裸鼠的治疗效率(如图3所示)。
重组PADI4对DC细胞发育的影响
将PADI4插入pGEx-4T1质粒，并在大肠杆菌BL21中表达、扩增。PADI4蛋白以分泌形式表达，并使用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化。重组的PADI4利用蛋白酶K消化(d-rPADI4)。SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色显示蛋白酶K消化成功(如图9所示)。
在本发明中，rPADI4用于负载DC细胞。为了测定PADI4的表达对于DC细胞表型的影响，将d-rPADI4(作为阴性对照)或rPADI4(20μg/mL)加到DC细胞的培养体系中。孵育24h后，加入TNF-α(500U/mL)，继续培养。流式细胞术(FCM)检测DC细胞表面CD11c、CD40、CD80、CD83和CD86的表达水平。两组CD11c+DC细胞的比例均为99.9％，表明DC细胞的纯度很高。负载d-rPADI4和rPADI4的DC细胞组中CD40+DC细胞的比例分别为41.5％和87.9％。负载d-rPADI4和rPADI4的DC细胞组中CD80+DC细胞的比例分别为92.7％和98.5％。负载d-rPADI4和rPADI4的DC细胞组中CD83+DC细胞的比例分别为57.7％和75.5％。负载d-rPADI4和rPADI4的DC细胞组中CD83+DC细胞的比例分别为87.7％和94.5％。以上结果表明PADI4可显著提高CD40+、CD80+、CD83+和CD86+DC细胞的比例(结果如图4所示)。
测定重组PADI4对CIK细胞发育和细胞毒性的影响
为了检测rPADI4对DC-诱导CIK细胞发育的影响，将负载rPADI4的DC细胞与CIK细胞共培养。流式细胞术检测CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+CIK细胞的比例。负载d-rPADI4的DC细胞与CIK细胞共培养作为对照组。当CIK细胞与负载rPADI4的DC细胞共培养时，CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+CIK细胞的比例分别是：13.3％，82.5％和10.4％。对照组中各细胞的比例分别为：11.3％，82.8％和11.8％。以上结果表明，与对照组相比，rPADI4并未显著影响CIK细胞的表型(如图10所示)。
与DC细胞共培养后，统计CIK细胞的数量，台盼蓝染色分析细胞生存能力。与负载d-rPADI4的DC细胞共培养后，CIK细胞数量为：3.22×107。与负载rPADI4的DC细胞共培养后CIK细胞数量为：4.84×107。以上结果表明，rPADI4能促进CIK细胞增殖(如图5a所示)。当CIK细胞与负载d-rPADI4的DC细胞共培养时，细胞生存能力是97.33％。当CIK细胞与负载rPADI4的DC细胞共培养时，细胞生存能力是97.8％。以上结果表明,rPADI4能促进DC-诱导的CIK细胞增殖，但对CIK细胞生存能力无显著影响(如图5b所示)。
为了检测PADI4对DC-诱导CIK细胞体外毒性的影响，将负载rPADI4的DC细胞与CIK细胞共培养。负载d-rPADI4的DC-CIK细胞作为对照组。rPADI4诱导的DC-CIK细胞细胞毒性为88.8％，而对照组为77.3％。以上结果表明，rPADI4可以显著提高DC-CIK细胞对ECA-109细胞的细胞毒作用(如图5c所示)。
rPADI4诱导-DC-CIK细胞对荷瘤小鼠治疗效率的影响。
为了检测PADI4诱导-DC-CIK细胞对荷瘤小鼠治疗效率的影响，先用ECA-109细胞构建裸鼠成瘤模型，然后分别用rPADI4或d-rPADI4(对照组)诱导DC-CIK细胞，将细胞分别注射到荷瘤裸鼠体内，44天后，磁共振成像(MRI)检测肿瘤形状和大小的变化。d-rPADI4诱导-DC-CIK细胞组老鼠的平均瘤体积为1343mm3而rPADI4诱导组的平均老鼠的平均瘤体积为873mm3。在注射治疗后的28、32、36、40和44天分别用游标卡尺检测肿瘤总体积的变化。结果显示：与对照组相比，rPADI4可以显著提高DC-CIK的对于荷载ECA-109细胞瘤裸鼠的治疗效率(如图6所示)。
综上，在体外实验和动物模型实验中，PADI4蛋白可以明显促进DC成熟、CIK细胞增殖和细胞毒性，PADI4刺激的DC-CIK细胞显著抑制肿瘤生长。这些结果表明PADI4通过促进DC成熟与CIK细胞增殖和细胞毒性作用对肿瘤生长产生影响。PADI4可能成为增强细胞免疫治疗(基于DC细胞)的强吸引力的目标抗原。
SEQUENCE LISTING
<110> 常晓天
<120> PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物及应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
tactcagaat tcatggccca ggggacattg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
tactcaggcg cgccgagggc accatgtcca 30
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
tactcaggat cccatggaag atgccaaa 28
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
tactcaggcg cgccgaaagt tcgtctttcg c 31
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
tactcagaat tcatggccca ggggacattg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 6
tactcagtcg actcagggca ccatgttcca 30

