CN107267454A - 一种脐血nk细胞的体外扩增方法及其试剂盒与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐血NK细胞的体外扩增方法及其试剂盒与应用。本发明所提供的脐血NK细胞的体外扩增方法包括从分离的脐血单个核细胞活化培养和增殖培养脐血NK细胞的过程。与现有的分离及扩增脐血NK细胞的方法相比，本发明不需要细胞分选，不需要滋养层细胞，操作简单，通用性好，成本低，所用试剂不含动物源成分，安全性好，NK细胞产量高，获得的脐血NK细胞的纯度达90％以上，细胞总数可达1010‑11个/份脐血，对肿瘤细胞的杀伤力高。本发明将在制备肿瘤免疫治疗药物及肿瘤免疫治疗中发挥作用。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，特别是涉及一种脐血NK细胞的体外扩增方法及其试剂盒与其在制备肿瘤免疫治疗药物及肿瘤免疫治疗中的应用。
背景技术
自然杀伤细胞(Nature killer cell，NK)是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，其细胞形态也与T、B细胞不同，NK细胞是胞浆中含嗜天青颗粒的大颗粒淋巴细胞，广泛存在于淋巴器官和外周组织中，在正常外周血中约占淋巴细胞总数的5％-10％，脾中占1％-2％，淋巴结和骨髓中也有NK细胞存在。NK细胞作为人体天然免疫的重要组成部分，是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞，在免疫监视、免疫防御中起着十分重要的作用。长期以来的研究表明在某些疾病的发生过程中，如肿瘤、自身免疫性疾病、衰老相关性疾病和HIV感染等，会导致NK细胞比例、数量和功能降低。2012年美国疾病控制中心报告NK细胞的活力和数量是人体健康的重要保证，几乎所有疾病的发病都与NK细胞的活性明显不足有关。当人们患有某种疾病时，无论是慢性的、偶发性的或是急性的，NK细胞的活性都在平均水平以下。让NK细胞恢复到高水平的活性，是比较好的治疗疾病方法。与T淋巴细胞不同，NK细胞不需预先刺激就可直接溶解破坏肿瘤细胞和病毒感染细胞，通过分泌穿孔素、丝氨酸蛋白酶如颗粒酶A和B、硫酸软骨素蛋白聚糖等分子降解细胞膜、破坏靶细胞完整性而发挥溶细胞效应；NK细胞表面表达FasL(Fas ligand)和TRAIL(TNF-relatedopoptosis-inducing ligand)可通过与靶细胞上的受体结合引起靶细胞的凋亡；活化后NK细胞会释放大量的干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α等细胞因子；另外通过细胞膜FcγRIII(CD16)与抗体Fc段结合从而介导抗体依赖的细胞毒性作用。随着对NK细胞生物功能及活化机制的了解，利用NK细胞为靶点的免疫治疗对疾病的早期预防、控制和治疗具有重要意义。
近年来，免疫治疗己经成为继手术、放化疗及内分泌治疗之后的第四大治疗模式，并逐渐受到重视。过继性细胞免疫治疗法作为免疫治疗方法的一种，在临床研究方面取得了较大的进展。目前已经开展自体NK细胞过继免疫治疗应用于血液肿瘤(急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病等)和实体瘤(脑胶质瘤、肾癌和恶性黑色素瘤)的临床研究，安全性得到肯定，但临床试验的结果并不尽如人意，将自体外周血进行NK细胞分选后回输，观察到体内NK细胞对肿瘤细胞的杀伤增强，但是生存率和复发率与对照组相比并无改善，可能与肿瘤在发展过程中容易对自体NK细胞形成免疫逃避有关，而且NK细胞过继性免疫治疗的临床试验受试者往往都是经过多种化疗失败的极度晚期的患者，瘤负荷重，机体免疫力差，NK细胞的功能有严重缺陷。要提高NK细胞的临床治疗疗效就必须改变以往的治疗策略。为了克服这些缺陷，异体来源的NK细胞是一个比较好的选择。有学者研究通过移植异体NK细胞治疗白血病患者，发现能延缓复发，且不引起移植物抗宿主病，引起人们对NK细胞的同种异体反应性的关注。从目前的临床研究的结果来看，异源性NK细胞在完全缓解率、无事件生存期、复发和死亡率方面明显优于自体NK细胞，而且异源性NK细胞并不伴随移植物抗宿主反应。NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力依赖于NK细胞表面活化性受体和抑制性受体间的信号平衡调控，杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)组成与主要组织相容性I类(MHC-I)结合的受体家族，对调节人NK细胞的活化阈值起重要作用。最近越来越多的研究表明利用KIR受体/MHC-I配体的错配，筛选最优的供体能大大增强NK细胞对受体肿瘤细胞的杀伤能力，提高NK细胞过继免疫治疗的效果。