CN112512593A - 增强过继输注t细胞持久性的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提出了改善T细胞疗效的方法。一方面，本公开进一步提出了增强用于过继细胞转移或治疗(ACT)的T细胞的持久性的方法。透过本公开进一步提出了能够预测过继输注T细胞持久性的细胞因子敏感性测定(CSA)和相关方法。本公开还提出了有此需要受试者的癌症治疗方法以及透过本文描述的方法产生的T细胞群。

Description

增强过继输注T细胞持久性的方法
相关申请的交叉引用
背景
本申请要求2018年3月21日提交的美国临时申请号62/646,180和2018年4月11日提交的德国专利申请10 2018 108 612.1的优先权，各自内容透过引用整体并人本文。
1.技术领域
本公开提出了改善T细胞疗效的方法。一方面，本公开进一步提出了增强用于过继细胞转移或治疗(ACT)的T细胞的持久性的方法。透过本公开进一步提出了能够预测过继输注T细胞持久性的细胞因子敏感性测定(CSA)和相关方法。本公开还提出了有此需要受试者的癌症治疗方法以及透过本文描述的方法产生的T细胞群。
2.技术背景
过继细胞转移或治疗(ACT)是一种免疫疗法，其涉及离体分离和扩增抗原特异性T细胞，以便将该细胞过继转移回患者。尽管ACT在治疗血液恶性病和黑色素瘤中已经获得临床益处，但其在治疗大多数实体瘤中的疗效通常有限，因为转移的T细胞不能发挥作用并无法在体内持续存在。对肿瘤相关抗原(TAA)的耐受性和抑制性肿瘤环境引起的肿瘤特异性T细胞抑制等因素可能导致这种失败。此外，广泛培养肿瘤特异性T细胞以获得足够数量以输注给患者的必要性可极大地影响T细胞的品质。
T细胞持久性被视为是ACT疗效的驱动力，从而将T细胞持久性/年轻表型与临床前和临床结果相关联。共同γ链(γc)-细胞因子IL-2扩增T细胞，以增强培养T细胞并透过细胞因子介导的信号调节表型。高剂量的IL-2也已用于扩增ACT T细胞培养物。T细胞强制表达IL-2会延长体外存活以及维持肿瘤特异性和功能。但是，IL-2可促进T细胞的分化，这可能导致ACT使用存在不利表型。为了优化ACT的离体T细胞培养，根据描述，其他γc-细胞因子(例如：IL-7、IL-15和IL-21)在记忆T细胞形成、增殖和存活中发挥作用，导致T细胞分化程度较低，但仍能够增强抗肿瘤反应。
美国专利7,993,638描述了针对需要癌症治疗受试者的治疗方法，包括给予受试者激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)；给予受试者至少两种影响CTL持久性的细胞因子，包括干扰素-α-2b和白细胞介素-2(IL-2)。
美国专利2015/0017120描述了在接受过继细胞疗法(ACT)的癌症受试者中延长转移细胞持久性、刺激转移细胞增殖或刺激对靶细胞群的T细胞介导免疫反应的方法，包括：给予接受ACT的癌症受试者一种药代动力学延长的IL-2，其用量可有效延长受试者中转移细胞的持久性。
但是，仍然需要改善癌症患者的ACT结果。权利要求中描述的实施方案提供了该技术问题的解决方案。
简要概述
如本文所述，本公开提出了改善T细胞疗效和存活性的方法。
本公开进一步提出了用于产生改善过继免疫疗法疗效的T细胞的方法，包括：
从至少一名健康供体、患者或个体获得T细胞，
激活T细胞，
激活后扩增激活T细胞约3天至约5天，
收集扩增T细胞用于输注至所述至少一名健康供体、患者或个体，
其中，相较于激活后扩增约7天或更长时间的激活T细胞，扩增约3天至约5天的T细胞的过继免疫疗法疗效得到改善。
一方面，本公开提出了增加T细胞生长的方法，包括：
从至少一名健康供体、患者或个体获得T细胞，
激活T细胞，
激活后扩增激活T细胞约3天至约5天，
收集扩增T细胞用于输注至所述至少一名健康供体、患者或个体，
其中，相较于激活后扩增约7天或更长时间的激活T细胞，扩增约3天至约5天的T细胞生长较多。
另一方面，本公开提出了减少过继免疫疗法中所用T细胞的细胞死亡的方法，包括：
从至少一名健康供体、患者或个体获得T细胞，
激活T细胞，
激活后扩增激活T细胞约3天至约5天，
收集扩增T细胞用于输注至所述至少一名健康供体、患者或个体，
其中，相较于激活后扩增约7天或更长时间的激活T细胞，扩增约3天至约5天的T细胞的细胞死亡减少。
本公开进一步提出了一些方法，其中激活T细胞在激活后扩增约4天，并且其中T细胞的过继免疫疗法疗效大于激活后扩增约7天或更长时间的激活T细胞。
本公开进一步提出了一些方法，其中激活T细胞在激活后扩增约3天，并且其中T细胞的过继免疫疗法疗效大于激活后扩增约6天或更长时间的激活T细胞。
本公开进一步提出了用于产生改善过继免疫疗法疗效的T细胞的方法，包括：
从至少一名健康供体、患者或个体获得T细胞，
激活T细胞，
用病毒载体转导激活的T细胞，
激活后扩增转导T细胞约3天至约5天，
收集扩增的转导T细胞用于输注至所述至少一名健康供体、患者或个体，
其中，相较于激活后扩增约7天或更长时间的激活和转导T细胞，扩增约3天至约5天的T细胞的过继免疫疗法疗效得到改善。
一方面，本公开提出了用于产生改善过继免疫疗法疗效的T细胞的方法，包括：
从至少一名健康供体、患者或个体获得T细胞，
激活T细胞，
激活后扩增激活T细胞第一段时间，
收集扩增T细胞用于输注至所述至少一名健康供体、患者或个体，
其中，相较于激活后扩增第二段时间的激活T细胞，扩增第一段时间的T细胞的过继免疫疗法疗效得到改善。
其中，所述第一段时间短于所述第二段时间。
一方面，第一段时间为约2天至约5天，所述第二段时间为约6天至约10天；第一段时间为约3天至约5天，所述第二段时间为约7天至约10天；第一段时间为约2天至约5天，所述第二段时间为约6天至约14天；以及第一段时间小于约6天，所述第二段时间大于约7天。一方面，扩增T细胞为CD4+和/或CD8+T细胞。
另一方面，扩增T细胞表现为幼稚T细胞(TN)和/或干记忆T细胞(Tscm)/T中央记忆(Tcm)表型。
根据其他方面，T细胞被刺激物激活。
另一方面，刺激物包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。
一方面，本文所述的T细胞用于需要癌症治疗患者的过继免疫疗法，其中所述癌症选自肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和子宫癌(UEC)所组成的组。
一方面，本公开提出了评估T细胞存活性的测定法，包括：
从至少一名供体、患者或个体获得T细胞，
激活T细胞，
将激活T细胞的第一部分扩增一段时间，
在存在至少一种细胞因子的情况下培养扩增T细胞，
在培养T细胞中测量细胞因子反应，
确定产生最大细胞因子反应的该段时间，和
使激活T细胞的第二部分扩增产生最大细胞因子反应的该段时间。
本公开进一步提出了产生T细胞的方法，包括：
从至少一名供体、患者或个体获得T细胞，
激活T细胞，
将激活T细胞的第一部分随时间扩增，
在存在至少一种细胞因子的情况下培养扩增T细胞，
在培养T细胞中测量细胞因子反应，
确定产生最大细胞因子反应的一段时间，和
使激活T细胞的第二部分扩增产生最大细胞因子反应的该段时间。
一方面，T细胞获自至少一名健康供体、患者或个体。另一方面，T细胞获自至少一名无癌症供体、患者或个体。
一方面，T细胞对所治疗的患者是同种异体的。另一方面，T细胞对所治疗的患者是自体的。
一方面，本公开提出了在培养之前冷冻激活T细胞的扩增第一部分。
另一方面，本公开提出了在培养之前解冻激活T细胞的冷冻扩增第一部分。
再一方面，本公开提出了在培养之前静置激活T细胞的解冻扩增第一部分。
另一方面，本公开提出了在扩增前用病毒载体或非病毒载体转导激活T细胞。
本文所述的一方面，载体可以为一种病毒载体，例如：表达T细胞受体(TCR)的逆转录病毒载体或表达T细胞受体(TCR)的慢病毒载体或表达TCR的非病毒载体(例如：脂质体)。一方面，T细胞扩增在激活后约1天至约15天、约2天至约14天、约3天至约13天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约6天或约4天至约5天的一段时间内测量。
一方面，所述至少一种细胞因子选自(白细胞介素)IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21及其组合组成的组。
另一方面，IL-2的浓度为约10U/ml至约500U/ml、约10U/ml至约450U/ml、约10U/ml至约400U/ml、约10U/ml至约350U/ml、约10U/ml至约300U/ml、约10U/ml至约250U/ml、约10U/ml至约200U/ml、约10U/ml至约150U/ml、约10U/ml至约100U/ml、约10U/ml至约50U/ml、约20U/ml至约40U/ml、约25U/ml至约35U/ml或约30U/ml至约35U/ml。
另一方面，本文提出的IL-7浓度为0.1ng/ml至50ng/ml、0.1ng/ml至45ng/ml、0.1ng/ml至40ng/ml、0.1ng/ml至35ng/ml、0.1ng/ml至30ng/ml、0.1ng/ml至25ng/ml、0.1ng/ml至20ng/ml、0.1ng/ml至15ng/ml、0.1ng/ml至10ng/ml、0.1ng/ml至5ng/ml、0.1ng/ml至4ng/ml、0.1ng/ml至3ng/ml、0.1ng/ml至2ng/ml、0.1ng/ml至1 ng/ml或0.1ng/ml至0.5ng/ml。
另一方面，IL-15的浓度为0.1ng/ml至50ng/ml、0.1ng/ml至45ng/ml、0.1ng/ml至40ng/ml、0.1ng/ml至35ng/ml、0.1ng/ml至30ng/ml、0.1ng/ml至25ng/ml、0.1ng/ml至20ng/ml、0.1ng/ml至15ng/ml、0.1ng/ml至10ng/ml、0.1ng/ml至5ng/ml、0.1ng/ml至4ng/ml、0.1ng/ml至3ng/ml、0.1ng/ml至2ng/ml、0.1ng/ml至1 ng/ml或0.1ng/ml至0.5ng/ml。
本公开进一步提出了一些方法，其中细胞因子反应选自幼稚T细胞(TN)和/或干记忆T细胞(Tscm)/T中央记忆(Tcm)的增殖增加、细胞凋亡减少、细胞群增加及其组合的一种或多种。一方面，静置步骤在约0.5小时至约48小时、约0.5小时至约36小时、约0.5小时至约24小时、约0.5小时至约18小时、约0.5小时至约12小时、约0.5小时至约6小时、约1小时至约6小时、约2小时至约5小时、约3小时至约5小时、或约1小时至约24小时、约2至约24小时、约12至约48小时、约0.5小时至约120小时、约0.5小时至约108小时、约0.5小时至约96小时、约0.5小时至约84小时、约0.5小时至约72小时或约0.5小时至约60小时的一段时间内进行。
根据本公开，一方面，抗CD3抗体和抗CD28抗体各自的浓度为约0.1μg/ml至约10.0μg/ml、约0.1μg/ml至约8.0μg/ml、约0.1μg/ml至约6.0μg/ml、约0.1μg/ml至约4.0μg/ml、约0.1μg/ml至约2.0μg/ml、约0.1μg/ml至约1.0μg/ml、约0.1μg/ml至约0.8μg/ml、约0.1μg/ml至约0.6μg/ml、约0.1μg/ml至约0.5μg/ml、约0.1μg/ml至约0.25μg/ml、约0.2μg/ml至约0.5μg/ml、约0.2μg/ml至约0.3μg/ml、约0.3μg/ml至约0.5μg/ml、约0.3μg/ml至约0.4μg/ml或约0.4μg/ml至约0.5μg/ml。
另一方面，激活在约1小时至约120小时、约1小时至约108小时、约1小时至约96小时、约1小时至约84小时、约1小时至约72小时、约1小时至约60小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约2小时至约24小时、约4小时至约24小时、约6小时至约24小时、约8小时至约24小时、约10小时至约24小时、约12小时至约24小时、约12小时至约72小时、约24小时至约72小时、约6小时至约48小时、约24小时至约48小时、约6小时至约72小时或约1小时至约12小时的时间段内进行。
一方面，透过本文所述方法获得的T细胞为CD3+CD8+T细胞。
一方面，本公开提出了透过利用本文所述方法和方法步骤评估T细胞存活性的方法。一方面，本文所述方法仅包括体外方法步骤。其他方面，本文所述方法不包括体内方法步骤。再一方面，本文所述方法包括体外和体内进行的方法步骤的组合。
一方面，本文所述方法不包括利用转基因动物(例如，转基因小鼠)进行的分析或评估。再一方面，本文所述方法能够比涉及利用转基因动物(例如，转基因小鼠)的方法更快地确定T细胞产生和/或T细胞存活性的条件。
另一方面，本文所述方法提出了能够用于输注入有需要患者或受试者中的存活T细胞。另一方面，本文所述方法在体外进行且可预测体内结果。其他方面，本公开提出了高通量体外测定方法，其可预测用于输血T细胞的体内存活性。
一方面，本说明书提出了能够预测过继输注T细胞持久性的细胞因子反应(CR)测定和相关方法。一方面，本说明书提出了细胞因子敏感性测定方法，其能够测量体外扩增长度对于对细胞因子反应能力的影响且在不存在持续细胞因子刺激的情况下的存活。
另一方面，本文所述方法可用于透过利用高通量体外方法确定哪些类型的T细胞在体内持续存在。
还提出了包含本文产生和所述的T细胞的药物组合物。另一方面，本文所述的药物组合物包括药用载剂、赋形剂或其盐。
透过本公开进一步提出了透过本文所述方法产生的T细胞群。一方面，T细胞为工程化T细胞。
一方面，本说明书提出了实体瘤中T细胞体内持久性的预测方法，包括：
解冻扩增多个扩增时间的冷冻保存T细胞，
在不存在细胞因子的情况下静置解冻T细胞，
接种静置的T细胞，
培养接种T细胞至少一个周期时间，
其中，在至少一个周期时间开始时，将一种或多种细胞因子加入培养物中，
其中，在至少一个周期时间结束时，所述的一种或多种加入细胞因子被耗尽，
在至少一个周期时间内的多个时间点对培养T细胞进行取样，
测量取样T细胞的细胞因子反应，
从多个扩增时间确定表现出最大细胞因子反应的取样T细胞的扩增时间，和
将扩增确定扩增时间的T细胞配制为用于治疗实体瘤的组合物。
另一方面，多个扩增时间为激活后约1天至约15天、约2天至约14天、约3天至约13天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约6天或约4天至约5天。
另一方面，一个周期时间为每个周期1-10天、每个周期2-10天、每个周期3-10天、每个周期4-10天、每个周期5-10天、每个周期6-10天、每个周期7-10天、每个周期8-10天或每个周期9-10天。
另一方面，所述至少一个周期时间为1个周期时间、2个周期时间、3个周期时间、4个周期时间、5个周期时间、6个周期时间、7个周期时间、8个周期时间、9个周期时间或10个周期时间。
另一方面，实体瘤选自肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)和子宫癌(UEC)所组成的组。
附图简要说明图1显示了T细胞凋亡(例如，再刺激诱导的细胞死亡(RICD)和细胞因子戒断诱导的细胞死亡(CWID))和记忆形成。(Voss et al.，Cancer Letters 408(2017)190-196，其内容在此透过引用整体并人)。
图2显示了在分别透过抑制内在或外在细胞凋亡途径靶向非实体瘤和实体瘤的ACT中的体内T细胞存活模型。
图3显示了分别透过连续杀灭测定或细胞因子敏感性测定方法在靶向非实体瘤和实体瘤的ACT中测试体内T细胞存活的模型。
图4显示了根据本公开一实施方案的细胞因子敏感性测定。
图5A-5D显示了体外扩增期间的Tscm样形成，其特征在于CD45RO(低)和CCR7+。
图6A-6I显示了在测定21天内早期扩增的Tscm保持IL-15细胞因子敏感性。
图7A-7C显示了早期扩增细胞(扩增约4天)显示，与7天和10天扩增相比，细胞生长增加。图下的标签代表细胞因子的使用量。线性二次线拟合用于建立细胞行为的模型。在为期21天内存在10ng/ml IL-7(A)、10ng/ml IL-15(B)或300U/mL IL-2(C)的情况下评估扩增4、7或10天的T细胞，每2-3天取样一次。倍数生长计算为起始T细胞数与指定时间点T细胞数的比率。请注意，每个绘图在Y轴上比例均不同，以便于数据可视化。最佳拟合线由细胞存活的线性二次方程推导出。