Claims (13)

1.一种PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物，所述细胞组合物是由有效剂量的DC-CIK细胞和PADI4蛋白组成，或者由有效剂量的DC-CIK细胞和高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物组成。
2.根据权利要求1所述的PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物，其特征在于，所述PADI4蛋白为重组表达PADI4蛋白。
3.如权利要求2所述的PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物，其特征在于，所述PADI4蛋白为PADI4的原核表达蛋白。
4.根据权利要求1所述的PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物，其特征在于，高表达PADI4的肿瘤细胞为通过基因工程手段使得PADI4基因在肿瘤细胞细中过表达的肿瘤细胞系。
5.权利要求1-4任一项所述PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物的制备方法，其特征在于，PADI4蛋白或高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物先与DCs共培养，负载PADI4后的DC再与CIK细胞共培养，获得PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，PADI4蛋白或高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物先与DCs共培养24h及以上促进DCs成熟。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，负载PADI4后的DC与CIK细胞共培养6天及以上。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，PADI4蛋白或高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物和DCs共培养进行PADI4的负载过程中，PADI4蛋白与DC的比例为20μg/106个细胞的浓度。
9.权利要求1-4任一项所述的PADI4刺激的DC-CIK细胞组合物在制备治疗癌症或延缓癌症进展的免疫药物中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述癌症为适于DC-CIK治疗的癌症类型。
11.根据权利要求10所述应用，其特征在于，所述癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、食管癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、宫颈鳞状细胞癌、胃癌、肺癌、卵巢浆液性乳头状腺癌或甲状腺乳头状癌。
12.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述癌症处于中晚期阶段。
13.PADI4用于制备促进DC成熟和促进CIK细胞增殖和细胞毒性的试剂中的用途，所述试剂为PADI4蛋白或高表达PADI4的肿瘤细胞的细胞裂解物。
CN201710756393.2A 2017-08-29 2017-08-29 Padi4刺激的dc-cik细胞组合物及应用 Active CN107475193B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710756393.2A CN107475193B (zh) 2017-08-29 2017-08-29 Padi4刺激的dc-cik细胞组合物及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710756393.2A CN107475193B (zh) 2017-08-29 2017-08-29 Padi4刺激的dc-cik细胞组合物及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107475193A CN107475193A (zh) 2017-12-15
CN107475193B true CN107475193B (zh) 2020-04-24

Family

ID=60602701

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710756393.2A Active CN107475193B (zh) 2017-08-29 2017-08-29 Padi4刺激的dc-cik细胞组合物及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107475193B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109371005B (zh) * 2018-11-12 2022-09-30 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种hla-0201限制性padi4表位多肽及其应用
CN109568585B (zh) * 2018-12-29 2021-04-23 常晓天 Cd38抑制剂在制备抗类风湿关节炎药物中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101107773A (zh) * 2005-12-14 2008-01-16 罗姆股份有限公司 自激式直流/直流转换器的控制电路和使用了它的发光装置及电子设备
WO2015199402A1 (ko) * 2014-06-23 2015-12-30 제이더블유크레아젠 주식회사 특정 유전자 발현이 증가된 수지상세포의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 수지상세포를 포함하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 조성물