当前基于KIR的供者选择对提高造血干细胞/骨髓的移植和肿瘤的过继免疫治疗方面的研究倍受关注。异源性NK输注已经成为临床上NK细胞过继免疫治疗的新策略(Lim O,Jung MY,HwangYK,Shin EC:Present and Future of Allogeneic Natural Killer Cell Therapy.Frontiers in immunology 2015,6:286.)。脐血作为现成的异源性资源，无伦理问题，来源丰富，更容易找到最优的供者，且脐血中T淋巴细胞发育不成熟,多为幼稚细胞，移植后发生急性和慢性移植物抗宿主病的几率低、程度轻，所以脐血已经成为异源NK细胞极具前景的来源(Shaim H,Yvon E:Cord blood:a promising sourceof allogeneic natural killer cells for immunotherapy.Cytotherapy 2015,17(1):1-2.)。临床输注NK细胞，需要足够的细胞纯度和细胞数量，但NK细胞在脐血细胞中所占比例较低，数量也很少，需要经过体外分离及培养扩增，获得大量高纯度的NK细胞才能满足临床应用。因而如何获得高纯度、高质量的NK细胞成为NK细胞过继免疫治疗的关键(Klingemann H:Challenges of cancer therapy with naturalkiller cells.Cytotherapy 2015,17(3):245-249.)。
目前分离及扩增脐血NK细胞的方法主要有两种(如图1所示)：1.NK细胞在脐血中约占淋巴细胞的10％-20％，功能不成熟，对肿瘤细胞的杀伤能力低下。可利用流式细胞仪或者磁珠分选仪分选富集NK细胞，然后通过体外扩增增加NK细胞的数量和杀伤肿瘤的能力。Celgene Cellular Therapeutics公司将冻存复苏的脐带血用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，利用NK富集试剂盒(StemCellTechnologies，试剂盒包含CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、HLA-DR和glycophorin A抗体)分选CD56+CD3-NK细胞，纯度可达71％，细胞数为1.5×107/份脐血，然后通过起始培养基(包括：IMDM，10％FBS，35mg/mL转铁蛋白，5μg/mL胰岛素，20μM乙醇胺，1μg/mL不饱和脂肪酸，1μg/mL亚油酸，0.2μg/mL棕榈酸，2.5μg/mL牛血清白蛋白，0.1μg/mL植物凝集素，1％青-链霉素，200IU/mL白介素-2)添加滋养层细胞(丝裂霉素C处理的外周血单个核细胞和K562细胞)，37℃5％CO2条件下培养NK细胞5-7天后，转移至维持培养基(IMDM，10％FBS,2％人AB血清，1％青-链霉素，200IU/mL白介素-2)培养至21天后，每一份脐血可获得CD56+CD3-NK细胞纯度>80％，平均细胞总数为1.2×109/份脐血(Kang L,Voskinarian-Berse V,Law E,Reddin T,Bhatia M,Hariri A,Ning Y,Dong D,Maguire T,Yarmush M et al:Characterization and ex vivo Expansion of HumanPlacenta-Derived Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy.Frontiers inimmunology 2013,4:101.)。2.NK细胞起始于造血干细胞，脐血中含有丰富的造血干细胞，利用流式细胞仪或磁珠分选仪分选富集造血干细胞，通过体外分化获得一定数量的成熟NK细胞。Glycostem Therapeutics公司将冻存复苏脐血利用CliniMACSCD34磁珠分选试剂盒分选富集CD34+造血干细胞纯度为67％，细胞数为3.8×106/份脐血，在细胞扩增培养基I(包括：培养基，10％人血清，高剂量细胞因子组合(SCF，Flt3L，TPO，IL-7，低分子量肝素)和低剂量因子组合(GM-CSF，G-CSF，IL-6))培养9天，然后在细胞扩增培养基II(TPO更换为IL-15，其它成分与培养基I一样)扩增至14天，最后在NK细胞分化培养基(低剂量因子组合更换为(IL-7，SCF，IL-15和IL-2)，其它与培养基I一样)分化培养至35天，获得纯度>90％，平均数量2×109/份脐血的NK细胞(Spanholtz J,Preijers F,Tordoir M,Trilsbeek C,PaardekooperJ,de Witte T,Schaap N,Dolstra H:Clinical-grade generation of active NKcells from cord blood hematopoietic progenitor cells for immunotherapy usinga closed-system culture process.PloS one 2011,6(6):e20740.)。
