CN117417894A - 敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因的肿瘤浸润淋巴细胞及其应用 - Google Patents

敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因的肿瘤浸润淋巴细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了敲除Roquin‑1和/或Regnase‑1基因的肿瘤浸润淋巴细胞及其应用。本发明通过在肿瘤浸润淋巴细胞中敲除Roquin‑1和/或Regnase‑1基因，提高了肿瘤浸润淋巴细胞的增殖能力与抗瘤能力。

Description

敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因的肿瘤浸润淋巴细胞及其 应用
技术领域
本发明涉及细胞治疗领域，特别涉及经修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其应用。
背景技术
细胞治疗是目前肿瘤免疫疗法的热门领域，目前已有多款细胞治疗药品上市，其中最多的一种产品形式为CAR-T细胞，除此之外，如TCR-T、NK、CAR-M以及TIL等疗法也都是众多药企和生物技术公司争相研发的产品。然而，尽管目前CAR-T及TCR-T疗法已经在临床取得一些进展，但是针对实体瘤的疗效还有所缺陷，尤其是在克服肿瘤微环境，促进增殖，减少耗竭，增强肿瘤杀伤持续性等方面还具有非常大的挑战。
肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes,TIL)疗法是一种新型的细胞免疫疗法。这类淋巴细胞一般通过两个主要步骤获得，首先使用含有高浓度白介素-2(Interleukin-2,IL-2)的培养基培养从患者处获取的肿瘤组织碎片，使T细胞爬出肿瘤组织，从而获得少量TIL；然后与人源PBMC滋养层细胞共培养，使TIL大量扩增，从而获取足够临床使用的TIL。这类细胞因为具有天然的归巢能力，可以很好地浸润到肿瘤组织中。
相对于CAR-T细胞和TCR-T细胞通过表达特异性抗原识别结构域，仅可识别单一或固定的两到三个抗原，TIL可依靠T细胞表面受体同时识别多个抗原，可以有效克服肿瘤异质性引起的药效不足问题，减少肿瘤抗原逃逸。此外，CAR-T疗法和TCR-T疗法一般通过分离患者外周血的T细胞，然后通过病毒转导获得经改造CAR-T细胞和TCR-T细胞，而TIL是从肿瘤组织中直接分离的T细胞，该类群T细胞可以很好地识别肿瘤抗原，同时具有更好的归巢和浸润能力。在疗效和安全性方面，从目前的临床报道来看，CAR-T针对实体瘤的效果较差，容易引起复发，且易发生包括细胞因子释放综合征和神经毒性在内的严重不良事件，而TIL针对实体瘤的疗效整体较好，目前也暂无严重不良事件的报道，由于TIL大多使用非病毒载体进行改造，由病毒载体所引起的安全风险较低。
RNA结合蛋白(RBP)是一类尚未被充分研究的免疫调节剂。具体来说，Regnase-1和Roquin-1是作为负免疫调节剂的RBP，用于协调炎症基因表达的微调和限制。研究表明，Regnase-1敲除可增强小鼠OT-1细胞、Pmel TCR-T细胞和CD19-CAR CD8+T细胞的功能(Weiet al.(2019)Nature.576(7787):471-476)。敲除Regnase-1、Roquin-1和-2或所有三个基因会增加受PMA和离子霉素非生理刺激刺激的人Jurkat T细胞中IL-2和干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)mRNA的表达，从而绕过TCR复合物(Cui等人(2017)，《免疫学杂志》，199:4066-4077)。现有专利(WO2023070080A1)也涉及敲除Regnase-1和/或Roquin-1以增强CAR-T细胞活性，但不涉及TIL细胞的治疗。
使用过继转移性TIL治疗大体积、难治性肿瘤是一种治疗预后不良患者的有效方法(Gattinoni等，Nat.Rev.I mmunol.，2006，6，383-393)。成功的免疫治疗需要大量的TIL，商业化需要稳健可靠的方法。因此，本领域仍然需要改进的TIL细胞疗法。
发明内容
本发明以肿瘤浸润淋巴细胞作为研究模型，从受试者组织中获取卵巢癌样本，并通过体外培养获得了一定量TIL，再使用CRISPR-Cas9技术敲除了TIL中的Roquin-1和/或Regnase-1基因，观察到敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因可促进TIL增殖和细胞因子的分泌，且在体外扩增过程中对IL-2的依赖显著降低。
进一步地，本发明通过P815细胞及肿瘤原代细胞系体外杀伤模型也证明了敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因的TIL对肿瘤细胞具有更好的杀伤效果。此外，发明人还发现，Roquin-1和/或Regnase-1敲除可以促进TIL亚群中中央记忆T细胞(central memory Tcell,TCM)的增加，提示该基因修饰的TIL在体内可能具有更好的抗瘤持续性。
因此，本发明旨在揭示一种新的TIL调控靶点组合Roquin-1及Regnase-1基因。经修饰的TIL具有更好的增殖能力和抗肿瘤活性，可以很好地解决CAR-T和TCR-T在对抗实体瘤过程中易耗竭，难持续，易复发等问题，为广大患者提供一个更好的免疫治疗产品。
具体地，本发明第一方面提供了一种经修饰的肿瘤浸润淋巴细胞。
本发明提供的经修饰的TIL不含Roquin-1基因和/或Regnase-1基因，或所述经修饰的TIL的Roquin-1基因产物和/或Regnase-1基因产物的生物学功能被降低或清除。
所述Roquin-1基因也称Rc3h1基因，在人基因组中的基因ID为149041(2023年8月18日更新)；所述Regnase-1基因也称Zc3h12a基因，在人基因组中的基因ID为80149(2023年8月18日更新)。
在一些实施方案中，与未修饰或对照TIL相比，上述TIL的Roquin-1和/或Regnase-1基因或其基因产物的表达和/或功能被分别降低了至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。
在一些实施方案中，与未修饰或对照TIL相比，上述TIL的性质获得改善。
在一些实施方案中，上述改善的TIL性质包含选自以下组的一种或多种：TIL细胞增殖能力提高、细胞因子分泌能力提高、颗粒酶分泌能力提高、中央记忆T细胞(CentralMemory T cell,TCM)比例提高、IL-2依赖降低、肿瘤细胞杀伤能力提高。