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100595281C (zh) * 2005-07-18 2010-03-24 山东省医药生物技术研究中心 一种腺癌标志物及其应用
CN105087488A (zh) * 2015-09-15 2015-11-25 上海麦禾生物科技有限公司 一种肿瘤抗原诱导的dc-cik细胞的制备方法及应用
CN106978397A (zh) * 2016-01-18 2017-07-25 上海宇研生物技术有限公司 一种人dc-cik免疫活性细胞及其制备方法
CN106890330B (zh) * 2017-02-20 2018-09-28 夏建川 Dc-cik细胞和抗pd-1抗体组合物及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101107773A (zh) * 2005-12-14 2008-01-16 罗姆股份有限公司 自激式直流/直流转换器的控制电路和使用了它的发光装置及电子设备
WO2015199402A1 (ko) * 2014-06-23 2015-12-30 제이더블유크레아젠 주식회사 특정 유전자 발현이 증가된 수지상세포의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 수지상세포를 포함하는 자가면역질환 치료 또는 예방용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
CN107475193A (zh) 2017-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210062218A1 (en) Plasmid constructs for heterologous protein expression and methods of use
JP7270253B2 (ja) ナチュラルキラー細胞のエクスビボ拡大及び活性化のための刺激細胞株
US20040076622A1 (en) Local production and/or delivery of anti-cancer agents by stromal cell precursors
US9107878B2 (en) Methods of treating cancer
Zhang et al. Experimental therapy for lung cancer: umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-mediated interleukin-24 delivery
US20060165668A1 (en) Genetically modified tumor cells as cancer vaccines
KR20180094883A (ko) 대식세포 분화 및 면역의 변형 방법
US20200123566A1 (en) Multigene construct for immune-modulatory protein expression and methods of use
CN107475193B (zh) Padi4刺激的dc-cik细胞组合物及应用
JP2021526842A (ja) Ｉ型インターフェロン及びｃｄ４０−配位子を用いる腫瘍溶解性ウイルス又は抗原提示細胞媒介性癌治療
KR20120119538A (ko) 폴로-유사 키나아제 1의 종양항원 단백질 또는 유전자
CN110157686B (zh) 一种免疫检查点激活免疫共刺激的复制型溶瘤腺病毒及其构建方法和应用
US20220040328A1 (en) Multigene construct for immune-modulatory protein expression and methods of use
CN114729320B (zh) 用于将细胞重新程序化为能够呈递抗原的树突细胞2型的组合物、方法及其用途
Zhang et al. Inactivated Sendai virus suppresses murine melanoma growth by inducing host immune responses and down-regulating β-catenin expression
JP2023082128A (ja) 腫瘍性疾患を治療する方法
CN111278968A (zh) 肿瘤杀伤细胞
Bontkes et al. Antigen gene transfer to human plasmacytoid dendritic cells using recombinant adenovirus and vaccinia virus vectors
WO2024216669A1 (zh) 具有多种免疫调节因子的增强型溶瘤病毒及其制备方法和应用
CN116836283B (zh) 具有多种免疫调节因子的增强型溶瘤病毒及其制备方法和应用
CN115779097B (zh) 基于工程化线粒体的肿瘤抗原递送系统及应用
KR100982186B1 (ko) 신규한 종양 항원 단백질 ａｇｒ２ 및 이의 종양 항원성 펩티드
KR101203979B1 (ko) Ｒｎａ 전이 항원 제시 세포를 이용한 신규 종양항원의 규명 방법
CN115976109A (zh) 一种靶向降解gbp蛋白的hsv-1溶瘤病毒及其制备与应用
CN117417894A (zh) 敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因的肿瘤浸润淋巴细胞及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20200723

Address after: 430000, building, B, C and D District, Wuhan hi tech Avenue, East Lake Development Zone, Wuhan, Hubei Province, B1

Patentee after: Pujian Bio (Wuhan) Technology Co.,Ltd.

Address before: 250014, No. ten, No. 18877, Lixia District, Ji'nan City, Shandong Province

Patentee before: Chang Xiaotian

TR01 Transfer of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Composition and application of DC-CIK cells stimulated by PADI4

Effective date of registration: 20210220

Granted publication date: 20200424

Pledgee: Industrial Bank Limited by Share Ltd. Wuhan branch

Pledgor: Pujian Bio (Wuhan) Technology Co.,Ltd.

Registration number: Y2021420000007

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right