CN110747166B - 一种外周血t细胞的体外扩增培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种外周血T细胞的体外扩增培养方法，其培养基由基本培养基、胎牛血清、白介素‑2、白介素‑15、人CD3单克隆抗体和人CD28单克隆抗体组成。本发明从外周血中分离得到的T细胞，经过一个周期的激活与扩增培养，即可获得足够体外功能实验的细胞量，经过7天的扩增，T细胞数量达到起始量的40‑50倍，经过14‑22天的扩增，细胞数量更是可达到起始量的80‑200倍，对于难扩增的CAR‑T细胞，更是能在体外感染后第22天扩增至起始量的60‑80倍，其数量远远多于初始分离量。本发明中T细胞以及CAR‑T细胞的激活/扩增是通过培养基中的单克隆抗体及细胞因子的刺激实现的，不需要抗原呈递细胞或特异性抗原或磁珠，操作简单，培养成本大幅下降。

Description

一种外周血T细胞的体外扩增培养方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种外周血T细胞的体外扩增培养方法。

背景技术

就其本质而言，人癌细胞来源于正常细胞，这些细胞经历了遗传或表观遗传变异而成癌细胞。癌细胞常常表达其特有的蛋白质，俗称肿瘤特异性抗原或肿瘤相关性抗原。这些异常的肿瘤抗原可被人体先天免疫系统特异性识别并进一步杀死癌细胞。然而，癌细胞采用各种机制来阻止免疫细胞如T和B淋巴细胞识别癌细胞。人T细胞疗法依赖于体外富集并经过修饰的人T细胞靶向和杀死受试者(例如患者)中的癌细胞。已经开发的各种技术能够富集靶向肿瘤抗原的天然存在的T细胞或者通过基因修饰T细胞以特异性靶向己知的癌症抗原，并在体外刺激和/或扩大它们，然后再将它们注入病人体内，这些疗法己被证实对肿瘤大小和患者存活具有疗效。

另外，在各种免疫治疗方式中，免疫检查点疗法是近几年获得突出疗效的治疗方法。免疫检查点是一类免疫抑制性的分子，可以调节免疫反应的强度和广度，从而避免正常组织的损伤和破坏，在肿瘤的发生、发展过程中，免疫检查点成为免疫耐受的主要原因之一。免疫检查点疗法就是通过共抑制或共刺激信号等一系列途径以T细胞活性来提高抗肿瘤免疫反应的治疗方法。许多免疫检查点分子在T细胞上都有表达，例如CTLA-4(cytotoxicT-lymphocyte-associated protein 4，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，PD-1(programmedcell deathprotein 1，程序化细胞死亡蛋白1)等。然而体内存在的T细胞，体外获取后数量少，纯度不高，且细胞增殖能力低。因此，探索体外诱导和扩增高纯度T细胞，建立更有效的细胞增殖培养方法，并在短期内获得有功能的T细胞，是顺利开展免疫检查点与共刺激信号分子抗体药物体外功能实验的重要前提。

体内T细胞活化抗原扩张通常被认为是两个信号过程，第一个信号是由T细胞受体/CD3结合主要组织相容性复合体一类或二类分子(MHC I类或MHC II类)呈递的抗原肽产生的。MHC I类或MHC II类及其多肽复合物在细胞表面(抗原呈递细胞或APC)表达。抗原肽来源于细胞内经历内源性加工的分子，除此之外，还可以是：(1)自然存在于体内的“自身”抗原；(2)与癌症有关的突变引起的肿瘤抗原；(3)与感染或癌症有关的病毒抗原。第二个信号来自于联合刺激，联合刺激是由T细胞上的表面分子与抗原呈递细胞(Antigenpresenting cell，APC)上的表面分子相互作用而来的。这些共刺激分子在T细胞和APC之间的上调和相互作用可能是影响或增强T细胞激活的必要条件，因为第一个信号可能不足以单独实现这一点。这两个信号的激活可能会导致T细胞的扩增，从而使更多的抗原特异性T细胞能够控制引起免疫反应的病原体或癌症。体外激活和扩增T细胞一直是一个漫长、复杂和资源密集型的过程。一个典型的过程可能需要8-12周，通常使用活的“目标”病毒和/或病毒载体通过APC实现抗原呈递。