图8A-8C显示了T细胞体外扩增时间缩短(扩增约4天)相较于7天和10天扩增与较高细胞因子浓度下的存活增加相关。在存在300U/ml IL-2(A)、10ng/ml IL-7(B)、10ng/mlIL-15(C)的情况下或为期21天内评估扩增4、7或10天的T细胞，每2-3天取样一次。总体存活为倍数生长图的曲线下面积，如图7A-7C所示。每个点代表每个供体的三个技术性重复物，显示总共3个供体。
图8D-8F显示转导T细胞体外扩增时间缩短与较高细胞因子浓度下的存活增加相关。
图9A-9C显示T细胞体外扩增时间缩短与较低细胞因子浓度下的存活增加相关。
图10A-10C显示T细胞体外扩增时间缩短与凋亡减少相关。
图11A-11C显示T细胞体外扩增时间缩短与较高细胞因子浓度下的凋亡减少相关。在为期21天内在存在300U/ml IL-2(A)、10ng/ml IL-7(B)或10ng/ml IL-15(C)的情况下评估扩增4、7或10天的T细胞，每2-3天取样一次。总体细胞凋亡基于测定中第10天前碘化丙啶和膜联蛋白-V染色阳性的淋巴细胞百分比进行计算。每个点代表每个供体的三个技术性重复物，显示总共3个供体。
图12A-12C显示T细胞体外扩增时间缩短与凋亡减少相关。
图13A-13C显示T细胞体外扩增时间缩短与存在(A)IL-7、(B)IL-15和(C)IL-2的情况下细胞分裂增加相关。
图14A-14C显示转导T细胞体外扩增时间缩短与较高细胞因子浓度下的细胞分裂增加相关。在存在300U/ml IL-2(A)、10ng/ml IL-7(B)、10ng/ml IL-15(C)的情况下或为期21天内评估扩增4、7或10天的T细胞，每2-3天取样一次。总体分裂基于淋巴细胞百分比进行计算，其中在测定中第10天前检测到PkH67的可检测稀释。每个点代表每个供体的三个技术性重复物，显示总共3个供体。
图15A-15C显示T细胞体外扩增时间缩短与对(A)IL-7、(B)IL-15和(C)IL-2的敏感性增加相关。
图16A-16C显示转导T细胞体外扩增时间缩短与较高细胞因子浓度下的细胞分裂增加相关。
图16D显示转导T细胞体外扩增时间缩短与CD25表达增加相关。
图17显示IL-2受体(CD25)表达与在存在IL-2的情况下之存活/分裂之间的相关性。
图18显示IL-15受体(CD122)表达与在存在IL-15的情况下之存活/分裂之间的相关性。
图19显示IL-7受体(CD127)表达与在存在IL-7的情况下之存活/分裂之间的相关性。
图20显示T细胞体外扩增时间缩短保留T细胞可能性。(Voss et al.，CancerLetters 408(2017)190-196，其内容在此透过引用整体并人)。
图21A显示细胞记忆区室在第0天以及为期21天的培养期间每7天透过流式细胞术测量一次。Tnaive/scm＝CCR7+CD45RO-、Tcm＝CCR7+CD45RO+、Tem＝CCR7-CD45RO+、Teff＝CCR7-CD45RO-。
图21B显示在培养开始时用PkH增殖染料标记输入细胞，并在培养期间第7天前基于PkH稀释测量不同记忆区室的增殖。
图22显示CD3/CD28 T细胞扩增期间端粒长度连续损失。相对于4个健康供体(D1-D4)的肿瘤细胞系对照细胞，透过荧光原位杂交评估相对端粒长度。每个样本点代表技术性二重复中的一个重复物。供体年龄：D1：50岁、D2：31岁、D3：49岁、D4：45岁。
图23显示端粒酶活性随着CD3/CD28 T细胞扩增延长而降低。端粒酶活性根据T细胞扩增第4天、第7天或第10天所获取细胞的全细胞裂解物透过基于ELISA的比色测定法测量。每个点代表来自总共5个生物学重复物的一个技术性三重复样本。
图24显示了来自三个生物供体D4、D5和D6的CD3/CD28制造期间的T细胞分化。培养代表性PBMC，然后在指定的扩增日透过流式细胞术进行表型分型。基于CD45RO和CCR7表达定义记忆表型，Tnaive/scm＝CD45RO-CCR7+、Tcm＝CD45RO+CCR7+、Tem＝CD45RO+CCR7-、Temra＝CD45RO-CCR7-。
图25显示了来自三个生物供体D1、D7和D8的CD3/CD28制造期间的共刺激损失。T细胞扩增期间第4、7和10天，透过流式细胞术评估CD27和CD28的表达。
图26显示差异基因表达分析将较早扩增细胞之聚簇确定为相较于较晚扩增细胞独特的聚簇。三个生物供体(D4、D5和D6)扩增4、7或10天，然后分离全RNA并发送至Novogene进行RNA测序分析和生物资讯学分析。
图27显示了T细胞制造期间的RNAseq分析。火山图式比较(A)第4天与第7天、(B)第4天与第10天以及(C)第7天与第10天的T细胞制造期间的RNAseq数据。差异表达基因(DEG)截止值设定为向上或向下1倍，padj值小于0.05。每个图的图例中显示DEG的数量。图28显示了T细胞制造期间的京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径分析。左图显示样本之间上调的途径。右图显示样本之间下调的途径。对于每个上调或下调，引用较晚的时间点(即，day_7vs day_4down表示第7天样本与第4天样本相比下调的途径)。
详细说明
如本文所述，本公开提出了改善T细胞疗效和存活性的方法。
在本文所述的一方面，与体外扩增较长时间的T细胞相比，最小扩增的工程化T细胞因幼稚性以及在体内增殖和持续存在的能力增加表现出更高的临床疗效。一方面，相对于约7天至约10天的较长时间表达，最小扩增的工程化T细胞扩增约3天至约5天。
在本文所述的一方面，扩增约3天至约5天较短时间的T细胞透过1)增殖、2)减少细胞凋亡和3)持久性相较于透过相同方法但扩增时间增加至约7天至约10天产生的T细胞表现出细胞因子反应增加。
一方面，过继细胞转移或治疗(ACT)包括一种治疗方法，其中细胞从供体移除、在体外培养和/或操作、并给予患者以治疗疾病。在一些实施方案中，转移的细胞可能为自体细胞，这表示患者充当自己的供体。在一些实施方案中，转移的细胞可能为淋巴细胞(例如，T细胞)。在一些实施方案中，转移的细胞可能在给予患者之前进行基因工程改造。例如，转移的细胞可能被改造以表达对受关注抗原具有特异性的T细胞受体(TCR)。在一实施方案中，转移的细胞可能被改造以表达嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，转移的细胞可能被改造(例如，透过转染或缀合)以表达增强细胞抗肿瘤活性的分子，例如：细胞因子(IL-2、IL-12)、抗细胞凋亡分子(BCL-2、BCL-X)或趋化因子(CXCR2、CCR4、CCR2B)。在某些实施方案中，转移的细胞可能被改造以表达CAR和增强细胞抗肿瘤活性或持久性的分子。
一方面，本公开涉及一些方法，其中过继细胞转移或治疗(ACT)的结果可透过向癌症受试者给予最小扩增的T细胞进行改善。
治疗方法
一方面，本文所述的扩增工程化T细胞可用于治疗与细胞凋亡或分化过程异常相关的疾病(例如，细胞增殖性疾病或细胞分化性疾病，如，癌症)。可适合用本发明的方法治疗的癌症非限制性实例描述如下。
细胞增殖和/或分化疾病的实例可能包括癌症(例如，癌、肉瘤、转移性疾病或造血肿瘤疾病，例如，白血病)。转移性肿瘤可起因于多种原发性肿瘤类型，包括但不限于前列腺癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌和肝癌。因此，本公开的组合物(例如，最小离体扩增的工程化T细胞)可给予患有癌症的患者。
本文所用的术语“癌症”(或“癌性”)、“过度增殖性”和“肿瘤性”可指具有自主生长能力的细胞(即，以快速增殖细胞生长为特征的异常状态或病症)。过度增殖性和肿瘤性疾病状态可归类为病理性的(即，表征或构成疾病状态)，也可归类为非病理性的(即，偏离正常但与疾病状态无关)。这些术语旨在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化细胞、组织或器官(不论组织病理学类型或侵袭性阶段如何)。“病理性过度增殖”细胞可能在以恶性肿瘤生长为特征的疾病状态中发生。非病理性过度增殖细胞的实例可能包括与伤口修复相关的细胞增殖。
术语“癌症”或“肿瘤”可指各种器官系统的恶性肿瘤(包括影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴腺和淋巴组织、胃肠器官和泌尿生殖道的恶性肿瘤)以及指腺癌(通常认为包括恶性肿瘤，例如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌)。关于本发明的方法，癌症可以为任何癌症，包括任何急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、肺泡横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性癌、子宫颈癌、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、腹膜癌、网膜癌、肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、软组织癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌、膀胱癌和消化道癌(例如食道癌、胃癌、胰腺癌、胃癌、小肠癌、胃肠道类癌瘤)、口腔癌、结肠癌和肝胆癌。
术语“癌”是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑色素瘤。代表性癌包括由子宫颈、肺、前列腺、乳房、头颈部、结肠和卵巢组织形成的癌。该术语还可能包括癌肉瘤，其包括由癌性和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”是指源自腺体组织的癌或其中肿瘤细胞形成可识别腺体结构的癌。
增殖性疾病的其他实例可能包括造血肿瘤疾病。本文所用的术语“造血肿瘤疾病”可能包括涉及造血来源增生/肿瘤细胞的疾病，例如，源自骨髓、淋巴或红细胞谱系或其前体细胞。优选地，所述疾病可能起因于分化差的急性白血病(例如，成红细胞白血病和急性巨核细胞白血病)。其他代表性骨髓疾病可能包括但不限于急性早幼粒细胞白血病(APML)、急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML)(综述于Vaickus，L.(1991)Crit.Rev.in Oncol./Hemotol.11：267-97)；淋巴恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴母细胞性白血病(ALL)(其包括B系ALL和T系ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。其他形式的恶性淋巴瘤可能包括但不限于非霍奇金淋巴瘤及其变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、霍奇金病和里德-斯特恩伯格病。
本领域技术人员应当理解，足以减少肿瘤生长和大小的最小扩增的工程化T细胞的量或治疗有效量不仅可能根据所选的特定组合物而且可能根据给药途径、所治疗病症的性质、患者的年龄和状况而有所变化，最终由患者的医生或药剂师自行决定。可提供本发明方法中使用的最小扩增的工程化T细胞的时间长度因个体而不同。本领域技术人员应当理解，本文提及的治疗可扩展至所述癌症和症状的预防和治疗。
术语“T细胞”或“T淋巴细胞”可能包括胸腺细胞、幼稚T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静置T淋巴细胞或激活T淋巴细胞。适用于特定实施方案的示例性T细胞群包括但不限于辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或其他任何T细胞亚群。适用于特定实施方案的其他示例性T细胞群包括但不限于表达以下一种或多种标志物的T细胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197和HLA-DR，如果需要，可透过阳性或阴性选择技术进一步分离。
外周血单核细胞(PBMC)是指具有圆形细胞核的任何血细胞(即，淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞)。这些血细胞是免疫系统中抵抗感染和适应入侵者的关键组成部分。淋巴细胞群由CD4+和CD8+T细胞、B细胞和自然杀手细胞、CD14+单核细胞和嗜碱性粒细胞/嗜中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/树突细胞组成。这些细胞通常使用FICOLLTM(一种分离血液层的亲水性多糖)从全血或白细胞包中分离，单核细胞和淋巴细胞在血浆层下形成血沉棕黄层。在一实施方案中，“PBMC”是指包含至少T细胞和任选NK细胞以及抗原提呈细胞的细胞群。
术语“激活”系指T细胞已被充分刺激而诱导可检测细胞增殖的状态。在特定的实施方案中，激活还可与诱导细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“激活的T细胞”尤其系指正在增殖的T细胞。仅透过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，还需要一种或多种次级信号或共刺激信号。因此，T细胞激活包括透过TCR/CD3复合体的初级刺激信号以及一种或多种次级共刺激信号。共刺激可以透过已经接受主要激活信号的T细胞的增殖和/或细胞因子产生来证明，例如透过CD3/TCR复合体或透过CD2的刺激。
本文所使用的静置T细胞系指不分裂或产生细胞因子的T细胞。与激活的T细胞(约12-15微米)相比，静置T细胞较小(约6-8微米)。
本文所使用的预引发T细胞为静置T细胞，其已经预先激活至少一次并已从激活刺激中移除至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约60小时、至少约72小时、至少约84小时、至少约96小时、至少约108小时或至少约120小时。或者，静置可能在约0.5小时至约120小时、约0.5小时至约108小时、约0.5小时至约96小时、约0.5小时至约84小时、约0.5小时至约72小时、约0.5小时至约60小时、约0.5小时至约48小时、约0.5小时至约36小时、约0.5小时至约24小时、约0.5小时至约18小时、约0.5小时至约12小时、约0.5小时至约6小时、约1小时至约6小时、约2小时至约5小时、约3小时至约5小时或约4小时至约5小时的时间段内进行。预引发的T细胞通常具有记忆表型。
本公开的实施方案可能包括在不存在细胞因子或存在细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21或其组合，如：IL-7+IL-15)的情况下静置约0.5小时至约48小时、约0.5小时至约36小时、约0.5小时至约24小时、约0.5小时至约18小时、约0.5小时至约12小时、约0.5小时至约6小时、约1小时至约6小时、约2小时至约5小时、约3小时至约5小时、约4小时至6小时、约1小时至约24小时、约2至约24小时、约12至约48小时、约0.5小时至约120小时、约0.5小时至约108小时、约0.5小时至约96小时、约0.5小时至约84小时、约0.5小时至约72小时或约0.5小时至约60小时，例如：约4小时至约6小时。
在适应性免疫反应期间和之后控制淋巴细胞扩增和收缩可能是维持健康免疫系统所必需的。淋巴细胞凋亡的外在和内在途径可设计为在适当的时间消除细胞以确保免疫稳态。如果没有这种淋巴细胞凋亡屏障，激活淋巴细胞长时间持续存在和/或不加约束的积聚可导致免疫病理学、自身免疫和淋巴样癌症。
图1显示，与大多数体细胞一样，幼稚和记忆T细胞可在通常静止的代谢状态下工作并利用线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)产生ATP。但是，在T细胞受体(TCR)刺激后，即使在存在氧气的情况下，反应的T细胞也迅速转向使用糖酵解作用(Warburg效应)。激活的T细胞可能增殖并获得有效的效应子功能(例如，产生IFN-7)，这可能与糖酵解代谢相关。在T细胞反应过程中细胞代谢的这些变化可能严重影响细胞存活和分化(包括记忆的产生)。但是，在该扩增和有氧糖酵解窗口期，效应子T细胞可能对再刺激诱导的细胞死亡(RICD)变得敏感。