本发明另一方面提供了一种制备上述经修饰的TIL的方法，包括采用基因编辑技术、RNA干扰技术、PROTAC技术、抗体或小分子抑制剂处理所述TIL中的Roquin-1基因和Regnase-1基因。
在一些实施方案中，所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas技术、转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术、锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)技术、单或者多碱基突变、先导编辑或定点敲入。
在一些实施方案中，其中所述Cas类型包括：Cas9、Cas12a、Cas3、Cas13、Cas14、Cas7、Cas8、Cas10和Cas11。
在一些实施方案中，其中所述Cas9类型包括：SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9、cpf1。
在一些优选的实施方案中，其中Roquin-1和/或Regnase-1基因通过CRISPR/Cas的方法被破坏和/或敲除。
在一些优选的实施方案中，其中Roquin-1和/或Regnase-1基因通过CRISPR/Cas9的方法被破坏和/或敲除。
在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9技术包含向上述TIL中引入同时含有靶向目标基因的单链指导RNA(sgRNA)及Cas9核酸酶的CRISPR/Cas9体系。
在一些实施方案中，其中所述sgRNA包括靶向Roquin-1基因的sgRNA和靶向Regnase-1基因的sgRNA。
在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9技术可分别或同时使用靶向Roquin-1基因的sgRNA和靶向Regnase-1基因的sgRNA。
本发明提供了将定点修饰多肽定向至具体靶核酸序列的指导RNA(gRNA)。gRNA包含核酸靶向区段和蛋白质结合区段。gRNA的核酸靶向区段包含与靶核酸序列中的序列互补的核苷酸序列。因此，gRNA的核酸靶向区段经由杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用，并且核酸靶向区段的核苷酸序列确定gRNA将结合的靶核酸内的位置。gRNA的核酸靶向区段可以被修饰(例如，通过遗传工程)以与靶核酸序列内的任何所需序列杂交。
指导RNA的蛋白结合区段与定点修饰多肽(例如，Cas蛋白)相互作用以形成复合物。指导RNA通过上述核酸靶向区段将结合的多肽指导至靶核酸内的特定核苷酸序列。指导RNA的蛋白结合区段包含两个核苷酸片段，它们彼此互补并形成双链RNA双链体。
在一些实施方案中，gRNA包含两个单独的RNA分子。在此类实施方案中，两个RNA分子中的每一个都包含一段彼此互补的核苷酸，使得两个RNA分子的互补核苷酸杂交以形成蛋白质结合区段的双链RNA双链体。在一些实施方案中，gRNA包含单链RNA分子(sgRNA)，其上述两个RNA分子中形成互补区域的序列末端相连接，形成sgRNA。
gRNA对靶基因座的特异性由核酸结合区段的序列介导，所述核酸结合区段包含与靶基因座内的靶核酸序列互补的20个核苷酸。
在一些实施方案中，本发明提供靶向Roquin-1基因的sgRNA，其中靶向序列为CCTGAATAAACTCCACCGCA(SEQ ID NO:1)或者与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％、95％同一性的序列；靶向Regnase-1基因的sgRNA的靶向序列为GTGGACTTCTTCCGGAAGCT(SEQ ID NO:2)或者与SEQ ID NO:2具有至少85％、90％、95％同一性的序列。
在一些实施方案中，其中采用化学转染法、电穿孔法或载体递送法将Cas9-sgRNARNP复合物或含有Cas9蛋白及sgRNA表达元件的载体引入上述TIL中。
上述载体递送法包括使用病毒载体、类病毒载体或非病毒载体进行递送，所述病毒载体包括但不限于基于以下的病毒载体：痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒、和衍生自逆转录病毒的载体，例如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)等。合适的非病毒载体选自质粒、转座子、脂质纳米颗粒、脂质体、外泌体、减毒细菌或病毒样颗粒。
在一些优选的实施方案中，采用电穿孔法将Cas9-sgRNARNP复合物引入上述TIL中。
本发明另一方面提供了一种生产上述经修饰的TIL的方法，包括以下步骤：
(1)将从受试者处获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，获得TIL群；
(2)在含有T细胞生长因子的培养基中体外扩增所获得的TIL群，得到Pre-rep TIL群；
(3)使用上述任一个实施方案所述制备方法处理Pre-rep TIL群，并在含有滋养层细胞的培养基中进行扩大培养，使Roquin-1和/或Regnase-1基因的表达和/或功能被降低或清除。
在一些实施方案中，上述T细胞生长因子选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21中的一种或多种，优选IL-2。
在一些实施方案中，上述步骤(2)中所述T细胞生长因子终浓度约为750-6000IU/mL，优选6000IU/mL。
在一些实施方案中，上述步骤(3)中所述T细胞生长因子终浓度约为750-6000IU/mL，优选3000IU/mL。
在一些实施方案中，上述TIL可用于受试者的自体TIL治疗。
本发明另一方面提供了一种药物组合物，其包含上述任一个实施方案所述TIL或经上述任一个实施方案所述方法处理的TIL以及任选地药学上可接受的载体。
本发明另一方面提供了上述任一个实施方案所述TIL或经上述任一个实施方案所述方法处理的TIL或上述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
在一些实施方案中，其中所述肿瘤为实体瘤。
在一些优选的实施方案中，其中所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌和肾癌。
本发明另一方面提供了一种在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用上述任一个实施方案所述TIL或经上述任一个实施方案所述方法处理的TIL或上述的药物组合物。
在一些实施方案中，其中所述肿瘤为实体瘤。
在一些优选的实施方案中，其中所述肿瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌和肾癌。