综上所述，目前脐血NK细胞的制备方法(现有技术)存在以下缺点：
1、需要分选细胞，分选技术影响NK细胞的活性，也需要分选仪器；
2、需要滋养层细胞，K562细胞的引入极大影响扩增NK细胞的安全性；
3、操作复杂，技术通用性差；
4、分离和扩增阶段成本高；
5、使用动物源成分添加物，安全性差；
6、NK细胞产量低。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种简单且安全的脐血NK细胞的体外扩增方法。
本发明所提供的脐血NK细胞的体外扩增方法，可包括以下步骤：
1)活化培养脐血NK细胞：用淋巴细胞培养基调整脐血单个核细胞密度为0.5～5×106个/mL，再至少添加1～10μg/mL唑来膦酸和200～2000IU/mL重组人白介素-2，在36℃～40℃、5％CO2饱和湿度环境中培养1～5天，收集细胞液；
2)增殖培养脐血NK细胞：从步骤1)的细胞液中获取细胞，用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为0.5～5×106个/mL，再添加200～2000IU/mL重组人白介素-2，在36℃～38℃、5％CO2饱和湿度环境中培养，每隔2-3天补充新鲜培养基并调整细胞密度为0.5～5×106个/mL，培养14～35天，收获得到脐血NK细胞。
所述步骤1)中用到的脐血单个核细胞分离自新鲜抗凝脐血或冻存复苏脐带血，分离过程如下：
1.1取新鲜抗凝脐血或冻存复苏脐带血，用1～2倍体积的PBS稀释；
1.2向淋巴细胞分离液上方缓慢加入等体积的稀释脐血，保持两液面界面清晰；
1.3室温980g，离心20～30min；
1.4离心结束后，吸取上面第二层的白膜状的单个核细胞层，用PBS清洗，得到脐血单个核细胞。
所述步骤1)中的淋巴细胞培养基可为AIMMedium CTSTM(购自美国LifeTechnology公司)或GMP S&XFMTM-CD细胞培养基，优选为GMP S&XFMTM-CD细胞培养基。
当所述步骤1)中的淋巴细胞培养基为AIMMedium CTSTM时，活化培养优选为：用AIMMedium CTSTM淋巴细胞培养基调整细胞密度为1～3×106个/mL，再添加1～5μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，在36℃～38℃、5％CO2饱和湿度环境中培养2～4天；活化培养更优为：用AIMMedium CTSTM淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×106个/mL，再添加2μg/mL唑来膦酸和1000IU/mL重组人白介素-2，在37℃、5％CO2饱和湿度环境中培养3天。
当所述步骤1)中的淋巴细胞培养基为GMP S&XFMTM-CD时，活化培养优选为以下之一种：
A.用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为1～3×106个/mL，再添加1～5μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，在36℃～38℃、5％CO2饱和湿度环境中培养2～4天；活化培养更优为：用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×106个/mL，再添加2μg/mL唑来膦酸和1000IU/mL重组人白介素-2，在37℃、5％CO2饱和湿度环境中培养3天；
B.用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为1～3×106个/mL，再添加1～5μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，1～100ng/mL(较好1～20ng/mL)重组人白介素-15和1～100ng/mL(较好1～20ng/mL)重组人白介素-18，在36℃～38℃、5％CO2饱和湿度环境中培养2～4天；活化培养更优为：用GMPS&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×106个/mL，再添加2μg/mL唑来膦酸和1000IU/mL重组人白介素-2、10ng/mL重组人白介素-15和10ng/mL重组人白介素-18，在37℃、5％CO2饱和湿度环境中培养3天；