再刺激诱导的细胞死亡(RICD)是一种凋亡程序，其最终可设定感染期间效应子T细胞扩增的上限。RICD的敏感性可能依赖于之前的激活、透过细胞因子(例如，IL-2)的细胞周期诱导，以及随后透过TCR传播的强烈再刺激信号(其在亚组效应子中诱导细胞凋亡)。与效应子T细胞不同，幼稚和静置记忆T细胞可能对RICD具有相对抗性。透过在抗原诱导的扩增期限制效应子T细胞数量，这种自我调节的死亡途径可透过预防对宿主的过度、非特异性免疫病理学损伤来帮助维持免疫稳态。实际上，如X性联淋巴增殖性疾病患者中所示，RICD缺陷可导致过多的T细胞积聚和对宿主组织的致死性损伤。
细胞因子戒断诱导的细胞死亡(CWID)是一种负责杀灭大多数效应子T细胞的细胞凋亡程序，由清除感染后细胞因子(如IL-2)水平减弱引发，可挽救选定少数存活作为记忆T细胞。虽然过量的合成代谢(例如，糖酵解)可能使效应子T细胞更容易受RICD影响，但另一方面，分解代谢(例如，自噬和脂肪酸氧化(FAO))可保护来自不同记忆区室的T细胞免于细胞因子戒断诱导的死亡。因此，CWID敏感性可能在确定有哪些以及多少T细胞在收缩中存活并进入记忆库中起主要作用，从而影响源自不同记忆亚组的二次反应。
CWID和RICD可作为固有反馈应答程序在免疫反应的不同阶段发挥作用，其受到细胞、抗原和细胞因子动态定位的影响。两个过程都由抗原和IL-2以及其他生长/存活细胞因子的可用性精确调节。从机制上来说，这两个过程都可能透过细胞凋亡的不同生化机制(称为内源性和外源性途径)来消除T细胞。内源性途径受调节线粒体外膜电位(MOMP)的Bcl-2家族蛋白的相对表达控制。当线粒体去极化后，细胞色素c释放可催化酶原9的裂解和激活。外源性凋亡主要透过肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族(例如，Fas)的死亡受体(DR)而受到信号。
CWID诱导内源性细胞凋亡。戒断IL-2或其他γ链细胞因子特异性地上调和激活Bim，而Bim是一种拮抗抗细胞凋亡Bcl-2家族蛋白(如，Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1)功能的关键促凋亡蛋白并激活Bax，这导致线粒体透化。RICD可归因于透过Fas的外源性凋亡信号，其可透过暴露于再刺激T细胞表面上的膜锚定FasL以顺式或反式受到刺激。
由于分解代谢(即，自噬)可保护源自不同记忆区室的T细胞免受细胞因子戒断诱导的死亡(即CWID)，因此，离体T细胞扩增的一个目的可能是增加记忆形成细胞(例如：幼稚T细胞(TN)和/或干记忆T细胞(Tscm)/T中央记忆(Tcm)细胞)的数量。
图2显示了治疗实体瘤和非实体瘤的常规ACT T细胞的差异。为了治疗实体瘤，可透过抗CD3和抗CD28抗体激活T细胞，然后扩增一段时间。在实体瘤环境中激活/扩增的工程化T细胞撷取同源抗原与非实体瘤、非同源抗原和有限的细胞凋亡抑制物相比下降，因此可能经历离体扩增期间诱导的内源性凋亡途径，例如：损伤诱导的细胞死亡(DICD)或CWID。为了治疗非实体瘤，在含有肿瘤和抗原提呈细胞的同源抗原富含环境的非实体瘤环境中激活/扩增的工程化T细胞不太可能因CWID经历细胞凋亡，但比较可能因抗原刺激增加而经历激活诱导的细胞死亡(AICD)，表明治疗实体瘤可能需要T细胞对CWID的承受力强于对AICD的承受力。
图3显示，为了测试体外扩增T细胞在细胞因子刺激戒断中(例如，在实体瘤中)存活的能力，可使用细胞因子敏感性测定法。另一方面，为了测试体外扩增T细胞在重复TCR刺激中(例如，在非实体瘤中)存活和发挥作用的能力，可使用连续杀灭测定法。
表1总结了非实体瘤和实体瘤之间体内T细胞存活的差异。
表1：体内T细胞存活模型
Figure GDA0002918096550000171
由于靶向抗原剥夺环境中之实体瘤的ACT中的体外扩增T细胞之存活可能比靶向非实体瘤者更依赖于细胞因子，因此，体外记忆形成和CWID减少对于靶向实体瘤的体外扩增T细胞比靶向非实体瘤者可能更为关键。因此，选择可以在ACT中以高通量患者特异性方式在体内持续存在的T细胞类型可提高靶向实体瘤的临床疗效。本公开的细胞因子敏感性测定可用于预测和选择哪些类型的扩增T细胞可在体内在抗原剥夺环境中持续存在。
T细胞的来源
在T细胞扩增和基因修饰之前，可从受试者中获得T细胞来源。T细胞可从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施方案中，可使用本领域可获得的任何数量的T细胞系。在某些实施方案中，T细胞可使用本领域技术人员已知的任何数量的技术(例如，FicollTM分离技术)从受试者中采集的血液单位中获得。在一优选实施方案中，来自个体循环血液的细胞可透过血液成分单采术获得。血液成分单采术产品通常合有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。透过血液成分单采术收集的细胞可能进行洗涤，以除去血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于随后的处理步骤。可用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，也可用缺乏钙并且可能缺乏镁或者可能缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子的洗涤溶液洗涤细胞。在没有钙的情况下初始激活步骤可能导致激活放大。如本领域普通技术人员应当容易理解的，洗涤步骤可透过本领域技术人员已知的方法完成，例如：根据制造商的说明透过使用半自动“流经(flow-through)”离心机(例如，Cobe 2991 ceil处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤后，可将细胞重悬浮于各种生物相容性缓冲液(例如，无Ca2+、无Mg2+PBS、PlasmaLyteA)或含有或不含缓冲液的其他盐水溶液中。或者，可除去血液成分单采样本中不需要的组分，并将细胞直接重悬浮于培养基中。
在另一实施方案中，可透过裂解红细胞和耗尽单核细胞从外周血淋巴细胞中分离T细胞，例如，透过PERCOLLTM梯度离心或透过逆流离心淘洗法。可透过正选或负选技术进一步分离特定的T细胞亚群，例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。
例如，在一实施方案中，可透过与抗CD3/抗CD28(即，3x28)-缀合珠(例如，
Figure GDA0002918096550000191
M-450 CD3/CD28 T)孵育足以正选所需的T细胞的时间来分离T细胞。透过负选来富集T细胞群可透过针对负选择细胞独有的表面标志物的抗体组合来实现。一种方法可以是透过负磁免疫性粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，其使用针对存在于负选择细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了透过负选富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常可包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或正选调节性T细胞，其通常可表达CD4+、CD25+、CD62L1、GITR+和FoxP3+。或者，在某些实施方案中，T调节细胞可被抗CD25缀合珠或其他类似选择方法耗尽。
为了透过正选或负选而分离所需的细胞群，细胞和表面(例如，诸如珠等颗粒)的浓度可不同。在某些实施方案中，可能需要显著降低体积，其中珠和细胞可混合在一起(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一实施方案中，可使用20亿个细胞/ml的浓度。在一实施方案中，可使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一实施方案中，可使用大于1亿个细胞/ml。在另一实施方案中，可使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在再一实施方案中，可使用7.5、8、8.5、9、9.5千万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产量、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度可允许更有效地捕获可能弱表达受关注靶抗原的细胞(例如，CD28阴性T细胞)或者来自存在许多肿瘤细胞的样本(即，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可能具有治疗价值并且是期望获得的。例如，使用高浓度细胞可允许更有效地选择CD28表达通常较弱的CD8+T细胞。在一相关实施方案中，可能需要使用较低浓度的细胞。透过显著稀释T细胞和表面的混合物(例如，诸如珠等颗粒)，可以使颗粒和细胞之间的相互作用最小。这可能选择表达大量与颗粒结合的所需抗原的细胞。
无论是在T细胞的基因修饰之前还是之后，所述细胞一般均可透过使用，例如：美国专利号6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041和美国专利申请公开号2006/0121005所述的方法进行激活和扩增。这些专利和申请各内容透过完整引用并人本文。扩增T细胞群的其他策略描述参见，例如：Dudley et al.Journal of Immunotherapy 2003；26：332-42；Rasmussen et al.，Journalof Immunological Methods 2010；355：52-60；Somerville et al.，JournalofTranslational Medicine 2012；10：69。前述参考文献的全部内容透过引用整体并人本文。
给予自体细胞
自体细胞可透过本领域已知的任何合适途径给予。优选地，细胞可以动脉内或静脉内输注给予，持续约30至约60分钟。其他代表性给药途径可包括腹膜内、鞘内和淋巴管内给药。同样地，可给予任何合适剂量的自体细胞。例如，在一实施方案中，可给予约1.0×108个细胞至约1.0×1012个细胞。在一实施方案中，可给予约1.0×1010个细胞至约13.7×1010个T细胞，平均大约5.0×1010个T细胞。或者，在另一实施方案中，可给予约1.2×1010至约4.3×1010个T细胞。
在一实施方案中，用于ACT的自体细胞可能为淋巴细胞(例如，T细胞)。在一实施方案中，T细胞可为“年轻”(例如，19-35天龄)T细胞，例如，美国专利号8,383,099中所述，其内容透过引用整体并人本文。年轻T细胞被认为比老T细胞具有更长的端粒，在一些情况下，更长的端粒长度可能与改善ACT后临床结果相关。
一方面，本文所述的T细胞和T细胞产生方法可与ACT的一种或多种代表性策略结合使用：肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、抗原扩增的CD8+和/或CD4+T细胞、经基因修饰以表达特异性识别肿瘤抗原的T细胞受体(TCR)的T细胞、以及经基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。这些方法中每一种方法的简要和非限制性描述如下。
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)
一种ACT策略涉及从肿瘤片段或肿瘤转移灶的单细胞酶消化物离体扩增的自体TIL移植。肿瘤中的T细胞浸润本质上为多克隆的，并且总体识别多种肿瘤抗原。例如，请参见Rosenberg et al.，N.Engl.J.Med.(1988)319：1676-1680，其内容透过引用整体并人本文。在一代表性TIL ACT方案中，可切除患者的肿瘤并在无菌条件下切成小的(例如，3-5mm2)片段。可将片段置于具有生长培养基的培养板或烧瓶中，并用高剂量IL-2处理。此初始TIL扩增期(也称为“REP前”期)通常持续约3至约5周，在此期间可产生约5×107或更多的TIL。然后，可对所得的TIL以进一步扩增(例如，遵循快速扩增方案(REP))以产生适于输注到受试者的TIL。REP前的TIL可冷冻保存供较晚扩增，也可立即扩增。还可筛选REP前TIL以在扩增前确定具有高抗肿瘤反应性的培养物。典型的REP可能涉及在存在辐照PBMC饲养细胞下使用T细胞刺激抗体(例如，抗CD3mAb)激活TIL。饲养细胞可从患者或健康供体受试者中获得。可以将约6,000U/mL浓度的IL-2加入REP培养物以促进TIL细胞快速分裂。以这种方式扩增TIL可能需要大约2周或更长时间，并可形成约100-1,500亿个TIL的细胞库。扩增细胞可进行洗涤和合并，并可适合于输注到患者体内。患者通常可接受109～1011个细胞1或2次输注(间隔1-2周)。给予患者高剂量IL-2治疗(例如，每8小时7.2×105IU/kg，持续约2至约3天)以有助于对输注后的TIL细胞提供支持。例如，请参见Rosenberg et al.，Nat.Rev.Cancer(2008)8：299-308，其内容透过引用整体并人本文。输注之前，患者可任选地接受使用环磷醯胺(Cy)和氟达拉滨(Flu)进行淋巴细胞清除。例如，请参见Dudley etal.，Science(2003)298：850-854，其内容透过引用整体并人本文。另外，为了防止再次出现内源性调节性T细胞(Treg)，并用全身辐照(TBI)与淋巴细胞清除，例如，请参见Dudley etal.，J.Clin.Oncol.(2008)26(32)：5233-5239，其内容透过引用整体并人本文。
向接受ACT方案的受试者输注最小扩增的TIL可提升转移细胞的持久性，刺激转移细胞的持久性、增殖和存活，并改善肿瘤消退。
抗原扩增的CD8+和/或CD4+T细胞
可用抗原体外刺激自体外周血单核细胞(PBMC)以产生可用于ACT的肿瘤抗原特异性或多克隆CD8+和/或CD4+T细胞克隆。例如，请参见Mackensen et al.，J.Clin.Oncol.(2006)24(31)：5060-5069；Mitchell et al.，J.Clin.Oncol.(2002)20(4)：1075-1086；Yeeet al.，Proc.Natl.Aad.Sci.USA(2002)99(25)：16168-16173；Hunder et al.，N.Engl.J.Med.(2008)358(25)：2698-2703；Verdegaal et al.，CancerImmunol.Immunother.(2001)60(7)：953-963，各自内容透过引用并人本文。为了避免从幼稚PBMC群扩增肿瘤特异性T细胞的过程耗时且劳动密集，最近描述了一种方法，其中可使用表达HLA-A0201、共刺激分子和膜结合细胞因子的人工抗原提呈细胞(aAPC)多重刺激自体PBMC从而产生用于ACT的抗原特异性T细胞。例如，请参见Suhoski et al.，Mol.Ther.(2007)15(5)：981-988；Butler et al.，Sci.Transl.Med.(2011)3(80)：80ra34，其内容透过引用整体并人本文。
在一实施方案中，可透过体外用一种或多种可任选地从载体表达之癌症抗原(包括其抗原部分，例如，表位或细胞)，在存在T细胞生长因子(如，300IU/ml IL-2或IL-15)的情况下(优选为IL-2)刺激外周血单核细胞(PBMC)来快速扩增T细胞。可透过使用脉冲到表达HLA-A2的抗原提呈细胞上的相同癌症抗原再刺激而快速扩增体外诱导的T细胞。或者，可用例如经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激所述T细胞。
在一实施方案中，细胞群可富集CD8+T细胞。例如，T细胞培养物可使用CD8微珠分离(例如，使用Clini-MACSPplus CD8微珠系统(Miltenyi BiotecTM))耗尽CD4+细胞和富集CD8+细胞。富集CD8+T细胞可透过去除CD4+T调节细胞而改善ACT的结果。
向接受ACT方案的受试者输注最小扩增的T细胞(例如，从PBMC刺激中获得CD8+和/或CD4+T细胞)，可提升转移细胞的持久性，刺激转移细胞的持久性、增殖和存活，并改善肿瘤消退。
经基因修饰以表达特异性识别肿瘤抗原的T细胞受体(TCR)的T细胞