本发明另一方面提供了一种降低或清除TIL中Roquin-1和/或Regnase-1基因的表达和/或功能的用途，所述用途包括提高TIL细胞增殖能力、提高细胞因子分泌能力、提高颗粒酶分泌能力、提高中央记忆T细胞(Central Memory T cell,TCM)比例、降低IL-2依赖、提高肿瘤细胞杀伤能力。
本发明的实验证明，本发明通过对TIL进行Roquin-1和/或Regnase-1基因的敲除改善了TIL性质，与未经修饰的TIL相比具有一系列优势：
1)可促进TIL细胞增殖，减少TIL在体内的耗竭，起到更好的抗肿瘤作用；
2)可降低TIL扩增过程中对IL-2的依赖，从而减少临床应用过程中对IL-2的使用，进而提高临床安全性并降低成本；
3)可促进TIL亚群中TCM比例增加，从而增加TIL在体内的持续性，减少肿瘤复发，克服CAR-T和TCR-T等疗法在治疗实体瘤中的不足；
4)可促进TIL细胞分泌更多的细胞因子和颗粒酶，具有更好的抗瘤活性。
附图说明
图1：Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除效率检测。
图2：Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除显著促进TIL增殖。数据表示为mean±SEM，n≥2，采用双因素方差分析，ns，p＞0.05；*，p<0.05；**，p<0.01。
图3：Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除显著减低TIL扩增对IL-2的依赖。数据表示为mean±SEM，n≥2，采用双因素方差分析，ns，p＞0.05；*，p<0.05；**，p<0.01。
图4：效靶比为5:1时，Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除显著促进TIL分泌干扰素γ。数据表示为mean±SEM，n≥2，采用双尾非配对T检验，ns，p＞0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图5：效靶比为10:1时，Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除显著促进TIL分泌颗粒酶B。数据表示为mean±SEM，n≥4，采用单因素方差分析，ns，p＞0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图6：不同效靶比下，Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除均可促进TIL对P815细胞的杀伤力。数据表示为mean±SEM，n≥2，采用双尾配对T检验，ns，p＞0.05；*，p<0.05。
图7：效靶比为10:1时，Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除促进TIL对原代卵巢癌细胞的杀伤力。n≥3，采用双因素方差分析，ns，p＞0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。
图8：Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除促进TIL中TCM比例增加。
图9：Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除略微增加TIL中CD4+T细胞比例。
具体实施方式
虽然本发明可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本发明原理的其具体的举例说明性实施方式。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方式。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。
除非在此另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指示物。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和端点之间的所有值。
通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如Sambrook J.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2000)；Abbas等，Cellular and MolecularImmunology，第6版，W.B.Saunders Company(2010)；Harlow and Lane Using Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1998)；Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，John&Sons，Inc.(2002)；和Coligan等，Short Protocols in Protein Science，Wiley，John&Sons，Inc.(2003)。与本文描述的分析化学、合成有机化学和药物和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的术语。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。
定义
为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。
如本文所用，术语“肿瘤浸润淋巴细胞”或者“TIL”指最初作为白细胞获得的细胞群，它们已经离开受试者的血流并迁移至肿瘤。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17CD4+T细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL包括原代TIL和次代TIL。“原代TIL”是从患者组织样品中获得的那些(有时称为“新鲜收获的”)，“次代TIL”是已经扩增或者增殖的任何TIL细胞群，包括但不限于大量TIL(bulk TIL)和扩增的TIL(“REP TIL”或者“post-REP TIL”)。TIL细胞群可以包括经基因修饰(geneticallymodified)的TIL。
如本文所用，术语“Roquin-1”指一种可以编码含有环指结构域和锌指结构域蛋白的基因或该蛋白，该蛋白通过调节基因表达控制T细胞的激活和分化，在适应性免疫反应中起着关键作用。Roquin-1的NCBI的基因ID为149041。本发明中，Roquin-1可以涵盖未加工的Roquin-1、任何形式加工的Roquin-1、Roquin-1的变体或包含Roquin-1的功能活性片段的物质。