C.用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为1～3×106个/mL，再添加1～5μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，1～100ng/mL(较好1～20ng/mL)重组人白介素-15和1～100ng/mL(较好1～20ng/mL)重组人白介素-18，在38.5℃～39.5℃、5％CO2饱和湿度环境中培养0.5～1天；活化培养更优为：用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×106个/mL，再添加2μg/mL唑来膦酸和1000IU/mL重组人白介素-2、10ng/mL重组人白介素-15和10ng/mL重组人白介素-18，在39℃、5％CO2饱和湿度环境中培养1天。
所述步骤2)增殖培养脐血NK细胞优选为：用移液管将细胞液移至离心管中，150g，离心10min，弃上清，用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整,细胞密度为0.5～2×106个/mL(更优选1×106个/mL)，再添加500～1500IU/mL(更优选1000IU/mL)重组人白介素-2，在37℃、5％CO2饱和湿度环境中培养，每隔2-3天补充新鲜培养基调整细胞密度为0.5～2×106个/mL(更优选1×106个/mL)，并添加500～1500IU/mL(更优选1000IU/mL)重组人白介素-2，培养18～24天(更优选21天)，得到脐血NK细胞。
以上所述脐血NK细胞的体外扩增方法步骤1)中使用的专用活化培养基也属于发明内容。专用活化培养基为以下组配之一：
添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优1000IU/mL)重组人白介素-2的AIMMedium CTSTM淋巴细胞培养基；
添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优1000IU/mL)重组人白介素-2的GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基；
添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优1000IU/mL)重组人白介素-2、1～100ng/mL(优选1～20ng/mL，最优10ng/mL)重组人白介素-15和1～100ng/mL(优选1～20ng/mL，最优10ng/mL)重组人白介素-18的GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基。
以上所述脐血NK细胞的体外扩增方法步骤2)中使用的专用增殖培养基也属于本发明内容。该专用增殖培养基为添加200～2000IU/mL(优选1000IU/mL)重组人白介素-2的GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基。
以上所述体外扩增方法收获的脐血NK细胞也属于本发明内容。该细胞纯度超过90％。
本发明方法得到的脐血NK细胞在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用或在肿瘤免疫治疗中的应用也属于本发明内容。
本发明另一目的是提供一种脐血NK细胞的体外扩增试剂盒。
本发明所提供的脐血NK细胞的体外扩增试剂盒，主要包括以下试剂：
1)脐血NK细胞的样本密度分离液：样本密度分离液(专利号：ZL 201110456878.2，医疗器械备案号：京海械备20150002号)，或市售其它淋巴细胞分离液；
2)脐血NK细胞活化培养基：AIMMedium CTSTM(美国Life Technology公司)培养基或GMP S&XFMTM-CD培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备20150008号)，以及唑来膦酸、重组人白介素-2、重组人白介素-15和重组人白介素-18；
3)脐血NK细胞增殖培养基：GMP S&XFMTM-CD细胞培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备20150008号)和重组人白介素-2。
采取以上方案，本发明提供了一种操作简单且安全的脐血NK细胞的体外扩增方法以及相关试剂盒。与现有的分离及扩增脐血NK细胞的方法(现有技术)相比，本发明具有以下有益效果：
1)不需要进行细胞分选步骤(不需要分选NK细胞或者造血干细胞)，简化了细胞制备流程，大大降低了脐血NK细胞的制备成本；
2)不需要滋养层细胞，避免引入滋养层细胞给制备的脐血NK细胞带来安全风险；