在某些情况下，可能无法获得ACT所需的量之对肿瘤抗原具有高亲合力的TIL。因此，可能需要对淋巴细胞进行基因修饰，以获得可在输注入受试者之前特异性识别受关注抗原的细胞群。编码TCR的基因可以从以高亲合力特异性识别癌抗原的T细胞中分离。从外周血中分离的T淋巴细胞可用逆转录病毒或慢病毒转导，所述病毒含有编码具有所需特异性的TCR的基因。此方法可允许快速产生用于ACT的大量肿瘤抗原特异性T细胞。
可使用Heemskerk et al.Hum Gene Ther.19：496-510(2008)和Johnson etal.Blood 114：535-46(2009)描述的转导技术转导T细胞，以表达对癌抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。这些参考文献的内容透过引用整体并人本文。使用经基因修饰以表达TCR(可识别受关注抗原)的T细胞的ACT可根据Morgan et al.，Science(2006)314(5796)：126-129公布的临床试验方案进行。此参考文献的内容透过引用整体并人本文。
向接受ACT方案的受试者输注最小扩增的T细胞(例如，经基因工程改造以表达识别肿瘤抗原之TCR(或经修饰的TCR)的T细胞)，可提升转移细胞的持久性，刺激转移细胞的持久性、增殖和存活，并改善肿瘤消退。
一方面，能够与本文所述的方法和实施方案一起使用的TAA肽包括，例如，美国专利公开号20160187351、美国专利公开号20170165335、美国专利公开号20170035807、美国专利公开号20160280759、美国专利公开号20160287687、美国专利公开号20160346371、美国专利公开号20160368965、美国专利公开号20170022251、美国专利公开号20170002055、美国专利公开号20170029486、美国专利公开号20170037089、美国专利公开号20170136108、美国专利公开号20170101473、美国专利公开号20170096461、美国专利公开号20170165337、美国专利公开号20170189505、美国专利公开号20170173132、美国专利公开号20170296640、美国专利公开号20170253633、美国专利公开号20170260249、美国专利公开号20180051080和美国专利公开号20180164315所述的TAA肽，本文所述的这些专利公开内容和序列表透过引用整体并人本文。一方面，本文所述的T细胞选择性地识别提呈上述一个或多个专利和公开内容中所述TAA肽的细胞。
一方面，能够与本文所述方法一起使用的T细胞受体包括，例如，美国专利公开号20170267738、美国专利公开号20170312350、美国专利公开号20180051080、美国专利公开号20180164315、美国专利公开号20180161396、美国专利公开号20180162922、美国专利公开号20180273602、美国专利公开号20190002556、美国专利公开号20180135039中所述的方法，这些专利公开的各项内容透过引用整体并人本文。
另一方面，能够与本文所述的方法和实施方案一起使用的TAA包括选自SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：157的至少一种。一方面，T细胞选择性地识别提呈SEQ ID NO：1-157或本文所述任何专利或申请中所述TAA肽的细胞。
Figure GDA0002918096550000231
Figure GDA0002918096550000241
Figure GDA0002918096550000251
Figure GDA0002918096550000261
经基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞
基因工程改造T细胞以表达如上述具有所需特异性的TCR可能是非常有前景的ACT方法。尽管如此，仍然存在工程化TCR α和β链与内源性TCR链错配的可能性。此外，使用表达工程化TCR的细胞的ACT是否能成功取决于在被靶向癌细胞中由TCR所识别的特定MHC分子的表达情况。为了避免这些可能的复杂情况，T细胞可替代地经工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)。
CAR的最简单形式可能含有与跨膜结构域偶联的抗原结合结构域和来自CD3ζ链细胞质尾部的信号传导结构域。有证据表明CD3ζ链可能不足以完全激活转导T细胞。因此，CAR可优选合有抗原结合结构域、共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。共刺激结构域与CD3ζ信号传导结构域组合使用模拟T细胞激活的双信号模型。CAR抗原结合结构域可以为抗体或抗体片段，例如，Fab或scFv。
抗原结合结构域透过跨膜结构域与CD3ζ信号传导结构域和共刺激结构域分开。跨膜结构域可衍生自任何跨膜蛋白。在一实施方案中，可使用与CAR中的一个结构域天然相关的跨膜结构域。在另一实施方案中，使用了外源或合成跨膜结构域。在一些实施方案中，可选择跨膜结构域或透过氨基酸取代来修饰，以最小化与其他膜蛋白的相互作用。
可在CAR的细胞外结构域和跨膜结构域之间或在CAR的细胞质结构域和跨膜结构域之间任选地掺人一间隔区。所述间隔区可为任何寡肽或多肽，其功能是将跨膜结构域连接到细胞外结构域或细胞质结构域。间隔区可含有至多300个氨基酸，优选为10至100个氨基酸，更优选为25至50个氨基酸。
CAR的细胞内结构域可能负责激活免疫细胞的至少一种正常效应子功能，所述免疫细胞中表达CAR。效应子功能可包括：例如，细胞溶解活性或辅助活性，例如，分泌细胞因子。因此，分子的细胞内信号传导结构域可能指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞执行专门功能。尽管可使用整个细胞内信号传导结构域，但是在许多情况下可能使用细胞内结构域的一部分，只要所选部分可转导效应子功能信号即可。CAR的细胞质结构域可包括CD3ζ信号传导结构域自身或与共刺激结构域组合。共刺激结构域包含共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子可能为促进淋巴细胞对抗原有效反应的细胞表面分子。在一些实施方案中，共刺激结构域可能含有共刺激分子的细胞内结构域，例如：4-1BB、CD27、CD28、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-l(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体或其组合。在一示例性实施方案中，共刺激分子可为4-1BB或CD28的细胞内结构域。
向接受ACT方案的受试者输注最小扩增的T细胞(例如，经基因工程改造以表达识别肿瘤抗原之CAR的T细胞)，可提升转移细胞的持久性，刺激转移细胞的持久性、增殖和存活，并改善肿瘤消退。
如上所述，治疗实体瘤可能需要T细胞对CWID的承受力强于对AICD的承受力。确定制造的T细胞在同源抗原限制实体瘤环境中之持久性的常规方法通常取决于动物模型。相反地，本公开的实施方案使用体外测定法作为替代方法来确定可增强体内T细胞持久性的T细胞制造条件。为此，可在非同源抗原或低同源抗原环境中测试制造的T细胞。例如，在不存在同源抗原提呈细胞(例如：同源抗原提呈肿瘤细胞、树突细胞或巨噬细胞)的情况下，制造的T细胞可以以低密度在培养物中接种，例如，约1,000至约1x106个细胞/cm2、约1,000至约500,000个细胞/cm2、约1,000至约250,000个细胞/cm2、约1,000至约200,000个细胞/cm2、约1,000至约150,000个细胞/cm2、约1,000至约100,000个细胞/cm2、约1,000至约50,000个细胞/cm2、约1,000至约10,000个细胞/cm2或约1,000至约5,000个细胞/cm2。为了在细胞因子刺激减少的环境中测试制造的T细胞，制造的T细胞可在非同源抗原或低同源抗原环境中在存在低浓度(例如：约1至约1,000ng/ml、约1至约500ng/ml、约1至约250ng/ml、约1至约100ng/ml、约1至约50ng/ml、约5至约50ng/ml、约5至约40ng/ml、约5至约30ng/ml、约5至约20ng/ml或约5至约10ng/ml)细胞因子的情况下培养一段长时间，例如，约1至约30天、约2至约25天、约3至约21天、约3至约14天、约3至约10天或约3至约7天。
实施例：
实施例1
细胞因子敏感性测定法(CSA)
为了研究离体T细胞扩增长度对T细胞合适性的作用，制造T细胞4天、7天或10天。在此制造后，透过CSA分析T细胞并分析以下指标：(1)透过T细胞的倍数生长测得的细胞存活，(2)透过碘化丙啶和膜联蛋白-V染色测得的细胞凋亡，(3)透过稀释增殖染料PkH67测得的分裂，(4)透过流式细胞术测得的细胞因子受体表达，和(5)透过流式细胞术测得的T细胞记忆表型。
CSA显示，透过以下观察评估，在CSA内进行评估时，扩增时间延长可能导致T细胞合适性显著降低：(1)T细胞存活降低，(2)细胞凋亡增加，(3)分裂速率下降，(4)细胞因子受体表达相关性，和(5)
Figure GDA0002918096550000281
区室存活降低。
CSA进行21天，每份样本在7个时间点进行分析，这可定义时间行为的单个指标。为此目的，计算时间数据的曲线下面积(积分)，并将其用作代表以下结果中21天内样本行为的单个定义指标。
可从健康的同种异体供体或患者中获得血液成分单采术T细胞。这些T细胞可在存在IL-2的情况下用激活抗CD3抗体(例如，OKT3)、或者在存在IL-2的情况下用抗CD3-和抗CD28抗体包覆的顺磁珠、或者用表达4-1BBL和Fc受体的人工抗原提呈细胞(aAPC)用OKT3和IL-2来激活或刺激。然后可使用逆转录病毒或慢病毒平台用重组TCR来转导激活的T细胞。转导的T细胞可扩增不同的时间长度，例如，4天(第4天)、7天(第7天)或10天(第10天)，其中激活于第0天开始。由于重组TCR可掺人T细胞基因组，因此，扩增期间产生的所有子细胞也可表达重组TCR。扩增/转导的T细胞可立即使用，也可冷冻保存供将来使用。
图4显示了本文所述的细胞因子敏感性测定法的一实施方案。图4中，冷冻保存或冷冻的扩增TCR转导的T细胞(例如，4天、7天或10天)可在没有细胞因子的情况下解冻并静置4小时，然后以有限的数量(例如，2x105个细胞/孔)加入细胞培养孔中。可加入增殖染料(例如PkH26染料)和各细胞因子(例如，IL-2、IL-15、IL-7或其组合)，之后孵育一段时间(例如，21天)。可在21天的测定期间每7天(即在第0天、第7天和第14天)将新鲜细胞因子加至培养的T细胞中。在测定中每7天即将结束时，与测定开始时相比，培养基的细胞因子水平降低。在测定的不同时间，可收集扩增的工程化T细胞，并透过膜联蛋白-V染色、记忆表型(例如，CD45RO和CCR7标志物)和细胞因子受体表达(例如IL-2受体(CD25)、IL-7受体(CD127)和IL-15受体(CD122))等来分析细胞数量、增殖、凋亡。
实施例2
为期21天的测定中，T细胞体外扩增时间缩短表现出持久的Tscm样表型(体内疗效所需)图5A-5D显示了TCR转导T细胞的表型，所述T细胞从健康供体中获得并扩增(A)0天、(B)4天、(C)7天和(D)10天。扩增T细胞与淋巴细胞透过CD45RO染色分离，随后透过CCR7染色以区分
Figure GDA0002918096550000291
(CD45RO-CCR7+)，例如：23.2％(第4天扩增的T细胞)、16.4％(第7天扩增的T细胞)和22.9％(第10天扩增的T细胞)。与第0天(49.4％，未扩增)相比，第4天、第7天和第10天扩增的T细胞显示Tscm样表型的细胞数量下降。
为了探讨细胞因子剥夺对TCR转导T细胞的影响，在存在IL-15的情况下将扩增4天、7天或10天的T细胞培养21天。在21天的测定期间，每7天(即第0天、第7天和第14天)向培养的T细胞中加入新鲜的IL-15(10ng/ml)。当培养物中的IL-15水平最低时，在每7天IL-15加料结束时(即第7天、第14天和第21天)使用CD45RO和CCR7染色透过流式细胞术检查Tscm样表型。
图6A-6I提示，在整个21天的测定中，透过保留Tscm样(即Tnaive/Tscm)细胞群，第4天扩增的T细胞显示了更好的IL-15敏感性。由于Tscm样表型与体内T细胞持久性相关，因此，这些结果表明，较早(例如，约4天)扩增的工程化T细胞可能比扩增较长时间(例如，大于或等于约7天)者更好。
为了研究哪些T细胞记忆区室持续存在，培养期间每7天进行基于流式细胞术的T细胞表型分析。
图20A显示，在扩增第21天时，3天(早期)扩增样本中幼稚(scm)和中央记忆(Tcm)T细胞的百分比显著较高，而7天(中期)和10天(晚期)扩增样本中这两个较低分化的T细胞区室均大大下降。
图20B一致地显示，在用IL-15培养期间第7天前，基于PkH稀释的CCR7表达细胞增殖增加，表明扩增下降可透过增加细胞因子受体的表达而导致保留增殖可能性。总体而言，此数据显示早期扩增的T细胞保留了能够应对IL-2、IL-7和IL-15而增殖的一群早期分化CD8+T细胞。
实施例3
T细胞体外扩增时间缩短与存活增加相关
在无额外抗原或CD3刺激而存在IL-7、IL-15或IL-2的情况下，评估解冻扩增T细胞的存活能力。第4天扩增的T细胞能够在所有三种细胞因子条件下实质上生长超过较晚扩增的T细胞，在IL-7、IL-15和IL-2中峰值倍数生长约10倍、30倍和15倍。相反地，第7天和第10天扩增的T细胞不能在任何细胞因子条件下维持实质的生长。此外，在无所有细胞因子的情况下，无论扩增方案长度如何，各T细胞群以相似的速度死亡。
为了确定细胞因子剥夺对扩增T细胞增殖或存活的影响，在2l天内测量了存在IL-2、IL-7或IL-15的情况下扩增TCR转导T细胞的细胞生长。图7A-7C显示，在21天期间内，第4天扩增的T细胞与扩增较长时间者(例如，第7天和第10天扩增)相比在存在(A)IL-7、(B)IL-15和(C)IL-2的情况下表现出更高的细胞生长或更多的存活细胞。虚线设定为1，表示相对于起始细胞数的倍数生长无差异。
在存在较高浓度细胞因子(例如，IL-2(300U/ml)(图8A)、IL-7(10.0ng/ml)(图8B)或IL-15(10.0ng/ml)(图8C))的情况下，较早扩增的TCR转导T细胞随时间变化的细胞行为比扩增较长时间者更好。每个倍数生长曲线的总体存活透过计算曲线下面积确定。透过对三个生物供体的分析，得出一种趋势，即较早扩增的T细胞表现优于较晚扩增的细胞。对于IL-2，第4天和第7天扩增细胞之间的存活下降约5倍，第7天和第10天扩增细胞之间的存活下降约2倍。对于IL-7，第4天和第7天扩增细胞之间的总体存活下降约6倍，第7天和第10天扩增细胞之间下降约4倍。对于IL-15，第4天和第7天扩增细胞之间的总体存活下降约8倍，第7天和第10天扩增细胞之间下降约6倍。虽然由于供体与供体之间的差异很大而无统计学显著意义，但是存在一致的趋势是：较早扩增的细胞比较晚扩增的细胞存活多。在测定第21天时，在存在较高浓度细胞因子(例如，IL-2(300U/ml)(图8D)、IL-7(10.0ng/ml)(图8E)或IL-15(10.0ng/ml)(图8F))的情况下，较早扩增的TCR(例如，CD8Vb8+)转导的T细胞的总体存活比扩增较长时间者更好。
在存在较低浓度细胞因子的情况下例如IL-2(30U/ml)(图9A)、IL-7(1.0ng/ml)(图9B)或IL-15(1.0ng/ml)(图9C)也观察到类似的结果。例如，在测定第21天时，扩增4天的T细胞与扩增较长时间(例如，扩增7天和10天)的T细胞相比存活更好。这些结果显示T细胞体外扩增时间缩短与细胞因子剥夺条件下存活增加相关。
实施例4
T细胞体外扩增时间缩短与细胞凋亡减少相关
由于较早扩增细胞的倍数生长增加和分裂增加，因此，如碘化丙啶(PI)和膜联蛋白-V染色评估的细胞凋亡可能相应减少。
为了确定细胞因子剥夺对扩增T细胞凋亡的影响，在21天内测量了在存在IL-2、IL-7或IL-15的情况下扩增T细胞的凋亡。图10A-10C显示，扩增4天的T细胞与扩增7天和10天者相比在存在(A)IL-7(10ng/ml)、(B)IL-15(10ng/ml)和(C)IL-2(300IU/ml)的情况下包含的凋亡细胞较少。透过排除碎片和低FSC群来门控淋巴细胞的凋亡百分比。图11A-11C显示，在测定第10天时，扩增约4天的TCR转导T细胞之透过曲线下面积测定的总体凋亡较低。对于IL-2的条件，第4天和第7天细胞之间的细胞凋亡存在统计学上不显著增加(约1.8倍)，而第4天和第10天细胞之间存在统计学上显著增加(约3倍)(p＝0.0092)。对于IL-7的条件，第4天和第7天细胞之间的细胞凋亡存在统计学上不显著增加(约2倍)，而第4天和第10天细胞之间存在统计学上显著增加(约7倍)(p＜0.0001)。对于IL-15的条件，第4天和第7天细胞之间的细胞凋亡存在统计学上不显著增加(约1.6倍)，而第4天和第10天细胞之间存在统计学上显著增加(约5.5倍)(p＝0.0010)。