随着越来越多过继性T细胞疗法在肿瘤治疗中被应用，T细胞的体外扩增也越来越受到关注。合适的体外扩增培养方法可以使T细胞处于活化状态，并保证其后续的治疗效果。在临床环境中刺激和扩增T细胞有多种方法，其中常规方法是使用CD3/CD28抗体包被磁珠进行刺激，虽然这一方法显示出了良好的刺激效果，但也暴露出其价格昂贵、操作复杂等缺点。现有的商品化CD3/CD28免疫磁珠价格往往达到2-3万元，而T细胞制品在临床应用上一般每次用量需要达到10⁸-10⁹数量级，培养成本很高；同时，操作步骤较多，有时为了提高刺激强度还需要多次与磁珠孵育、反复清洗，而这一过程中又进一步提高了成本。因此免疫磁珠法刺激培养T细胞在临床应用上具有一定局限性，特别是在未来进行工业化大规模生产时尤为不利。2017年FDA批准了两款CAR-T产品上市，为血液瘤患者带了新希望，但其售价却分别高达47.3万美元(Kymriah)和37.3万美元(Yescarta)，这无疑增加了患者和CAR-T产业发展的负担。为了保证过继性T细胞疗法的广泛应用和大规模生产，亟需优化生产方式，其中就包括了T细胞的体外扩增和培养方式，在使T细胞，甚至是CAR-T细胞保持活性及扩增效率的同时，最大限度降低培养成本。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种外周血T细胞的体外扩增培养方法。

本发明的另一目的在于提供一种外周血T细胞体外扩增培养基。

本发明的技术方案如下：

一种外周血T细胞的体外扩增培养方法，包括如下步骤：

(1)在无血清免疫细胞培养基X-VIVO 15中加入9-11％的胎牛血清，再加入白介素-2、白介素-15、人CD3单克隆抗体和人CD28至终浓度依次为50-100μg/L、50-100μg/L、10-50μg/L和10-50μg/L，获得外周血T细胞体外扩增培养基；

(2)采用肝素抗凝常规采血手段采集血液；

(3)使用Ficoll密度梯度离心法从采集到的上述血液中离心分离出数量为1.8-2.2×10⁷的外周淋巴细胞，将该外周淋巴细胞与上述外周血T细胞体外扩增培养基在36-37℃且4.5-5.5％CO₂的条件下静置孵育2-4d；

(4)将步骤(3)所得的培养物进行离心以收集所有细胞，将该所有细胞加入新鲜的上述外周血T细胞体外扩增培养基中以5×10⁵-5×10⁶个细胞/mL的培养密度继续于36-37℃且4.5-5.5％CO₂的条件下培养2-3d，获得CD3阳性为90％以上且数量达到2×10⁸的T细胞，进行冻存或继续扩大培养；

(5)根据需要将步骤(4)所得的T细胞进行复苏或继续扩大培养，其中，复苏时用新鲜的上述外周血T细胞体外扩增培养基以1×10⁶个细胞/mL的培养密度重新刺激冻存的上述T细胞，促进T细胞的再次激活扩增；复苏之后的培养或上述继续扩大培养的具体培养为：每2-3d以5×10⁵-5×10⁶个细胞/mL的培养密度接种换液，培养至细胞数达到目的扩增量，收集细胞，培养条件与步骤(4)相同。

上述步骤(5)之后，可制备TIL或者利用慢病毒感染方式感染获得并扩增T细胞以制备CAR-T或TCR-T，并使用体外混合淋巴反应实验、流式细胞术及细胞因子检测鉴定其CAR-T或TCR-T细胞的效应功能。在体外混合淋巴反应实验中，对于可贴壁肿瘤细胞可采用多功能实时无标记细胞分析仪(real time cell analysis，RTCA)。RTCA是一种实时、无标记、无创伤自动连续监测细胞增殖、迁移和生长状态的方法。在E-plate培养板中以T细胞或CAR-T效应细胞与肿瘤细胞的比例为1∶1，3∶1，6∶1，10∶1下，分别加入T细胞或CAR-T细胞与肿瘤细胞，设置肿瘤细胞(不含T细胞)作为空白对照，将E-plate细胞培养板放入RTCA分析仪中，再放置于37℃，5％CO₂浓度的细胞培养箱中培养3天后，以检测CAR-T或TCR-T对肿瘤细胞的杀伤能力。另外利用ELISA方法检测细胞培养上清中的IFN-γ、TNF-α以及IL-2含量。流式细胞术其特征在于使用anti-CD25和anti-CD69分别检测CAR-T细胞表面CD25和CD69分子，以检测扩增T细胞在转染为CAR-T细胞并与肿瘤细胞识别后的刺激激活作用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述外周血T细胞体外扩增培养基中白介素-2的终浓度为70-80μg/L。