如本文所用，术语“Regnase-1”指一种可以编码含有锌指结构域蛋白的基因或该蛋白，可以介导下游信号，在细胞和组织的生长、发育、分化中起关键作用。Regnase-1的NCBI的基因ID为80149。本发明中，Regnase-1可以涵盖未加工的Regnase-1、任何形式加工的Regnase-1、Regnase-1的变体或包含Regnase-1的功能活性片段的物质。
如本文所用，术语“TIL性质”指TIL细胞经过本发明的制备方法修饰后改善的性质。TIL性质的变化可以包含：增加的TIL增殖能力、增加的TIL细胞数量，增加的存续能力，改善的T细胞亚群比例，提高的细胞因子分泌能力，提高的肿瘤细胞杀伤能力，或它们的任何组合。本发明的变化可以是提高或者降低。
如本文所用，术语“TCR-T”指T细胞受体疗法。
如本文所用，术语“CAR-T”指嵌合抗原受体T细胞治疗。
如本文所用，术语“外周血单核细胞”和“PBMC”指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞。优选地，外周血单核细胞是辐照的同种异体外周血单核细胞。PBMC是一种抗原呈递细胞。
如本文所用，术语“RNA干扰”或“RNAi”指由细胞的细胞质中的双链RNA(dsRNA)分子引发的基因表达的RNA依赖性沉默。dsRNA分子减少或抑制靶核酸序列的转录产物积累，从而沉默基因或减少该基因的表达。
如本文所用，术语“ZFN”，即锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases)，其由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成(一般3～4个)，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。研究者可以通过加工改造ZFN的锌指DNA结合域，靶向定位于不同的DNA序列，从而使得ZFN可以结合复杂基因组中的目的序列，并由DNA切割域进行特异性切割。此外，通过将锌指核酸酶技术和胞内DNA修复机制结合起来，研究者还可以自如地在生物体内对基因组进行编辑。目前，在大量植物、果蝇、斑马鱼、蛙、大/小鼠及牛等物种中，ZFN技术已被广泛应用于靶向基因的突变，通过人工修改基因组信息可以产生遗传背景被修改的新物种。该技术在医学领域也具有非常重大的价值，对于疾病的基因治疗有潜在意义，具有非常广泛的应用前景。
如本文所用，术语“TALEN”指转录激活因子样效应因子核酸酶(Transcriptionactivator-like effector nucleases)，是一种新的基因编辑工具。TALE蛋白是一种源自植物致病菌—黄单包杆菌(Xanthomonas)的天然蛋白，其中也含有DNA结合结构域。TALE蛋白中的DNA结合结构域是由一连串33～35个氨基酸组成的重复结构域组成的，其中每一个结构域都能够识别一个碱基。TALE核酸酶的DNA结合特异性主要由两个高度可变的氨基酸决定，科学家们将这两个关键的氨基酸称作重复可变双氨基酸残基位点(repeat-variabledi-residues,RVD)。与锌指结构域一样，这种TALE重复模块也能够串联起来，识别一长串的DNA序列。但是克隆这么一大段TALE蛋白DNA序列识别结构域的重复编码序列也是一个不小的挑战。为了解决这个问题，科学家们也想出了不少的办法，现在就已经有好几种方案能够让科研人员快速地组装出任意搭配的TALE蛋白DNA序列识别结构域。有多个使用了各种组装策略的大规模的、系统性研究项目表明，TALE重复识别模块可以组装在一起，识别任何DNA序列。自2010年正式发明TALEN技术以来，全球范围内多个研究小组利用体外培养细胞、酵母、拟南芥、水稻、果蝇及斑马鱼等多个动植物体系验证了TALEN的特异性切割活性。
如本文所用，术语“CRISPR”是一种细菌免疫系统，今年来被科学家改造为最热门的基因编辑工具。CRISPR(Clusters of Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)技术在2012年由麻省理工学院和加州大学伯克利分校的科学家共同发现，是一种由RNA序列介导的双链DNA内切酶工具。其由两个部分构成，其中之一是100bp左右的sgRNA，用于靶向识别目的双链DNA，另一部分是1369个氨基酸的Cas9蛋白，其可结合sgRNA，并且具有DNA酶活性，人为设计的sgRNA和Cas9蛋白形成复合体后可对目的DNA进行特异性切割，当切割造成错配修复，则导致基因移码而起到敲除目的，当添加一段修复DNA序列，则会进行有目的的编辑。
优选地，通过TALEN、ZFN、RNAi或CRISPR/Cas基因编辑系统敲除Roquin-1和Regnase-1基因获得，其中CRISPR/Cas基因编辑系统包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13和CRISPR/Cas14。在本发明的一个实施例中，采用CRISPR/Cas9系统成功获得敲除Roquin-1和Regnase-1基因的TIL细胞，相较于现有技术，具有更安全、可靠的优点。同样，其他基因编辑技术包括TALEN、ZFN、RNAi方式也具有其优势，也能通过该类基因编辑方式进行免疫细胞中Roquin-1和Regnase-1基因的敲除。而对于CRISPR/Cas基因编辑系统，除了CRISPR/Cas9之外，还可利用类似的CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13和CRISPR/Cas14进行基因编辑，以敲除Roquin-1和Regnase-1基因。
如本文所用，术语“sgRNA”，即单链向导RNA(single guide RNA)，在CRISPR-Cas9技术中用于锚定靶向DNA。
在一些实施方案中，sgRNA设计遵循PAM序列是NGG、靠近CDS区域原则，采用http://crispr.mit.edu、http://zifit.partners.org/ZiFiT/等软件设计。在一些实施方案中，化学修饰的sgRNA在头尾1-10个碱基(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基)具有(i)甲基化修饰；(ii)甲基化修饰同时磷酸化修饰；(iii)能够稳定sgRNA的其它修饰。合成的修饰sgRNA由专业的供应商提供。
如本文所用，术语“RNP”指Cas9:sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物。RNP方式是将Cas9蛋白和sgRNA在体外形成RNP复合体，然后通过电穿孔的方式将RNP送入T细胞中。其优点是：敲除效率高、脱靶率低(Cas9蛋白和sgRNA会在24小时内被T细胞全部降解)。其缺点是：绝对无内毒素的Cas9蛋白不易获得，对试剂和仪器要求都相对较高。