图12提示，在测定第10天时，在存在IL-15(10ng/ml)的情况下，扩增4天的T细胞含有的凋亡细胞(4.97％，膜联蛋白-V+/PI-)(A)少于扩增较长时间者(例如，(B)第7天(10.6％，膜联蛋白-V+/PI-)和(C)第10天(18.2％，膜联蛋白-V+/PI-))。这些结果证明T细胞体外扩增时间缩短与细胞因子剥夺条件下细胞凋亡减少相关。
实施例5
T细胞体外扩增时间缩短与细胞分裂增加相关
为了确定细胞因子对扩增T细胞分裂的影响，测量了在存在IL-2、IL-7或IL-15的情况下扩增T细胞的细胞分裂。图13A-13C显示，较早扩增(例如，第4天)的TCR转导T细胞在存在(A)IL-7(10ng/ml)、(B)IL-15(10ng/m1)和(C)IL-2(300IU/m1)的情况下比扩增较长时间(例如，第7天和第10天)者包含更多的分裂细胞。由于测定10天后缺乏第10天细胞的细胞，因此，数据显示至多10天。在测定第10天时，在存在较高浓度细胞因子(例如，IL-2(300U/m1)(图14A)、IL-7(10.0ng/m1)(图14B)或IL-15(10.0ng/m1)(图14C))的情况下，较早扩增的TCR转导T细胞(例如，第4天扩增)的分裂细胞比扩增较长时间者(例如，第7天和第10天扩增)更多。较早扩增细胞(例如，第4天)的分裂情况按CSA中10天内每个时间点稀释增殖染料的细胞百分比进行计算。分析最长10天，这是因为较晚扩增的细胞在第10天后无足够的细胞进行准确分析。对于IL-2，第4天和第7天扩增细胞之间的总体分裂下降约30％，第4天和第10天扩增细胞之间下降约50％，p＝0.0307。对于IL-7，观察到相同的趋势，即，第4天和第7天扩增细胞之间下降约40％，第4天和第10天扩增细胞之间下降约80％，p＝0.0006。对于IL-15，观察到相同的趋势，即，第4天和第7天扩增细胞之间下降约20％，第4天和第10天扩增细胞之间下降约40％，p＝0.0025。
细胞因子敏感性可由细胞因子诱导的细胞分裂水平来确定。为了确定扩增T细胞的细胞因子敏感性，测定中在细胞因子非限制性条件下(例如，3天)测量IL-2、IL-7或IL-15诱导的扩增T细胞总体细胞分裂。可透过在测定中计算3天内的细胞分裂曲线下面积进行积分从而计算总体细胞分裂。图15A-15C显示，较早扩增的(例如，第4天)T细胞在存在(A)IL-7(10.0ng/ml)、(B)IL-15(10.0ng/ml)和(C)IL-2(300IU/ml)的情况下比扩增较长时间(例如，第7天和第10天)者包含更多的分裂细胞。这些结果显示，T细胞体外扩增时间缩短比扩增时间较长的T细胞对细胞因子的反应更好。类似地，在测定第3天时，在存在较高浓度细胞因子(例如，IL-2(300U/ml)(图16A)、IL-7(10.0ng/ml)(图16B)或IL-15(10.0ng/ml)(图16C))的情况下，较早扩增的T细胞比扩增较长时间者细胞分裂更多。
实施例6
体外扩增时间缩短与细胞因子敏感性增加相关
基于淋巴细胞百分比的CD25表达或CD25表达的平均荧光强度(MFI)与对CSA中IL2诱导的存活反应之间存在强相关性(分别为R2＝0.82；R2＝0.89)。基于淋巴细胞百分比的CD127表达与对CSA中IL7诱导的存活反应之间无相关性(R2＝0.04)。有趣的是，CD127表达的MFI与IL7诱导的存活之间存在中度相关性(R2＝0.76)。基于淋巴细胞百分比的CD122表达与对CSA中IL15诱导的存活反应之间存在弱相关性(R2＝0.42)，或CD122表达的MFI与之存在中度相关性(R2＝0.67)。
细胞因子敏感性还可透过在存在细胞因子的情况下介导细胞信号传导途径的细胞因子受体的表达水平来确定。CSA测量对细胞因子诱导的存活、增殖和凋亡的反应。这些变化可能与测定开始时每个T细胞群内各细胞因子受体的表达相关。因此，分别测量了IL-2、IL-7和IL-15细胞因子受体的定义亚基(即CD25、CD127和CD122)的表达。值得注意的是，尽管CD122通常被指定为IL-15受体的反应性亚基，但是，它是IL-2和IL-15受体的共有亚基。例如，图16D显示，第4天(测定中3天后)扩增的T细胞与扩增较长时间者(例如，第7天和第10天)相比表达更多的IL-2受体(CD25)。图17A显示IL-2受体(CD25)表达的这种增加(在第4天扩增的TCR转导T细胞接受测定之前测量)与IL-2介导的细胞存活增加有良好的相关性，例如，R2＝0.89和0.82。AUC表示曲线下面积。图17B显示，IL-2受体(CD25)表达的这种增加也与IL-2介导的细胞分裂增加有良好的相关性，例如，R2＝0.81和0.69。
图18A和18B分别显示，IL-15受体(CD122)表达(在第4天扩增的TCR转导T细胞接受测定之前测量)与IL-15介导的细胞存活增加中度相关(例如，R2＝0.67和0.42)，与IL-15介导的细胞分裂也中度相关(例如，R2＝0.55和0.67)。
图19A和19B分别显示，IL-7受体(CD127)表达(在第4天扩增的TCR转导T细胞接受测定之前测量)与IL-7介导的细胞存活增加相关性差(例如，R2＝0.76和0.004)，与IL-7介导的细胞分裂的相关性也差(例如，R2＝0.61和0.08)。
这些测定结果显示，与扩增时间较长(例如，约7天至约10天)的细胞相比，较早制造的(或最小扩增的)工程化T细胞(例如，约3天至约5天)表现更好。例如，如图20所示，与体外扩增较长时间(例如，约7天至约10天)的工程化T细胞相比，最小扩增者(例如，约3至约5天)因幼稚性增加，例如，幼稚T细胞(TN)和/或干记忆T细胞(Tscm)/T中央记忆(Tcm)的细胞群增加、增殖能力增加和持久性增加(例如，透过减少CWID诱导的细胞凋亡)，可能显示出更好的临床疗效。
实施例7
CD3/CD28制造期间的细胞作用机制(MOA)表型分析
根据CSA的结果，T细胞似乎对增殖细胞因子的反应能力较低，部分原因可能是由于细胞因子受体表达的损失。这些数据表明，第10天扩增的T细胞中有一小部分可保留对细胞因子反应的能力。这项观察结果表明，T细胞群的异质性可能对观察到的行为发挥作用。为了研究这种多样性和可能性的损失，分析了T细胞扩增对(1)最终相对端粒长度、(2)端粒酶活性、(3)共刺激分子表达和(4)全RNA测序分析的影响。
端粒长度随着CD3/CD28制造延长而减少
端粒长度的损失标志着功能失调细胞，因为它们变得高度分化并最终衰老。为了研究这种效应是否在我们的差异扩增T细胞中发生，我们使用荧光原位杂交测定法来评估T细胞相对于内部细胞系对照的相对端粒长度(RTL)。
图22显示，对于所分析的所有四名供体(D1-D4)，在整个扩增方案中均存在RTL损失，第4天的扩增细胞RTL最高。当所有供体合并为一组计算时，第4天和第7天扩增的细胞之间RTL损失大约为20％，第7天和第10天扩增的细胞之间RTL又损失10％。数据中也存在年龄偏差的征兆，在第10天扩增的时间点进行比较时，年龄小供体的平均RTL比年龄大供体长。供体年龄：D1：50岁、D2：31岁、D3：49岁、D4：45岁。
端粒酶活性在CD3/CD28制造延长期间降低
根据CD3+CD28刺激后端粒长度减少和端粒酶诱导存在异质性，透过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了活性端粒酶的水平。
图23显示，第4天和第7天扩增培养物之间存在统计学上不显著的降低(约10％)。相反地，第4天和第10天的扩增细胞之间活性降低统计学上显著的40％(p＝0.0004)，第7天和第10天之间降低统计学上也显著的约25％(p＝0.0165)。总之，延长扩增产生细胞的RTL和活性端粒酶最终水平皆存在着扩增相关的损失，因此可能较不适合于额外的扩增。
CD3/CD28制造期间的T细胞早期记忆表型损失
CSA结果显示，差异扩增细胞之间在起始记忆区室方面可能存在明显差异。对起始记忆区室进行更高分辨率分析，以检测差异扩增样本之间的差异。
图24显示，第4天、第7天和第10天之间的Tnaive/scm区室存在统计学上不显著的小差异(平均值为20.03％、11.1％、17.47％的CD8细胞)。但是，第4天、第7天和第10天扩增的细胞之间，Tcm区室内存在统计学上显著的差异(p＜0.05)(平均值为58.27、37.73和16.8％的CD8细胞)。第4天、第7天和第10天扩增的细胞之间，Tem区室内存在统计学上显著的差异(p＜0.05)(平均值为18.9、48.13和58.9％的CD8细胞)。第4天、第7天和第10天扩增的细胞之间，Temra区室内存在统计学上不显著的小差异(平均值为2.70、3.06和6.80％的CD8细胞)。这些结果显示，主要记忆区室差异可能存在于Tcm至Tem转变中，较晚扩增的细胞包含较少的Tcm T细胞和较多的Tem T细胞。
CD28和CD27表达在CD3/CD28制造期间的损失
除常规记忆区室外，还对细胞进行了共刺激标志物CD28和CD27表达的表型分型，这两种标志物已知与体内增加T细胞持久性相关。
图25显示，CD3+CD28扩增期间，CD28和CD27皆逐步损失，制造期第10天前损失最大。虽然第4天、第7天和第10天扩增培养物之间的比较均无统计学显著意义(p＜0.05)，但第4天和第10天扩增培养物之间CD27+CD28+区室内存在具有显著性的趋势(p＝0.0520)
(平均值为58.47和21.43％的CD8细胞)。此外，第4天和第10天扩增的细胞之间，存在双阴性CD27-CD28-区室富集(p＝0.1581)(平均值为10.24％和29.77％的CD8细胞)。
差异基因表达分析将较早扩增细胞之聚簇确定为相较于较晚扩增细胞独特的聚簇
虽然数据表明差异扩增T细胞之间存在表型差异，但是探索可能限于所研究的指定靶标(例如，CD28或T细胞记忆区室)数量。为了扩大表型研究的范围，在扩增4、7或10天的三个生物供体中进行全RNA测序。
图26显示，根据聚簇分析结果，第4天的扩增细胞相较于第7天(以中间聚簇出现)有不同分组，而第10天的细胞以其独特的聚簇出现。这些结果显示，与第7天和第10天的扩增细胞相比，第4天的扩增细胞有明显不同的聚簇模式。此数据支持T细胞扩增的线性分化模型，其中RNA水平在整个扩增方案中逐渐变化。
与较晚的扩增样本相比，较早扩增细胞显示出差异表达基因数量增加进行全RNA测序以分析三个生物供体第4、7和10天扩增细胞之间的差异表达基因(DEG)。
图27显示了基因表达谱在制造过程的最早期改变，证据为：第4天与第7天比较时有5,078个DEG，第4天与第10天比较时有5,643个DEG。对于这两组，上调和下调基因的分布大致相等。相反地，当第7天与第10天制造的细胞进行比较时，DEG相对较少，确定了90个基因等分在上调和下调基因之间。
京都基因和基因组百科全书(KEGG)的分析强调整个制造过程中细胞周期相关基因的损失和细胞凋亡相关基因的上调
为了更好地理解制造过程中发生的骤然基因表达变化，进行了KEGG途径分析以确定在不同基因组中过度代表的基因途径。根据CSA的功能性结果(例如，存活、分裂和细胞凋亡)，KEGG途径可能与T细胞增殖和持久性有关。
图28显示，制造过程中较晚的时间点与第4天相比，DNA复制和细胞周期基因途径存在显著的下调。让这种效应更恶化的是，制造过程中同一时期有细胞凋亡(p53信号传导基因途径)的显著上调。与图27中的基因表达结果一样，制造过程中第7天和第10天之间几乎没有显著富集的途径。
实施例8
方法
T细胞制造
健康供体全血购自Hemacare，PBMC透过Ficoll梯度分离。将PBMC在补充有5％人AB血清(Gemini 100-318)培养基的TexMACS(Miltenyi 130-097-196)中激活16-24小时，方法是：以1x106个活PBMC/ml接种于组织培养瓶上，该组织培养瓶用溶于PBS(Lonza 17-516F)的1μg/ml抗-CD3(eBioscience 16-0037-85)和1μg/ml抗-CD28(eBioscience 16-0289-85)抗体在4摄氏度下包覆过夜。次日，分离总细胞并重悬至1x106个活细胞/ml，并将5ml细胞接种人Grex24孔板(Wilson Wolf80192M)的孔中。在存在10ng/ml IL-7(peprotech 200-07)、100ng/ml IL-15(peprotech 200-15)和10μg/ml鱼精蛋白硫酸盐的情况下，用TCR慢病毒构建体(由Lentigen生产)模拟转导或转导细胞。次日，向细胞中加入35mL补充有上述浓度IL-7和IL-15的完全TexMACS。让细胞再生长2、5或8天，具体时间取决于所需的制造时间(总共4天、7天或10天)。制造完成后，进行细胞计数，以5x106/ml在Cyrostore10中冷冻，在-80摄氏度下放置16-24小时，然后在LN2气相下长期保存直至需要使用。
PkH67染色
可透过增殖染料PkH67的稀释来测量细胞分裂。按照制造商的方案进行PkH67(Sigma PKH67GL)染色，例外情况是，第4天制造的细胞以2X浓度染色以把与第7天或第10天制造的细胞相比细胞大小更大的因素考虑进去。在流式细胞术存活性染料染色之前进行PkH染色。
细胞因子敏感性测定法(CSA)
将T细胞产物解冻并在补充有5％人AB血清和100U/mL Benzonase(Sigma E10114)的TexMACS中以1-2x106/ml的浓度静置约4小时。静置期后，用PkH标记细胞，并在Grex24孔烧瓶中培养2x105个淋巴细胞，用IL-7、IL-15或IL-2(R&D Systems 202-IL)滴定，共培养21天。在此期间，每3天至4天透过体积流式细胞术计数细胞，每7天用记忆T细胞板进行表型分型。每7天将细胞因子补充至起始浓度。
流式细胞仪染色和采集
对活细胞进行定量并重悬至溶于PBS中的1-2x106个活细胞/ml，然后根据制造商的方案用活-死染色法进行染色。然后用Flow缓冲液洗涤细胞，之后以所需的抗体浓度重悬细胞(如下列各表所示)，并在摄氏4度下避光染色15-30分钟，例外情况是，CCR7染色在摄氏37度下在没有血清的RPMI(Gibco 11835-030)中进行。然后用Flow缓冲液洗涤细胞并重悬于固定缓冲液中，在摄氏4度下保存直至在BD Fortessa或Miltenyi MACSQuant分析仪上采集。以下各表包括用于所有流式细胞仪染色的试剂。
Figure GDA0002918096550000381
Figure GDA0002918096550000391
Figure GDA0002918096550000392
Figure GDA0002918096550000393
端粒长度测定
根据制造商的说明(Dako/Agilent K5327)测定相对端粒长度。简言之，将T细胞以1∶1的比例与对照1301肿瘤细胞(4N基因组)混合。然后通透化细胞，将端粒PNA FITC探针杂交过夜。次日，进行对比碘化丙啶染色以区分完整的细胞，并透过流式细胞术采集细胞。测试细胞的端粒长度计算为与对照1301肿瘤细胞系端粒长度之比。
CDR3测序(Adaptive Biotech)和T细胞受体可变β链测序分析
使用
Figure GDA0002918096550000402
Assay(Adaptive Biotechnologies，Seattle，WA)法对人TCR β链的CDR3区进行免疫测序。在偏差控制的多重PCR中扩增提取的基因组DNA，然后进行高通量测序。将序列折叠并过滤，以鉴定和定量每个独特TCRβ CDR3区域的绝对丰度，以用于进一步的分析。
TCR-β测序结果的统计学分析
克隆性定义为1-Peilou均匀度，并透过以下公式计算生产性重排：
Figure GDA0002918096550000401
其中pi为重排i的比例丰度，N为重排的总数。克隆性数值范围为0至1，可描述频率分布的形状：克隆性数值接近0表示频率分布非常均匀，而该数值接近1表示分布越来越不对称，其中少数克隆出现频率高。统计学分析使用R版本3.2进行。
RNAseq(Novogene)数据分析