在本发明的一个优选实施方案中，所述外周血T细胞体外扩增培养基中白介素-15的终浓度为70-80μg/L。

在本发明的一个优选实施方案中，所述外周血T细胞体外扩增培养基中人CD3单克隆抗体的终浓度为18-25μg/L。

在本发明的一个优选实施方案中，所述外周血T细胞体外扩增培养基中人CD28单克隆抗体的终浓度为18-25μg/L。

本发明的另一技术方案如下：

一种外周血T细胞体外扩增培养基，由无血清免疫细胞培养基X-VIVO 15、胎牛血清、白介素-2、白介素-15、人CD3单克隆抗体和人CD28单克隆抗体组成，其中，胎牛血清的加入量为无血清免疫细胞培养基X-VIVO 15的9-11％，白介素-2、白介素-15、人CD3单克隆抗体和人CD28单克隆抗体的终浓度依次为50-100μg/L、50-100μg/L、10-50μg/L和10-50μg/L。

在本发明的一个优选实施方案中，所述白介素-2的终浓度为70-80μg/L。

在本发明的一个优选实施方案中，所述白介素-15的终浓度为70-80μh/L。

在本发明的一个优选实施方案中，所述人CD3单克隆抗体的终浓度为18-25μg/L。

在本发明的一个优选实施方案中，所述人CD28单克隆抗体的终浓度为18-25μg/L。

本发明的有益效果是：

1、本发明从外周血中分离得到的T细胞，经过一个周期(14-22天)的激活与扩增培养，即可获得足够体外功能实验的细胞量，经过7天的扩增，T细胞数量达到起始量的40-50倍，经过14-22天的扩增，细胞数量更是可达到起始量的80-200倍，对于难扩增的CAR-T细胞，更是能在体外感染后第22天扩增至起始量的60-80倍，其数量远远多于初始分离量，节约了非常大量的初始血源供应量，并且此扩增过的细胞经过冻存复苏过程后，依旧能保留其生物学功能。

2、本发明中T细胞以及CAR-T细胞的激活/扩增是通过培养基中的单克隆抗体及细胞因子的刺激实现的，不需要抗原呈递细胞或特异性抗原或磁珠，操作简单，培养成本大幅下降。具体来说，制备10⁹数量级T细胞或CAR-T细胞的成本，由传统免疫磁珠法的上万元，降低到了1000-2000元左右。

3、本发明所扩增产生的T细胞的表型与功能稳定，在体外扩增的过程中保留其原有的生物学功能，大大降低其应用于过继性细胞免疫治疗或免疫检查点与共刺激分子抗体药物体外功能实验的难度，为药物筛选与功能鉴定搭建了便捷的平台，其成本较低，操作简单，极大程度上缓解了起始细胞严重不足的问题，也缓解了传统分选与扩增方法得到的是功能近乎丧失的细胞的窘境。

附图说明

图1为本发明实施例1中使用流式细胞术鉴定扩增后T细胞的CD3表型图。

图2为本发明实施例1中扩增后T细胞的细胞增殖数量数据图。

图3为本发明实施例1中使用流式细胞术鉴定扩增后T细胞的CD8表型图。

图4为本发明实施例1中CD8阳性T细胞在脑胶质瘤共孵育下的细胞因子分泌数据图。

图5为本发明实施例2中扩增后EGFR CAR-T细胞的细胞增殖数量数据图。

图6为本发明实施例2中EGFR CAR-T对U87脑胶质瘤的杀伤能力图。

图7为本发明实施例2中EGFR CAR-T细胞在脑胶质瘤共孵育下的细胞因子分泌数据图。

图8为本发明实施例2中.EGFR CAR-T细胞在脑胶质瘤共孵育下的刺激活化作用。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

(1)预先配制外周血T细胞体外扩增培养基：使用无血清免疫细胞培养基X-VIVO15(1L/瓶，Lonza，货号：04-418Q)，加入10％FBS(Gibco，货号：10091-148)，并依次加入浓度为250μg/mL的白介素-2(IL-2，终浓度75μg/L，Sino，货号：11848-HNAY1)，250μg/mL的白介素-15(IL-15，终浓度40μg/L，Sino，货号：10360-H07E)，1mg/mL的人CD3单克隆抗体(Biolegend，货号：300314，终浓度20μg/L)及人CD28单克隆抗体(Biolegend，货号：302914，终浓度20μg/L)，混匀作为T细胞体外扩增培养基。