在一些实施方案中，在TIL细胞激活后2-5天采用电穿孔方式将所述Cas9-sgRNARNP复合物导入激活的TIL细胞。
如本文所用，“CD4+细胞”指CD4阳性的细胞，例如可以是T细胞。术语“CD4+细胞”，“CD4阳性细胞”可以同义使用。这些细胞可通过本领域知道的方法来鉴定，例如通过用荧光标记的针对CD4的抗体对细胞染色和使用荧光激活细胞分选。例如，已有的数据可以证明，CD4+细胞比例的提高可以使得细胞群分泌IFN-γ和/或TNF的能力提高，并可以提高T细胞群的促进肿瘤抑制的效果。例如，请见Tay,R.E.,Richardson,E.K.等人(2020).CancerGene Therapy,1-13.但是，本领域缺少一种提高CD4+细胞比例的方法，本申请可以提供一种影响CD4+细胞比例的方法。
如本文所用，术语“中心记忆T细胞”指具有长期记忆性的，并能够接受抗原再刺激的T细胞。中心记忆T细胞可以具有CD45RA-CCR7+的表型，例如可以是通过CD45RA-和CCR7+来鉴定中心记忆T细胞。中心记忆T细胞可以相比普通T细胞具有更强的抗肿瘤生长的能力。
如本文所用，术语“实体瘤”指通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。术语实体瘤癌症指恶性、肿瘤性或癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、和肾癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和支持的基质细胞(癌细胞分散在其中并且可以提供支持的微环境)。
如本文所用，术语“有效量”或者“治疗有效量”指如本文所述的化合物或者化合物组合的量足够实现预期应用，包括但不限于疾病治疗。治疗有效量可根据预期应用(体外或者体内)或者所治疗的受试者和疾病状况(例如受试者的体重、年龄和性别)、疾病状况的严重程度或者施用方式而变化。该术语还适用于会在靶细胞中诱导特定应答(例如血小板粘附和/或细胞迁移的减少)的剂量。具体剂量将取决于所选择的具体化合物、要遵循的施用方案、化合物是否与其他化合物联合施用、施用时间、施用组织以及携带化合物的物理递送系统。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等指获得所需的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良反应而言，该作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”包括哺乳动物，特别是人类中疾病的任何治疗，包括：(a)在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中防止疾病发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展或进展；以及(c)缓解疾病，即引起疾病消退和/或缓解一种以上疾病症状。“治疗”还意味着包括递送药剂以提供药理学作用，即使在没有疾病或病症的情况下也是如此。例如，“治疗”包括递送可在没有疾病的情况下引发免疫应答或赋予免疫力的组合物，例如在疫苗的情况下。
如本文所用，术语“受试者”可以是患有例如癌症的人或非人动物，优选人。
如本文所用，术语“自体”指源自同一个体的任何材料例如，TIL，所述材料后来例如，在治疗期间被重新引入所述个体。
如本文所用，术语“药物组合物”指一种制备物，本发明的制备物可以允许有效成分的生物活性有效，并且可以不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。这类制剂是无菌的。“可药用的”赋形剂(载体、添加物)是可以合理地施用至受试者以提供有效剂量的所用有效成分的那些赋形剂。
如本文所用，术语“药学上可接受”指媒介物、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。
术语“药学上可接受的载体”或者“药学上可接受的赋形剂”旨在包括任何和所有的溶剂、分散培养基、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，以及惰性成分，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited byGennaro AR，第19版，Pennsylvania:Mack Publishing Company，1995)。此种药学上可接受的载体或者药学上可接受的赋形剂对活性药物成分的用途是本领域熟知的。除非任何常规的药学上可接受的载体或者药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则可预期其在本发明的治疗组合物中的应用。其他活性药物成分(例如其他药物)也可以掺入所述组合物和方法中。
实施例
通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为本发明保护的范围。下述实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例并不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因的肿瘤浸润淋巴细胞的制备
培养基配制
50mL细胞培养基按下表所示成分配制：
表1：培养基成分
冻存培养基：75％CS10细胞冻存液(Biolife solutions,210102)、2％人血清白蛋白(瑞士杰特贝林，S20170005)、100IU/mL重组人白介素-2注射液(双鹭药业，S20040008)、生理盐水。
TIL的分离与扩增
1.从卵巢癌病人中分离得到肿瘤组织；组织来源于上海仁济医院或上海市第一医院。
2.使用PBS清洗肿瘤组织，然后用无菌剪刀将肿瘤组织剪切成大小约3x3x3 mm3的组织块，放置于含有适量TCM-60培养基的6孔板中，每个孔5块。
3.连续培养14天后得到Pre-rep TIL，加入冻存培养基冻存。
TIL细胞中Roquin-1和/或Regnase-1基因的敲除
1.在BCM-2培养基中复苏Pre-rep TIL，复苏过夜后进行基因敲除。
2.将冻干sgRNA(序列如SEQ ID NO:1或2任一项所示)以100μM(100pmol/μL)终浓度重悬于无RNase/DNase的无热原水中。
3.以4.5:1的比例混合NucleofectorTM溶液与Supplement，形成Lonzaelectroporation Buffer P3(Lonza,4XP-3024)，每个反应100μL。室温孵育。
4.将15.0μL Lonza electroporation Buffer P3、9.0μL sgRNA和10.0μL Cas9蛋白(Thermofisher,A36499)放入无菌、无RNase/DNase的离心管中，室温孵育10min，形成RNP混合物。