下游分析使用包括STAR、HTseq、Cufflink和我们打包的脚本在内的程序组合进行。使用Tophat程式解析比对，透过DESeq2/edgeR确定差异表达。GO和KEGG富集用ClusterProfiler实施。透过Star-fusion和rMATS软体检测基因融合和可变剪接事件的差异。映射至参考基因组的RNAseq(Novogene)读数
参考基因组和基因模型说明文件直接从基因组网站浏览器(NCBI/UCSC/Ensembl)上下载。参考基因组的索引使用STAR构建，并使用STAR(v2.5)将配对末端清洁读数与参考基因组进行比对。STAR使用Maximal Mappable Prefix(MMP)方法，可为接合读数生成精确的映射结果。
基因表达水平RNAseq(Novogene)定量
使用HTSeq v0.6.1对每个基因的映射读数数量进行计数。然后根据基因的长度以及映射至该基因的读数计数计算每个基因的FPKM。FPKM(每百万映射读数外显子模型的每千碱基读数)同时考虑了测序深度和基因长度对读数计数的影响，是估计基因表达水平的常用方法。RNAseq(Novogene)差异表达分析
对于具有生物学重复物的DESeq2，使用DESeq2 R包(2_1.6.3)进行两个条件/组(每个条件两个生物学重复物)之间的差异表达分析。DESeq2是使用基于负二项分布的模型确定数位基因表达数据中差异表达的常规统计方法。使用控制假发现率(FDR)的Benjamini和Hochberg方法调整所得的p值。DESeq2发现调整后p值＜0.05的基因被指定为差异表达基因。
对于无生物学重复物的edgeR，每个测序文库在差异基因表达分析之前，透过一个缩放归一化因子用edgeR程式包调整读数计数。使用edgeR R包(3.16.5)对两个条件进行差异表达分析。使用Benjamini&Hochberg方法调整p值。校正后p值0.05和绝对倍数变化1设定为显著差异表达的阈值。
RNAseq(Novogene)相关性
为了可以进行对数调整，具有0个FPKM的基因赋值为0.001。使用R中的cor.test函数并设定选项alternative(替代值)＝“greater(更大)”和method(方法)＝“Spearman”来确定相关性。
RNAseq(Novogene)聚簇
为了识别差异之间的相关性，使用表达水平FPKM聚簇不同样本以了解相关性，其使用有热图功能的层次聚簇距离法、使用轮廓系数的SOM(自组织映射)和kmeans来适应R中含默认参数的最优分类。
差异表达基因的RNAseq(Novogene)GO和KEGG富集分析
差异表达基因的基因本体论(GO)富集分析透过聚簇Profiler R包实施，所述软体包中对基因长度偏差进行了校正。校正后p值小于0.05的GO术语被认为显著富集差异表达基因。
KEGG是一个数据库资源，用于从分子水平资讯(特别是基因组测序和其他高通量产出实验技术生成的大规模分子数据集)中了解生物系统(如，细胞、生物体和生态系统)的高级别功能和效用。Cluster Profiler R包用于测试KEGG途径中差异表达基因的统计学富集。本公开的优点包括细胞因子敏感性测定法，其可用于确定通哪些类型的体外制造T细胞透过以高通量患者特异性方式增加转移细胞的增殖和存活以及减少凋亡从而可能在体内持续存在，因而改善肿瘤消退并提高ACT的疗效。
序列名单
<110> 伊玛提克斯美国公司
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val
1 5
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Val Ile Phe Glu Gly Glu Pro Met Tyr Leu
1 5 10
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Ser Leu Phe Glu Ser Leu Glu Tyr Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Ser Leu Leu Asn Gln Pro Lys Ala Val
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Gly Leu Ala Glu Phe Gln Glu Asn Val
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Lys Leu Leu Ala Val Ile His Glu Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Thr Leu Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Lys Leu Gln Glu Lys Ile Gln Glu Leu
1 5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Ser Val Leu Glu Lys Glu Ile Tyr Ser Ile
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Arg Val Ile Asp Asp Ser Leu Val Val Gly Val
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<213> Homo sapiens
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Val Leu Phe Gly Glu Leu Pro Ala Leu
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<213> Homo sapiens
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Gly Leu Val Asp Ile Met Val His Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Phe Leu Asn Ala Ile Glu Thr Ala Leu
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<211> 9
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<213> Homo sapiens
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Ala Leu Leu Gln Ala Leu Met Glu Leu
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<213> Homo sapiens
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Ala Leu Ser Ser Ser Gln Ala Glu Val
1 5
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<213> Homo sapiens
<400> 42
Ser Leu Ile Thr Gly Gln Asp Leu Leu Ser Val
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<213> Homo sapiens
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Gln Leu Ile Glu Lys Asn Trp Leu Leu
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<213> Homo sapiens
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Leu Leu Asp Pro Lys Thr Ile Phe Leu
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<213> Homo sapiens
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Arg Leu His Asp Glu Asn Ile Leu Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Tyr Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val
1 5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Gly Leu Leu Pro Ser Ala Glu Ser Ile Lys Leu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Lys Thr Ala Ser Ile Asn Gln Asn Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Tyr Leu Met Asp Asp Phe Ser Ser Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Leu Met Tyr Pro Tyr Ile Tyr His Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Lys Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu
1 5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Leu Leu Trp Gly His Pro Arg Val Ala Leu Ala
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<213> Homo sapiens
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Val Leu Asp Gly Lys Val Ala Val Val
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<211> 9
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<213> Homo sapiens
<400> 56
Gly Leu Leu Gly Lys Val Thr Ser Val
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Lys Met Ile Ser Ala Ile Pro Thr Leu
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<213> Homo sapiens
<400> 58
Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala Thr
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<213> Homo sapiens
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Thr Leu Asn Thr Leu Asp Ile Asn Leu
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<213> Homo sapiens
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Val Ile Ile Lys Gly Leu Glu Glu Ile
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<213> Homo sapiens
<400> 61
Tyr Leu Glu Asp Gly Phe Ala Tyr Val
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<211> 11
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<213> Homo sapiens
<400> 62
Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val
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<213> Homo sapiens
<400> 63
Leu Leu Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met
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<213> Homo sapiens
<400> 64
Ile Ser Leu Asp Glu Val Ala Val Ser Leu
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val
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<211> 11
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<213> Homo sapiens
<400> 66
Lys Leu Ile Gly Asn Ile His Gly Asn Glu Val
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Ile Leu Leu Ser Val Leu His Gln Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Leu Asp Ser Glu Ala Leu Leu Thr Leu
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<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Val Leu Gln Glu Asn Ser Ser Asp Tyr Gln Ser Asn Leu
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
His Leu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Ala Gln Val
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<211> 9
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<213> Homo sapiens
<400> 71
Ser Leu Val Glu Asn Ile His Val Leu
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<213> Homo sapiens
<400> 72
Tyr Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu
1 5
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<213> Homo sapiens
<400> 73
Ser Leu Ser Glu Lys Ser Pro Glu Val
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<213> Homo sapiens
<400> 74
Ala Met Phe Pro Asp Thr Ile Pro Arg Val
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Phe Leu Ile Glu Asn Leu Leu Ala Ala