(2)采用传统方法常规采血手段采集血液(肝素钠抗凝剂)，采集20mL全血；

(3)利用Ficoll密度梯度离心法分离上述全血中的外周血淋巴细胞，方法如下：

i)将1640培养基于37℃水浴锅温浴待用；

ii)Ficoll分离液从4℃冰箱取出，避光放置至室温待用；

iii)将传统方法常规采血手段采集的血液(肝素钠抗凝剂)20mL完全加入进口50mL离心管中，加入等体积的1640培养基混匀；

iv)将步骤(2)里的血样按照血样与Ficoll以2比1的比例处理。具体来说，将放有5mLFicoll分离液的15mL进口离心管倾斜，用移液器将步骤iii)里的血样轻轻打入，慢慢直立离心管；

v)离心20min(450g)；

vi)用1mL的移液管吸取中间白色细胞层，放入15mL离心管，加入1640培养基至10mL左右，离心8min(1700rpm)，获得PBMC，所得到的PBMC(数量大约为2×10⁷)加入20mL外周血T细胞体外扩增培养基重悬置于100mm培养皿板或T75细胞培养瓶，培养密度约为1×10⁶个细胞/mL，然后放入37℃，5％CO₂培养箱静置培养3-4d后，收集所有悬浮细胞，离心去除培养基，

(4)将步骤(3)所得的细胞重悬于新鲜的外周血T细胞体外扩增培养基中(密度为5×10⁵-5×10⁶个细胞/mL)在100mm培养皿板或T75细胞培养瓶中继续培养2-3d，接着提取少量细胞进行细胞膜FITC anti-CD3染色，使用流式细胞术分析。如图1所示，可获得CD3阳性为99％纯度的T细胞，且数量可达到2×10⁸个。T细胞可选择冻存或继续培养。20mL全血中可分离数量为2×10⁷的PBMC，一周内可体外扩增培养获得数量为2×10⁸的T细胞，作为一级细胞库供后续使用。

冻存T细胞方法如下：配制含10％二甲基亚砜(DMSO)的牛血清冻存培养液，混匀，放置于4℃冰箱避光保存待用；将体外扩增培养的T细胞离心5min(1000rpm)，弃去上层培养基，加入适量配制好的冻存培养液，用移液枪轻轻吹打使细胞均匀，调节冻存液中细胞的最终密度为1×10⁷个细胞/mL；将细胞分装入冻存管中，每管0.5mL；将冻存管放入冻存盒并置于-80℃冻存过夜，第二天可将细胞转入冷冻管盒并放置于-80℃常规保存或置于液氮罐长期保存。

(5)根据需要复苏T细胞或继续培养上述T细胞，复苏时使用新鲜的步骤(1)中所述的外周血T细胞体外扩增培养基以培养密度为1×10⁶个细胞/mL重新刺激和培养T细胞(培养条件37℃，5％CO₂)，促进T细胞的再次激活扩增。每2-3d以5×10⁵-5×10⁶个细胞/mL的培养密度接种换液，培养至细胞数达到目的扩增量，收集细胞。T细胞扩增第1、3、4、7、9、12、14、16和22天，分别进行细胞计数。从图2可以看到，经过7d的扩增，CD3阳性T细胞数量达到起始量的40-50倍，经过14-22d的扩增，细胞数量更是可达到起始量的80-200倍，即从起始的5×10⁶个细胞扩增到了4×10⁸-1×10⁹个细胞。在T细胞体外扩增过程中，从第四天开始，细胞进入快速增长期，之后进入稳定增长期(如下表1所示)。

表1.T细胞的增殖时间

T细胞的增长速度，可以为体外功能实验时所需要的细胞总量提供体外扩增总时间的预测与参考。从以上结果来看，用此种扩增方法得到了数量丰富的T细胞。如图3所示，使用扩增后14d的T细胞进行细胞膜APC anti-CD8染色，使用流式细胞术分析可知扩增后CD8阳性T细胞可达到95％。另外利用体外混合淋巴反应实验鉴定T细胞的功能，在12孔细胞培养板中分别加入T细胞与脑胶质瘤细胞U87(1∶1)，分别加入T细胞与肿瘤细胞，设置单独肿瘤细胞(不含T细胞)作为空白对照，将细胞培养板放入37℃，5％CO₂浓度的细胞培养箱中培养3d后，利用ELISA方法检测细胞培养上清中的IFN-γ、TNF-a以及IL-2含量(图4)。ELISA结果显示用以上方法分选并扩增的T细胞依旧保持其特有的生物学功能。