5.选择Lonza 4D-NucleofectorTM X电转模块中用于T细胞电穿孔的EH115程序。
6.预热T25培养瓶，每瓶含有7.0mL TCM-60培养基。另取适量TCM-0培养基(每个反应800μL)在含有5％CO2的37℃培养箱中预培养。
7.300xg离心复苏的Pre-rep TIL培养物8分钟，弃上清液，将复苏的TIL重悬在DPBS缓冲液中。
8.计数并收集细胞(每个反应5x106个细胞)，将所需数量的细胞300xg离心8分钟，弃上清液。
9.再次使用6.0mL提前预热的DPBS缓冲液重悬细胞，300xg离心8分钟后完全去除上清液。
10.用Lonza electroporation Buffer P3(每次反应70μL)轻轻重悬细胞。
11.将70μL细胞悬液小心地加入RNP混合物中，用移液枪轻轻吹吸2～3次混合。
12.将混合物转移到电极杯中。注意避免井内出现气泡，产生电火花。
13.轻拍电极杯侧壁，确保样品覆盖电极杯底部。若液体没有覆盖整个试管底部，在电转移过程中会报错。
14.将带盖的电极杯放入4D-NucleofectorTM X电转模块中，检查电极杯的正确方向。
15.通过按4D-NucleofectorTM Core Unit核心单元显示器上的“开始”来启动NucleofectionTM程序。
16.运行完成后，立即从固定器中小心取出电极杯，并在每个孔中加入800μL预热的TCM-0培养基，避免移液和混合。于含有5％CO2的37℃培养箱中静置1小时。
17.静置后，将细胞转移到含有7.0mL预热TCM-60培养基的T25瓶中，于含有5％CO2的37℃培养箱中培养。
收获与鉴定敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因的TIL细胞
1.Pre-rep TIL电转48h后取5x104个细胞以1:200的比例与滋养层细胞混合于BCM-2培养基中，静置培养4天。
2.4天后TIL在BCM-3培养基中进行快速扩增，9天后达到培养终点，期间每隔一天重悬细胞记录细胞密度并根据细胞密度调整培养体系保证活细胞密度在(1～3)x106个/mL。
3.培养终点取1x106个以上的细胞提取基因组，用SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:6所示测序引物进行PCR，然后通过一代测序进行基因敲除效率检测。测序实验由金唯智或者金斯瑞生物科技有限公司完成。
4.培养终点的剩余TIL使用冻存培养基冻存，细胞密度为每管2x107个细胞，-80℃程序降温24h后转入液氮罐。
基因敲除结果如图1所示，表明本发明所示sgRNA具有良好的敲除效率。
表2：本实施例所使用sgRNA及测序引物序列
实施例2：敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因促进TIL增殖
取实施例1中与滋养层细胞于BCM-2培养基中静置混合培养4天后的TIL，在BCM-3培养基中进行快速扩增，9天后达到培养终点，期间每隔一天重悬细胞记录细胞密度和细胞活率，并根据细胞密度调整培养体系保证活细胞密度在(1～3)x106个/mL，记录快速扩增期间的细胞扩增倍数。
快速扩增期间的细胞扩增倍数结果如图2所示，其中Ctrl表示未经敲除的对照TIL。可以看出，敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因的TIL细胞扩增倍数显著高于对照组，表明Roquin-1和/或Regnase-1基因的敲除可以促进TIL增殖。
实施例3：敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因降低TIL扩增对IL-2的依赖
复苏实施例1中培养终点冻存的TIL，使用TCM-0培养基继续培养4天，期间每隔一天重悬细胞记录细胞密度和细胞活率，并根据细胞密度调整培养体系保证活细胞密度在(1～3)x106个/mL，计算细胞总数。
结果如图3所示。可以看出，在无IL-2的情况下，敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因的TIL细胞数量显著高于对照组，表明Roquin-1和/或Regnase-1基因的敲除可以降低TIL扩增对IL-2的依赖。
实施例4：敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因可以促进TIL分泌IFN-γ和颗粒酶B(Granzyme B)
复苏实施例1中培养终点冻存的TIL 24h后，按照20:1或10:1或5:1或1:1的效靶比将TIL细胞加入到含有P815-GFP细胞(3x104个/孔)的培养孔中，其中每个孔的培养基都含有0.5μg/mL anti-CD3抗体(OKT3)，共孵育基础培养液为TCM-0，以不含anti-CD3组为对照。共孵育24h后取出细胞培养板，400xg离心5min，收集细胞上清，分别稀释100倍(用于Granzyme B检测)和20倍(用于IFN-γ检测)后按照Human Granzyme B ELISA kit(Invitrogen，BMS2027-2)和Human IFN gamma ELISA kit(Sigma，RAB0222)试剂盒操作说明进行检测。
结果如图4及图5所示。可以看出，在5:1的效靶比下，Roquin-1和Regnase-1基因双敲除的TIL分泌IFN-γ浓度显著高于对照组；在10:1的效靶比下，Regnase-1基因单敲除或Roquin-1和Regnase-1基因双敲除的TIL分泌颗粒酶B浓度显著高于对照组，表明Roquin-1和/或Regnase-1基因的敲除可以促进TIL分泌IFN-γ和颗粒酶B。
实施例5：敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因可以促进TIL对P815细胞的杀伤功能
参照实施例1所述方法对样本RC22来源的TIL进行基因编辑及快速扩增并冻存。复苏该TIL 24h后，以20:1或10:1或5:1的效靶比将TIL细胞加入到含有P815-GFP细胞(3x104个/孔)的培养孔中，其中每个孔的培养基都含有0.5μg/mL anti-CD3抗体(OKT3)，共孵育基础培养液为TCM-0，以不含anti-CD3组为对照。室温静置20min后放置于Incucyte设备中，每4h采集绿色荧光信号，共监测48h，使用Incucyte Basic analysis分析模块分析统计数据。
结果如图6所示。可以看出，Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除的TIL对P815细胞的杀伤率高于对照组，表明Roquin-1和/或Regnase-1基因的敲除可以促进TIL对P815细胞的杀伤功能。
