CN111876389B - 一种扩增car-t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种扩增CAR‑T细胞的方法，包括将新鲜血液经抗凝剂抗凝裂解，接种，再提供CAR‑T细胞刺激扩增培养基，利用扩增培养基将所述初步诱导扩增，控制温度和时间，更加快速的获得CAR‑T细胞，从而实现了更加简单快捷的扩增方式，具有更强的扩增和分化能力，且细胞活力稳定，成活率高。

Description

一种扩增CAR-T细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞扩增领域，特别涉及一种扩增CAR-T细胞的方法。
背景技术
CAR-T细胞治疗最早的研究始于1989年，是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，英文全称Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。需要体外扩增调节性T细胞回输来参与改善疾病的进展，在体外培养以大量扩增CAR-T细胞，一般一个病人需要几千万，乃至几亿个CAR-T细胞，体重越大，需要细胞越多，然而体内存在的调节性T细胞数量很少，仅占正常人外周血CD4+T细胞中的5～10％，体外获取后数量少，纯度不高，细胞增殖能力低，尤其是患者在疾病的某些病程阶段调节性T细胞的不稳定性，给体外扩增增加难度。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种扩增CAR-T细胞的方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：一种扩增CAR-T细胞的方法：包括以下步骤：
S1、收集血液血样品，放入透析膜中调节pH值在6.8-7.3下经抗凝剂抗凝，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种；
S2、提供CAR-T细胞刺激扩增培养基，采用所述CAR-T细胞刺激扩增培养基对外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述CAR-T细胞扩增培养基包括肌酸磷酸、焦磷酸、白细胞介素、巯基乙酸、角鲨烷、维生素C、免疫磁珠；
S3、将细胞悬液接种到细胞培养容器中培养80～120h，得到初步诱导扩增的CAR-T细胞；
S4、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞进行第二诱导扩增培养24～48h，以便得到分化的CAR-T细胞；
S5、利用扩增培养基将分化的CAR-T细胞进行第三诱导扩增培养8～10h，获得扩增的CAR-T细胞。
进一步的，所述血液样品是人的血样品，为新鲜采集或存储的脐带血、周边血。
进一步的，所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠18～24份、乙二胺四乙酸二钠14～20份、肝素钠2～9份、蜗牛黏液0.3～0.8份、表儿茶素0.22～0.65份。
进一步的，所述CAR-T细胞扩增培养基包括以下重量份原料：肌酸磷酸28～33份、焦磷酸11～22份、白细胞介素10～20份、巯基乙酸10～20份、角鲨烷3～9份、维生素C 2～10份、免疫磁珠15～20份。
进一步的，所述免疫磁珠为CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠。
进一步的，所述白细胞介素浓度为500～700IU/mL。
进一步的，所述巯基乙酸浓度为60～80μmol/L。
进一步的，所述维生素C的浓度为200～800mM。
进一步的，S3、S4、S5步骤中，细胞培养的温度为18～30℃。
进一步的，所述S3步骤中，细胞培养容器为36孔板、48孔板或96孔板。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的CAR-T细胞扩增方法，能显著的提高CAR-T细胞扩增效果，具有更强的扩增和分化能力；其中，使用的抗凝剂针对血样具有较好的抗凝效果，蜗牛黏液和羟乙磷酸四钠、乙二胺四乙酸二钠等能与血液中的钙离子结合成螯合物，使钙离子失去凝血作用，阻止血液凝固，肝素钠结合表儿茶素能加强抗凝血酶，灭活丝氨酸蛋白酶，阻止凝血酶的形成，从而达到较好的凝血效果；扩增培养基中的角鲨烷能充分提供营养基质，利于细胞扩增，结合扩增培养的温度和时间，更加快速的获得CAR-T细胞，从而实现了更加简单快捷的扩增方式，具有更强的扩增和分化能力，且细胞活力稳定，成活率高。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种扩增CAR-T细胞的方法：包括以下步骤：
S1、收集新鲜采集脐带血，放入透析膜中调节pH值在6.8下经抗凝剂抗凝，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种，所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠20份、乙二胺四乙酸二钠17份、肝素钠7份、蜗牛黏液0.5份、表儿茶素0.40份；
S2、提供CAR-T细胞刺激扩增培养基，采用所述CAR-T细胞刺激扩增培养基对外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述CAR-T细胞扩增培养基包括以下重量份原料：肌酸磷酸30份、焦磷酸16份、白细胞介素15份、巯基乙酸15份、角鲨烷6份、维生素C6份、免疫磁珠17份，免疫磁珠为CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠，白细胞介素浓度为600IU/mL，巯基乙酸浓度为70μmol/L，维生素C的浓度为500mM；
S3、将细胞悬液接种到36孔板的细胞培养容器中，在18℃培养80h，得到初步诱导扩增的CAR-T细胞；
S4、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞在18℃培养24h进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的CAR-T细胞；