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Phe Thr Ala Glu Phe Leu Glu Lys Val
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Ala Leu Tyr Gly Asn Val Gln Gln Val
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Leu Phe Gln Ser Arg Ile Ala Gly Val
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Ile Leu Ala Glu Glu Pro Ile Tyr Ile Arg Val
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Phe Leu Leu Glu Arg Glu Gln Leu Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 81
Leu Leu Leu Pro Leu Glu Leu Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Ser Leu Ala Glu Thr Ile Phe Ile Val
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
Ala Ile Leu Asn Val Asp Glu Lys Asn Gln Val
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Arg Leu Phe Glu Glu Val Leu Gly Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
Tyr Leu Asp Glu Val Ala Phe Met Leu
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Lys Leu Ile Asp Glu Asp Glu Pro Leu Phe Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Lys Leu Phe Glu Lys Ser Thr Gly Leu
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Ser Leu Leu Glu Val Asn Glu Ala Ser Ser Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val
1 5 10
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 90
Gly Leu Tyr Pro Val Thr Leu Val Gly Val
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Ala Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Thr Leu Leu Glu Gly Ile Ser Arg Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Glu Glu Leu
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
Ala Leu Tyr Val Gln Ala Pro Thr Val
1 5
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 95
Lys Leu Ile Tyr Lys Asp Leu Val Ser Val
1 5 10
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapiens
<400> 97
Ser Leu Leu Asp Tyr Glu Val Ser Ile
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Leu Leu Gly Asp Ser Ser Phe Phe Leu
1 5
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Val Ile Phe Glu Gly Glu Pro Met Tyr Leu
1 5 10
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Pro Tyr Leu
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 101
Phe Leu Phe Val Asp Pro Glu Leu Val
1 5
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Ser Glu Trp Gly Ser Pro His Ala Ala Val Pro
1 5 10
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
Ala Leu Ser Glu Leu Glu Arg Val Leu
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Ser Leu Phe Glu Ser Leu Glu Tyr Leu
1 5
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val
1 5
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Val Leu Leu Asn Glu Ile Leu Glu Gln Val
1 5 10
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Ser Leu Leu Asn Gln Pro Lys Ala Val
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Lys Met Ser Glu Leu Gln Thr Tyr Val
1 5
<210> 109
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Ala Leu Leu Glu Gln Thr Gly Asp Met Ser Leu
1 5 10
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Val Ile Ile Lys Gly Leu Glu Glu Ile Thr Val
1 5 10
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Lys Gln Phe Glu Gly Thr Val Glu Ile
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Lys Leu Gln Glu Glu Ile Pro Val Leu
1 5
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Gly Leu Ala Glu Phe Gln Glu Asn Val
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Asn Val Ala Glu Ile Val Ile His Ile
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
Ala Leu Ala Gly Ile Val Thr Asn Val
1 5
<210> 116
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Asn Leu Leu Ile Asp Asp Lys Gly Thr Ile Lys Leu
1 5 10
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 117
Val Leu Met Gln Asp Ser Arg Leu Tyr Leu
1 5 10
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 118
Lys Val Leu Glu His Val Val Arg Val
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 119
Leu Leu Trp Gly Asn Leu Pro Glu Ile
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Ser Leu Met Glu Lys Asn Gln Ser Leu
1 5
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121
Lys Leu Leu Ala Val Ile His Glu Leu
1 5
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122
Ala Leu Gly Asp Lys Phe Leu Leu Arg Val
1 5 10
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Phe Leu Met Lys Asn Ser Asp Leu Tyr Gly Ala
1 5 10
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Lys Leu Ile Asp His Gln Gly Leu Tyr Leu
1 5 10
<210> 125
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Gly Pro Gly Ile Phe Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro
1 5 10
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
Ala Leu Asn Glu Ser Leu Val Glu Cys
1 5
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 127
Gly Leu Ala Ala Leu Ala Val His Leu
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
Leu Leu Leu Glu Ala Val Trp His Leu
1 5
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 129
Ser Ile Ile Glu Tyr Leu Pro Thr Leu
1 5
<210> 130
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130
Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu
1 5
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 131
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 132
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
Phe Leu Leu Asp Lys Pro Gln Asp Leu Ser Ile
1 5 10
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 133
Tyr Leu Leu Asp Met Pro Leu Trp Tyr Leu
1 5 10
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134
Gly Leu Leu Asp Cys Pro Ile Phe Leu
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 135
Val Leu Ile Glu Tyr Asn Phe Ser Ile
1 5
<210> 136
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 136
Thr Leu Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Val
1 5 10
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 137
Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Val
1 5
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 138
Lys Leu Gln Glu Glu Leu Asn Lys Val
1 5
<210> 139
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 139
Lys Leu Met Asp Pro Gly Ser Leu Pro Pro Leu
1 5 10
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 140
Ala Leu Ile Val Ser Leu Pro Tyr Leu
1 5
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 141
Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ala Asn Val
1 5
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 142
Ala Leu Asp Pro Ser Gly Asn Gln Leu Ile
1 5 10
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 143
Ile Leu Ile Lys His Leu Val Lys Val
1 5
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 144
Val Leu Leu Asp Thr Ile Leu Gln Leu
1 5
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 145
His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala
1 5
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
Ser Met Asn Gly Gly Val Phe Ala Val
1 5
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 147
Met Leu Ala Glu Lys Leu Leu Gln Ala
1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 148
Tyr Met Leu Asp Ile Phe His Glu Val
1 5
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 149
Ala Leu Trp Leu Pro Thr Asp Ser Ala Thr Val
1 5 10