实施例6：敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因可以促进TIL对原代卵巢癌肿瘤细胞的杀伤功能
样本RC22来源的原代卵巢癌肿瘤细胞提前用红色荧光染料CytolightRapid Red Dye(Sartorius Cat.No.4706)7℃标记20min后，以1x104个/孔的密度接种于96孔板备用。
复苏实施例5中冻存的样本RC22来源的TIL，使用SuperView TM 488Caspase-3活细胞分析试剂盒(US Everbright，S6007L)标记TIL，以20:1或10:1或5:1的效靶比与原代卵巢癌肿瘤细胞于TCM-0培养基中共孵育，室温静置20min后放置于Incucyte设备中，每4h采集绿色荧光信号和红色荧光信号，共监测48h，使用Incucyte Basic analysis分析模块分析统计数据。
结果如图7所示。可以看出，Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除的TIL对原代肿瘤细胞的杀伤率高于对照组，表明Roquin-1和/或Regnase-1基因的敲除可以促进TIL对原代肿瘤细胞的杀伤功能。
实施例7：敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因可以促进TIL中央记忆细胞TCM亚群增加
参照实施例1所述方法对TIL进行基因编辑并培养48h，获得Edited Pre-rep TIL。取5x104个Edited Pre-rep TIL，以1：200比例与滋养层细胞混合在含有三种不同浓度IL-2(750IU/mL，1500IU/mL，3000IU/mL)的BCM-2培养液中扩增培养4天，7天后更换为含有三种不同浓度IL-2(750IU/mL，1500IU/mL，3000IU/mL)的BCM-3培养液继续培养9天，期间每隔一天重悬细胞记录细胞密度和细胞活率，根据细胞密度调整培养体系保证活细胞密度在(1～3)x106个/mL。培养终点收集1x106个细胞，使用含有2％ FBS的PBS清洗细胞后，4℃孵育抗体30min，抗体见表格7。细胞清洗两次后，使用Miltenyi MACS Quant Analyzer 16全自动多色流式细胞仪检测。
表3：流式抗体信息
图8显示，在不同IL2浓度刺激下，Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除可以增加TCM的比例。提示靶点敲除的TIL可能具有更好的持续性(Role of memory T cell subsetsfor adoptive immunotherapy，Dirk H Busch et al.2016)。其中TEFF表示终末效应T细胞，T表示早期T细胞，TCM表示中央记忆T细胞，TEM表示效应记忆T细胞。
实施例8：敲除Roquin-1和/或Regnase-1基因可略微增加TIL中CD4+细胞的比例
参照实施例1所述方法对TIL进行基因编辑并培养48h，获得Edited Pre-rep TIL。取5x104个Edited Pre-rep TIL，以1:200比例与滋养层细胞混合在BCM-2完全培养液中扩增培养4天，7天后使用BCM-3快速培养液继续培养TIL细胞9天，期间每隔一天重悬细胞记录细胞密度和细胞活率，根据细胞密度调整培养体系保证活细胞密度在(1～3)x106个/mL。培养终点收集1x106个细胞，使用含有2％FBS的PBS清洗细胞后，4℃孵育抗体30min，抗体见表2。细胞清洗两次后，使用Miltenyi MACS Quant Analyzer 16全自动多色流式细胞仪检测。
图9表明，Roquin-1和/或Regnase-1基因敲除可以略微增加TIL中CD4+细胞的比例。提示靶点敲除的TIL可能具有更强的杀伤功能(CD4+T cells in cancer,DanielE.Speiser et al.2023；Revisiting the role of CD4+T cells in cancerimmunotherapy—new insights into old paradigms，Rong En Tay et al.2020；Multiple roles for CD4+T cells in anti-tumor immune responses,Richard Kennedyet al.2008；Adoptive cell therapy with CD4+T helper 1cells and CD8+cytotoxic Tcells enhances complete rejection of an established tumour,leading togeneration of endogenous memory responses to non-targeted tumour epitopes,Kunyu Li,et al.2017)。
应当理解，尽管本发明已根据其优选实施例进行了示例性描述，但不应限于上述实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。具体抗体的选择和应用可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。因此对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的构思和原则之内，还可做出若干简单替换，这些均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (33)

1.一种经修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其中Roquin-1基因或其基因产物的表达和/或功能被降低或清除。
2.一种经修饰的肿瘤浸润淋巴细胞，其中Roquin-1和Regnase-1基因或其基因产物的表达和/或功能被降低或清除。
3.根据权利要求1或2任一项所述经修饰的TIL，与未修饰或对照TIL相比，所述TIL的Roquin-1和/或Regnase-1基因或其基因产物的表达和/或功能被分别降低了至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。
4.根据权利要求1-3任一项所述经修饰的TIL，与未修饰或对照TIL相比，所述TIL的性质获得改善。