S5、利用扩增培养基将所述分化的CAR-T细胞在18℃培养8h进行第三诱导扩增培养，获得扩增的CAR-T细胞。
实施例2
一种扩增CAR-T细胞的方法：包括以下步骤：
S1、收集新鲜采集脐带血，放入透析膜中调节pH值在7.3下经抗凝剂抗凝，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种，所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠20份、乙二胺四乙酸二钠17份、肝素钠7份、蜗牛黏液0.5份、表儿茶素0.40份；
S2、提供CAR-T细胞刺激扩增培养基，采用所述CAR-T细胞刺激扩增培养基对外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述CAR-T细胞扩增培养基包括以下重量份原料：肌酸磷酸30份、焦磷酸16份、白细胞介素15份、巯基乙酸15份、角鲨烷6份、维生素C 6份、免疫磁珠17份，免疫磁珠为CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠，白细胞介素浓度为600IU/mL，巯基乙酸浓度为70μmol/L，维生素C的浓度为500mM；
S3、将细胞悬液接种到36孔板的细胞培养容器中，在30℃培养120h，得到初步诱导扩增的CAR-T细胞；
S4、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞在30℃培养48h进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的CAR-T细胞；
S5、利用扩增培养基将所述分化的CAR-T细胞在30℃培养10h进行第三诱导扩增培养，获得扩增的CAR-T细胞。
实施例3
一种扩增CAR-T细胞的方法：包括以下步骤：
S1、收集新鲜采集脐带血，放入透析膜中调节pH值在7下经抗凝剂抗凝，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种，所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠20份、乙二胺四乙酸二钠17份、肝素钠7份、蜗牛黏液0.5份、表儿茶素0.40份；
S2、提供CAR-T细胞刺激扩增培养基，采用所述CAR-T细胞刺激扩增培养基对外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述CAR-T细胞扩增培养基包括以下重量份原料：肌酸磷酸30份、焦磷酸16份、白细胞介素15份、巯基乙酸15份、角鲨烷6份、维生素C 6份、免疫磁珠17份，免疫磁珠为CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠，白细胞介素浓度为600IU/mL，巯基乙酸浓度为70μmol/L，维生素C的浓度为500mM；
S3、将细胞悬液接种到36孔板的细胞培养容器中，在22℃培养100h，得到初步诱导扩增的CAR-T细胞；
S4、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞在22℃培养30h进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的CAR-T细胞；
S5、利用扩增培养基将所述分化的CAR-T细胞在22℃培养9h进行第三诱导扩增培养，获得扩增的CAR-T细胞。
实施例4
一种扩增CAR-T细胞的方法：包括以下步骤：
S1、收集新鲜采集脐带血，放入透析膜中调节pH值在6.8下经抗凝剂抗凝，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种，所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠20份、乙二胺四乙酸二钠17份、肝素钠7份、蜗牛黏液0.5份、表儿茶素0.40份；
S2、提供CAR-T细胞刺激扩增培养基，采用所述CAR-T细胞刺激扩增培养基对外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述CAR-T细胞扩增培养基包括以下重量份原料：肌酸磷酸30份、焦磷酸16份、白细胞介素15份、巯基乙酸15份、角鲨烷6份、维生素C 6份、免疫磁珠17份，免疫磁珠为CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠，白细胞介素浓度为600IU/mL，巯基乙酸浓度为70μmol/L，维生素C的浓度为500mM；
S3、将细胞悬液接种到36孔板的细胞培养容器中，在18℃培养80h，得到初步诱导扩增的CAR-T细胞；
S4、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞在18℃培养24h进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的CAR-T细胞；
S5、利用扩增培养基将所述分化的CAR-T细胞在18℃培养8h进行第三诱导扩增培养，获得扩增的CAR-T细胞。
实施例5
一种扩增CAR-T细胞的方法：包括以下步骤：
S1、收集存储的脐带血，放入透析膜中调节pH值在7.3下经抗凝剂抗凝，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种，所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠20份、乙二胺四乙酸二钠17份、肝素钠7份、蜗牛黏液0.5份、表儿茶素0.40份；
S2、提供CAR-T细胞刺激扩增培养基，采用所述CAR-T细胞刺激扩增培养基对外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述CAR-T细胞扩增培养基包括以下重量份原料：肌酸磷酸30份、焦磷酸16份、白细胞介素15份、巯基乙酸15份、角鲨烷6份、维生素C 6份、免疫磁珠17份，免疫磁珠为CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠，白细胞介素浓度为600IU/mL，巯基乙酸浓度为70μmol/L，维生素C的浓度为500mM；