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 150
Gly Leu Ala Ser Arg Ile Leu Asp Ala
1 5
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 151
Ser Tyr Val Lys Val Leu His His Leu
1 5
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 152
Val Tyr Leu Pro Lys Ile Pro Ser Trp
1 5
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 153
Asn Tyr Glu Asp His Phe Pro Leu Leu
1 5
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 154
Val Tyr Ile Ala Glu Leu Glu Lys Ile
1 5
<210> 155
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 155
Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe
1 5 10
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 156
Val Leu Ser Pro Phe Ile Leu Thr Leu
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 157
His Leu Leu Glu Gly Ser Val Gly Val
1 5

Claims (52)

1.权利要求内容为：
一种产生T细胞的方法，其包括：
从至少一个个体中获得T细胞，
激活T细胞，
将激活T细胞的第一部分扩增一段时间，
在存在至少一种细胞因子的情况下培养扩增T细胞，
在培养T细胞中测量细胞因子反应，
确定产生最大细胞因子反应的该段时间，和
使激活T细胞的第二部分扩增产生最大细胞因子反应的该段时间。
2.权利要求1所述的方法，其还包括在培养之前冷冻激活T细胞的扩增第一部分。
3.权利要求2所述的方法，其还包括在培养之前解冻激活T细胞的冷冻扩增第一部分。
4.权利要求3所述的方法，其还包括在培养之前静置激活T细胞的解冻扩增第一部分。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中T细胞被合有抗CD3抗体和抗CD28抗体的刺激物激活。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该段时间为激活后约1天至约15天、约2天至约14天、约3天至约13天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约6天或约4天至约5天。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述至少一种细胞因子选自白细胞介素2(IL2)、白细胞介素7(IL7)、白细胞介素15(IL15)及其组合组成的组。
8.权利要求7所述的方法，其中IL-2的浓度为约10U/ml至约500U/ml、约10U/ml至约450U/ml、约10U/ml至约400U/ml、约10U/ml至约350U/ml、约10U/ml至约300U/ml、约10U/ml至约250U/ml、约10U/ml至约200U/ml、约10U/ml至约150U/ml、约10U/ml至约100U/ml、约10U/ml至约50U/ml、约20U/ml至约40U/ml、约25U/ml至约35U/ml或约30U/ml至约35U/ml。
9.权利要求7所述的方法，其中IL-7的浓度为0.1ng/ml至50ng/ml、0.1ng/ml至45ng/ml、0.1ng/ml至40ng/ml、0.1ng/ml至35ng/ml、0.1ng/ml至30ng/ml、0.1ng/ml至25ng/ml、0.1ng/ml至20ng/ml、0.1ng/ml至15ng/ml、0.1ng/ml至10ng/ml、0.1ng/ml至5ng/ml、0.1ng/ml至4ng/ml、0.1ng/ml至3ng/ml、0.1ng/ml至2ng/ml、0.1ng/ml至1ng/ml或0.1ng/ml至0.5ng/ml。
10.权利要求7所述的方法，其中IL-15的浓度为0.1ng/ml至50ng/ml、0.1ng/ml至45ng/ml、0.1ng/ml至40ng/ml、0.1ng/ml至35ng/ml、0.1ng/ml至30ng/ml、0.1ng/ml至25ng/ml、0.1ng/ml至20ng/ml、0.1ng/ml至15ng/ml、0.1ng/ml至10ng/ml、0.1ng/ml至5ng/ml、0.1ng/ml至4ng/ml、0.1ng/ml至3ng/ml、0.1ng/ml至2ng/ml、0.1ng/ml至1ng/ml或0.1ng/ml至0.5ng/ml。
11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述细胞因子反应选自幼稚T细胞(TN)和/或干记忆T细胞(Tscm)/T中央记忆(Tcm)的增殖增加、细胞凋亡减少、细胞群增加及其组合的一种或多种。
12.权利要求4所述的方法，其中，静置在约0.5小时至约48小时、约0.5小时至约36小时、约0.5小时至约24小时、约0.5小时至约18小时、约0.5小时至约12小时、约0.5小时至约6小时、约1小时至约6小时、约2小时至约5小时、约3小时至约5小时、约4小时至约6小时、约1小时至约24小时、约2至约24小时、约12至约48小时、约0.5小时至约120小时、约0.5小时至约108小时、约0.5小时至约96小时、约0.5小时至约84小时、约0.5小时至约72小时或约0.5小时至约60小时的一段时间内进行。
13.权利要求5所述的方法，其中，抗CD3抗体和抗CD28抗体各自的浓度为约0.1μg/ml至约10.0μg/ml、约0.1μg/ml至约8.0μg/ml、约0.1μg/ml至约6.0μg/ml、约0.1μg/ml至约4.0μg/ml、约0.1μg/ml至约2.0μg/ml、约0.1μg/ml至约1.0μg/ml、约0.1μg/ml至约0.8μg/ml、约0.1μg/ml至约0.6μg/ml、约0.1μg/ml至约0.5μg/ml、约0.1μg/ml至约0.25μg/ml、约0.2μg/ml至约0.5μg/ml、约0.2μg/ml至约0.3μg/ml、约0.3μg/ml至约0.5μg/ml、约0.3μg/ml至约0.4μg/ml或约0.4μg/ml至约0.5μg/ml。
14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，激活在约1小时至约120小时、约1小时至约108小时、约1小时至约96小时、约1小时至约84小时、约1小时至约72小时、约1小时至约60小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约2小时至约24小时、约4小时至约24小时、约6小时至约24小时、约8小时至约24小时、约10小时至约24小时、约12小时至约24小时、约12小时至约72小时、约24小时至约72小时、约6小时至约48小时、约24小时至约48小时、约6小时至约72小时或约1小时至约12小时的时间段内进行。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述获得的T细胞为CD3+CD8+T细胞。
16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其还包括收集激活T细胞的扩增第二部分用于输注至所述至少一名供体、患者或个体。
17.一种治疗癌症患者的方法，包括向该患者给予有效量的权利要求1-16中任一项所述的收集的激活T细胞的扩增第二部分。
18.权利要求17所述的方法，其中T细胞从患者身上获得。
19.权利要求17所述的方法，其中T细胞从健康供体身上获得。
20.权利要求17所述的方法，其中所述癌症选自肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和子宫癌(UEC)所组成的组。
21.一种药物组合物，其包含权利要求1-16中任一项所述的收集的激活T细胞的扩增第二部分和药用载剂。
22.一种增加T细胞生长的方法，其包括：
从至少一名健康供体、患者或个体获得T细胞，
激活T细胞，
激活后扩增激活T细胞约3天至约5天，
收集扩增T细胞用于输注至所述至少一名健康供体、患者或个体，
其中，相较于激活后扩增约7天或更长时间的激活T细胞，扩增约3天至约5天的T细胞生长较多。
23.权利要求22所述的方法，其中所述T细胞在激活后扩增约4天，并且其中T细胞的生长大于激活后扩增约7天或更长时间的激活T细胞。
24.权利要求22-23中任一项所述的方法，其中所述扩增T细胞为CD4+和/或CD8+T细胞。
25.权利要求22-24中任一项所述的方法，其中T细胞被含有抗CD3抗体和抗CD28抗体的刺激物激活。
26.权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述扩增约3天至约5天的T细胞用于需要癌症治疗患者的过继免疫疗法，其中所述癌症选自肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和子宫癌(UEC)所组成的组。
27.一种减少过继免疫疗法中所用T细胞的细胞死亡的方法，其包括：
从至少一名健康供体、患者或个体获得T细胞，
激活T细胞，
激活后扩增激活T细胞约3天至约5天，
收集扩增T细胞用于输注至所述至少一名健康供体、患者或个体，
其中，相较于激活后扩增约7天或更长时间的激活T细胞，扩增约3天至约5天的T细胞的细胞死亡减少。
28.权利要求27所述的方法，其中所述扩增T细胞为CD4+和/或CD8+T细胞。
29.权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述表现为幼稚T细胞(TN)和/或干记忆T细胞(Tscm)/T中央记忆(Tcm)表型的扩增T细胞数量多于激活后扩增长于约7天时间的激活T细胞。
30.一种用于产生改善过继免疫疗法疗效的T细胞的方法，包括：
从至少一名健康供体、患者或个体获得T细胞，
激活T细胞，
激活后扩增激活T细胞约3天至约5天，
收集扩增T细胞用于输注至所述至少一名健康供体、患者或个体，
其中，相较于激活后扩增约7天或更长时间的激活T细胞，扩增约3天至约5天的T细胞的过继免疫疗法疗效得到改善。
31.权利要求30所述的方法，其中所述T细胞在激活后扩增约4天，并且其中T细胞的过继免疫疗法疗效大于激活后扩增约7天或更长时间的激活T细胞。
32.权利要求30-31中任一项所述的方法，其中所述扩增T细胞为CD4+和/或CD8+T细胞。
33.权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述扩增T细胞表现为幼稚T细胞(TN)和/或干记忆T细胞(Tscm)/T中央记忆(Tcm)表型。
34.权利要求30-33中任一项所述的方法，其中T细胞被合有抗CD3抗体和抗CD28抗体的刺激物激活。
35.权利要求30-34中任一项所述的方法，其中所述扩增约3天至约5天的T细胞用于需要癌症治疗患者的过继免疫疗法，其中所述癌症选自肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和子宫癌(UEC)所组成的组。
36.权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述相较于激活后扩增约7天或更长时间的激活T细胞，扩增约3天至约5天的T细胞表现增殖和存活增加。
37.权利要求1、22、27和30中任一项所述的方法，其还包括在扩增前使用病毒载体转导激活的T细胞，其中所述病毒载体是表达T细胞受体(TCR)的逆转录病毒载体。
38.权利要求37所述的方法，其中病毒载体是表达T细胞受体(TCR)的慢病毒载体。
39.一种T细胞群，其透过权利要求1、22、27和30中任一项所述的方法产生。
40.一种T细胞群，其透过权利要求1-16中任一项所述的方法产生。
41.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述培养在没有抗原提呈细胞下进行。
42.权利要求41所述的方法，其中所述培养以约1,000至约1x106个细胞/cm2、约1,000至约500,000个细胞/cm2、约1,000至约250,000个细胞/cm2、约1,000至约200,000个细胞/cm2、约1,000至约150,000个细胞/cm2、约1,000至约100,000个细胞/cm2、约1,000至约50,000个细胞/cm2、约1,000至约10,000个细胞/cm2或约1,000至约5,000个细胞/cm2的密度接种扩增T细胞。
43.权利要求41所述的方法，其中所述培养包括以约1,000至约200,000个细胞/cm2、约1,000至约150,000个细胞/cm2或约1,000至约100,000个细胞/cm2的密度接种扩增T细胞。
44.一种实体瘤中T细胞体内持久性的预测方法，其包括：
解冻扩增多个扩增时间的冷冻保存T细胞，
在不存在细胞因子的情况下静置解冻T细胞，
接种静置的T细胞，
培养接种T细胞至少一个周期时间，
其中，在至少一个周期时间开始时，将一种或多种细胞因子加入培养物中，以及
其中，在至少一个周期时间结束时，所述的一种或多种加入细胞因子被耗尽，
在至少一个周期时间内的多个时间点对培养T细胞进行取样，
测量取样T细胞的细胞因子反应，
从多个扩增时间确定表现出最大细胞因子反应的取样T细胞的扩增时间，和
将扩增确定扩增时间的T细胞配制为用于治疗实体瘤的组合物。
45.权利要求44所述的方法，其中所述T细胞在激活后扩增约1天至约15天、约2天至约14天、约3天至约13天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约6天或约4天至约5天。
46.权利要求44-45中任一项所述的方法，其中，所述静置在约0.5小时至约48小时、约0.5小时至约36小时、约0.5小时至约24小时、约0.5小时至约18小时、约0.5小时至约12小时、约0.5小时至约6小时、约1小时至约6小时、约2小时至约5小时、约3小时至约5小时、或约1小时至约24小时、约2至约24小时、约12至约48小时、约0.5小时至约120小时、约0.5小时至约108小时、约0.5小时至约96小时、约0.5小时至约84小时、约0.5小时至约72小时或约0.5小时至约60小时的一段时间内进行。
47.权利要求44-46中任一项所述的方法，其中，所述接种以约1,000至约200,000个细胞/cm2、约1,000至约150,000个细胞/cm2或约1,000至约100,000个细胞/cm2的密度进行。
48.权利要求44-47中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自白细胞介素2(IL2)、白细胞介素7(IL7)、白细胞介素15(IL15)及其组合组成的组。
49.权利要求44-48中任一项所述的方法，其中所述一个周期时间为每个周期1-10天、每个周期2-10天、每个周期3-10天、每个周期4-10天、每个周期5-10天、每个周期6-10天、每个周期7-10天、每个周期8-10天或每个周期9-10天。
50.权利要求44-49中任一项所述的方法，其中所述至少一个周期时间为1个周期时间、2个周期时间、3个周期时间、4个周期时间、5个周期时间、6个周期时间、7个周期时间、8个周期时间、9个周期时间或10个周期时间。
51.权利要求44-50中任一项所述的方法，其中所述细胞因子反应选自幼稚T细胞(TN)和/或干记忆T细胞(Tscm)/T中央记忆(Tcm)的增殖增加、细胞凋亡减少、细胞群增加及其组合的一种或多种。
52.权利要求44-51中任一项所述的方法，其中所述实体瘤选自肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)和子宫癌(UEC)所组成的组。
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