5.根据权利要求4所述经修饰的TIL，所述改善的TIL性质包含选自以下组的一种或多种：TIL细胞增殖能力提高、细胞因子分泌能力提高、颗粒酶分泌能力提高、中央记忆T细胞(Central Memory T cell,TCM)比例提高、IL-2依赖降低、肿瘤细胞杀伤能力提高。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述经修饰的TIL的方法，其中Roquin-1和/或Regnase-1基因或其基因产物采用以下处理方式中的一种或多种：基因编辑技术、RNA干扰技术、PROTAC技术、抗体或小分子抑制剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中基因编辑技术采用以下方式中的一种或多种：CRISPR/Cas技术、转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectornuclease,TALEN)技术、锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)技术、单或者多碱基突变、先导编辑或定点敲入。
8.根据权利要求7所述的CRISPR/Cas技术，其中所述Cas类型包括：Cas9、Cas12a、Cas3、Cas13、Cas14、Cas7、Cas8、Cas10和Cas11。
9.根据权利要求8所述的CRISPR/Cas9技术，其中所述Cas9类型包括：SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9和cpf1。
10.根据权利要求6-9任一项所述制备方法，其中Roquin-1和/或Regnase-1基因通过CRISPR/Cas技术被破坏和/或敲除。
11.根据权利要求6-10任一项所述制备方法，其中Roquin-1和/或Regnase-1基因通过CRISPR/Cas9技术被破坏和/或敲除。
12.根据权利要求6-11任一项所述制备方法，其中所述CRISPR/Cas9技术包含向权利要求1-5任一项所述TIL中引入同时含有靶向目标基因的单链指导RNA(sgRNA)及Cas9核酸酶的CRISPR/Cas9体系。
13.根据权利要求6-12任一项所述制备方法，其中所述sgRNA包括靶向Roquin-1基因的sgRNA和靶向Regnase-1基因的sgRNA。
14.根据权利要求6-13任一项所述制备方法，其中所述CRISPR/Cas9技术可分别或同时使用靶向Roquin-1基因的sgRNA和靶向Regnase-1基因的sgRNA。
15.根据权利要求6-14任一项所述制备方法，其中所述靶向Roquin-1基因的sgRNA中的靶向序列为CCTGAATAAACTCCACCGCA(SEQ ID NO:1)或者与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％、95％同一性的序列；所述靶向Regnase-1基因的sgRNA的靶向序列为GTGGACTTCTTCCGGAAGCT(SEQ ID NO:2)或者与SEQ ID NO:2具有至少85％、90％、95％同一性的序列。
16.根据权利要求6-15任一项所述制备方法，其中所述向TIL中引入CRISPR/Cas9体系的方法包括采用化学转染法、电穿孔法或载体递送法将Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物或含有Cas9蛋白及sgRNA表达元件的载体引入权利要求1-5任一项所述TIL。
17.根据权利要求6-16任意一项所述制备方法，其中采用电穿孔法将Cas9-sgRNARNP复合物引入权利要求1-5任一项所述TIL。
18.一种生产权利要求1-5中任一项所述TIL的方法，其包括以下步骤：
(1)将从受试者处获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，获得TIL群；
(2)在含有T细胞生长因子的培养基中体外扩增所获得的TIL群，得到Pre-rep TIL群；
(3)使用权利要求6-17任一项所述制备方法处理Pre-REP TIL群，并在含有T细胞生长因子的培养基中与滋养层细胞共培养，使Roquin-1和/或Regnase-1基因的表达和/或功能被降低或清除。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其中所述T细胞生长因子选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21中的一种或多种。
20.根据权利要求18或19任一项所述的制备方法，其中所述T细胞生长因子为IL-2。
21.根据权利要求18所述的制备方法，其中步骤(2)中所述T细胞生长因子终浓度约为750-6000IU/mL。
22.根据权利要求18所述的制备方法，其中步骤(2)中所述T细胞生长因子终浓度为6000IU/mL。
23.根据权利要求18所述的制备方法，其中步骤(3)中所述T细胞生长因子终浓度约为750-6000IU/mL。
24.根据权利要求18所述的制备方法，其中步骤(3)中所述T细胞生长因子终浓度为3000IU/mL。
25.根据权利要求18所述的制备方法，其中所述TIL对于受试者是自体TIL。
26.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述TIL或经权利要求6-25中任一项所述方法处理的TIL以及任选地药学上可接受的载体。
27.权利要求1-5中任一项所述TIL或经权利要求6-25中任一项所述方法处理的TIL或权利要求26所述药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
28.根据权利要求27所述应用，其中所述肿瘤为实体瘤。
29.根据权利要求27或28任一项所述应用，其中所述实体瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌和肾癌。
30.一种在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求1-5中任一项所述TIL或经权利要求6-25中任一项所述方法处理的TIL或权利要求26所述药物组合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述肿瘤为实体瘤。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述实体瘤选自以下组的一种或多种：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌和肾癌。
33.一种降低或清除TIL中Roquin-1和/或Regnase-1基因的表达和/或功能的用途，所述用途包括提高TIL细胞增殖能力、提高细胞因子分泌能力、提高颗粒酶分泌能力、提高中央记忆T细胞(Central Memory Tcell,TCM)比例、降低IL-2依赖、提高肿瘤细胞杀伤能力；所述TIL为权利要求1-5中任一项所述TIL或经权利要求6-25中任一项所述方法处理的TIL。
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