S3、将细胞悬液接种到36孔板的细胞培养容器中，在30℃培养120h，得到初步诱导扩增的CAR-T细胞；
S4、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞在30℃培养48h进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的CAR-T细胞；
S5、利用扩增培养基将所述分化的CAR-T细胞在30℃培养10h进行第三诱导扩增培养，获得扩增的CAR-T细胞。
实施例6
本实施例与实施例3的区别在于，所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠30份、乙二胺四乙酸二钠25份、肝素钠10份、蜗牛黏液0.2份、表儿茶素0.2份。
实施例7
本实施例与实施例3的区别在于，所述CAR-T细胞扩增培养基包括以下重量份原料：肌酸磷酸25份、焦磷酸10份、白细胞介素8份、巯基乙酸22份、角鲨烷10份、维生素C11份、免疫磁珠12份。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于，所述CAR-T细胞扩增培养基包括肌酸磷酸、焦磷酸、白细胞介素、巯基乙酸、维生素C、免疫磁珠，不含有角鲨烷；
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于，所述抗凝剂不含有蜗牛黏液和表儿茶素。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于，所述步骤S3、S4、S5的培养时间均为24h。
将上述实施例1～4、6～7和对比例1～3的CAR-T细胞扩增方法，所得到的细胞数量进行对比，对比结果如下：
由上表可知，本发明的CAR-T细胞扩增方法，能显著的提高CAR-T细胞扩增效果，具有良好的增殖能力，实施例1～7和对比例1比较，合理选择培养基原料，加入角鲨烷能充分提供营养基质，利于细胞扩增；实施例1～7和对比例2比较，抗凝剂加入蜗牛黏液和表儿茶素，使抗凝剂优化得到了最佳的配比关系，在此配比条件下，抗凝剂的效果最佳；实施例1～7和对比例3比较，每代诱导扩增培养的时间会影响细胞扩增的效果；实施例1～4和实施例6比较，本发明的抗凝剂通过将多种成分组合，并进行合理地配比，作用于血液样品中，具有较好的抗凝效果，从而达到较好的细胞增殖能力；实施例1～4和实施例7比较，经实验优选培养基的原料和配比，使得细胞具有更强的扩增和分化能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种扩增CAR-T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、收集血液样品，放入透析膜中调节pH值在6.8-7.3下经抗凝剂抗凝，所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠18~24份、乙二胺四乙酸二钠14~20份、肝素钠2~9份、蜗牛黏液0.3~0.8份、表儿茶素0.22~0.65份，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种；
S2、提供CAR-T细胞扩增培养基，采用所述CAR-T细胞扩增培养基对外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述CAR-T细胞扩增培养基包括肌酸磷酸、焦磷酸、白细胞介素、巯基乙酸、角鲨烷、维生素C、免疫磁珠，所述CAR-T细胞扩增培养基包括以下重量份原料：肌酸磷酸28~33份、焦磷酸11~22份、白细胞介素10~20份、巯基乙酸10~20份、角鲨烷3~9份、维生素C 2~10份、免疫磁珠15~20份；
S3、将细胞悬液接种到细胞培养容器中培养80~120h，得到初步诱导扩增的CAR-T细胞；
S4、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞进行第二诱导扩增培养24~48h，得到分化的CAR-T细胞；
S5、利用扩增培养基将所述分化的CAR-T细胞进行第三诱导扩增培养8~10h，获得扩增的CAR-T细胞。
2.如权利要求1所述的一种扩增CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述血液样品是人的血样品，为新鲜采集或存储的脐带血、周边血。
3.如权利要求1所述的一种扩增CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述免疫磁珠为CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠。
4.如权利要求1所述的一种扩增CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述白细胞介素浓度为500~700IU/mL。
5.如权利要求1所述的一种扩增CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述巯基乙酸浓度为60~80μmol/L。
6.如权利要求1所述的一种扩增CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述维生素C的浓度为200~800mM。
7.如权利要求1所述的一种扩增CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述S3、S4、S5步骤中，细胞培养的温度为18~30℃。
8.如权利要求1所述的一种扩增CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述S3步骤中，细胞培养容器为36孔板、48孔板或96孔板。
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戴聪杰 ; 董乐 ; 王芳 ; .白玉蜗牛凝集素的分离纯化及凝集活性.泉州师范学院学报.2017,(06),第11-16页. *

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