实施例2

从液氮中取出己冻存7d的T细胞(数量为5×10⁶)，使用实施例1中的外周血T细胞体外扩增培养基快速复苏T细胞，以培养密度为1×10⁶个细胞/mL重新刺激T细胞(培养条件37℃，5％CO₂)，促进T细胞的再次激活扩增。2-3d后以5×10⁵-5×10⁶个细胞/mL的培养密度接种换液，在培养至第3-4天时，利用慢病毒载体PCDH lentiviral vector对复苏后T细胞进行感染获得靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞(EGFR CAR-T)，使用上述T细胞体外扩增培养基对制备的CAR-T进行常规培养，每2-3d以5×10⁵-5×10⁶个细胞/mL的培养密度接种换液，通过细胞计数可得(图5)CAR-T细胞在体外第22d可扩增至起始量的60-80倍，即从起始的2.5×10⁵个细胞扩增到了1.5×10⁸-2×10⁸个细胞。

采用多功能实时无标记细胞分析仪(real time cell analysis，RTCA)监测细胞增殖、迁移和生长状态以鉴定EGFR CAR-T细胞的功能。在E-plate培养板中以EGFR CAR-T效应细胞与EGFR高表达的脑胶质瘤细胞的比例(Effector T cell/Tumor cell(E/T))为1∶1，3∶1，6∶1，10∶1下，分别加入EGFR CAR-T细胞与脑胶质瘤细胞，设置单独肿瘤细胞(不含T细胞)作为空白对照，将E-plate细胞培养板放入RTCA分析仪中，再放置于37℃，5％CO₂浓度的细胞培养箱中培养3d，检测使用T细胞培养基扩增后的CAR-T细胞的杀伤能力。图6显示随着E/T值的升高，EGFR CAR-T细胞对脑胶质瘤细胞株U87的杀伤能力逐渐增强；24h后，EGFRCAR-T细胞对U87就己表现出强效的特异性杀伤作用，96h后，EGFR CAR-T在E/T为10：1的培养下其杀伤率可达100％。收集CAR-T细胞与肿瘤细胞的培养上清，利用ELISA方法检测细胞培养上清中的IFN-γ、TNF-α以及IL-2含量(图7)。采用流式细胞术，使用anti-CD25和anti-CD69分别检测CAR-T细胞表面CD25和CD69分子，以检测扩增T细胞在转染为CAR-T细胞，并与肿瘤细胞识别后的刺激激活作用(图8)。以上结果显示CAR-T细胞在体外扩增后具有识别特异性肿瘤细胞并发挥抗肿瘤的生物学功能，特别是在经历了冻存复苏过程后，依旧保持其肿瘤抑制性的生物学功能。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (2)

1.一种外周血T细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）在无血清免疫细胞培养基X-VIVO 15中加入10%的胎牛血清，再加入白介素-2、白介素-15、人CD3单克隆抗体和人CD28单克隆抗体至终浓度依次为75 μg/L、40 μg/L、20 μg/L和20 μg/L，获得外周血T细胞体外扩增培养基；

（2）采用肝素抗凝常规采血手段采集血液；

（3）使用Ficoll密度梯度离心法从采集到的上述血液中离心分离出数量为1.8-2.2 ×10⁷的外周淋巴细胞，将该外周淋巴细胞与上述外周血T细胞体外扩增培养基在36-37 ℃且4.5-5.5% CO₂的条件下静置孵育2-4 d；

（4）将步骤（3）所得的培养物进行离心以收集所有细胞，将该所有细胞加入新鲜的上述外周血T细胞体外扩增培养基中，以5 ×10⁵-5 ×10⁶个细胞/mL的培养密度继续于36-37 ℃且4.5-5.5% CO₂的条件下培养2-3 d，获得CD3阳性为90%以上且数量达到2 ×10⁸的T细胞，进行冻存或继续扩大培养；

（5）根据需要将步骤（4）所得的T细胞进行复苏或继续扩大培养，其中，复苏时用新鲜的上述外周血T细胞体外扩增培养基以1×10⁶个细胞/mL的培养密度重新刺激冻存的上述T细胞，促进T细胞的再次激活扩增；复苏之后的培养或上述继续扩大培养的具体培养为：每2-3d以5 ×10⁵-5 ×10⁶个细胞/mL的培养密度接种换液，培养至细胞数达到目的扩增量，收集细胞，培养条件与步骤（4）相同。

2.一种外周血T细胞体外扩增培养基，其特征在于：由无血清免疫细胞培养基X-VIVO15、胎牛血清、白介素-2、白介素-15、人CD3单克隆抗体和人CD28单克隆抗体组成，其中，胎牛血清的加入量为无血清免疫细胞培养基X-VIVO 15的10%，白介素-2、白介素-15、人CD3单克隆抗体和人CD28单克隆抗体的终浓度依次为75 μg/L、40 μg/L、20 μg/L和20 μg/L。

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