3)制备NK细胞所使用的细胞培养基完全无动物源成分，安全性好，而且化学成分明确，增加了批次之间的稳定性；
4)NK细胞产量高，获得的脐血NK细胞的纯度达90％以上，细胞总数可达1010-11个/份脐血。
本发明脐血NK细胞的体外扩增方法和试剂盒将在制备肿瘤免疫治疗药物及肿瘤的免疫治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。
附图说明
图1为现有分离及扩增脐血NK细胞的方法；
图2为本发明脐血NK细胞体外扩增方法的流程；
图3为新鲜脐血和冻存复苏脐血NK细胞体外扩增前后的细胞形态图；
图4为新鲜脐血和冻存复苏脐血NK细胞体外扩增的生长曲线；
图5为新鲜脐血和冻存复苏脐血NK细胞体外扩增前后纯度的流式细胞仪检测结果；
图6为体外扩增的新鲜脐血和冻存复苏脐血NK细胞的肿瘤靶细胞杀伤效果。
具体实施方式
针对现有技术中分离及扩增脐血NK细胞中的不足，本发明旨在提供一种脐血NK细胞的体外制备方法，并提供方法中用到的专用活化培养基和专用增殖培养基。
本发明脐血NK细胞的体外扩增方法，可包括以下步骤：
1)活化培养脐血NK细胞：用淋巴细胞培养基(下文详细介绍)调整脐血单个核细胞密度为0.5～5×106个/mL(优选1～3×106个/mL，最优选2×106个/mL)，将细胞悬液接种细胞培养瓶中；再添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优选2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优选1000IU/mL)重组人白介素-2(形成专用活化培养基)，在36℃～40℃、5％CO2饱和湿度环境中培养1～5天；
步骤1)中的淋巴细胞培养基可为AIMMedium CTSTM(购自美国Life Technology公司)或GMP S&XFMTM-CD细胞培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备20150008号)，优选为GMP S&XFMTM-CD细胞培养基。根据选用的淋巴细胞培养基的种类，相应得到不同的专用活化培养基。
一)选用AIMMedium CTSTM淋巴细胞培养基，专用活化培养基组成为：添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优选2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优选1000IU/mL)重组人白介素-2的AIMMedium CTSTM淋巴细胞培养基。
利用该专用活化培养基，步骤1)中的活化培养方法优选为：用AIMMedium CTSTM淋巴细胞培养基调整脐血单个核细胞密度为0.5～5×106/mL(优选1～3×106个/mL，最优选2×106个/mL)，将细胞悬液接种细胞培养瓶中，再向AIMMedium CTSTM淋巴细胞培养基中添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优选2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优选1000IU/mL)重组人白介素-2，在36℃～38℃(优选37℃)、5％CO2饱和湿度环境中培养1～5天(优选2～4天，最优选3天)。
二)选用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基，专用活化培养基组成为：添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优选2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优选1000IU/mL)重组人白介素-2的GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基。
利用该专用活化培养基，步骤1)中的活化培养方法更优选为：用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整脐血单个细胞密度为0.5～5×106/mL(优选1～3×106个/mL，最优选2×106个/mL)，将细胞悬液接种细胞培养瓶中，再向GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基中添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优选2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优选1000IU/mL)重组人白介素-2，在36℃～38℃(优选37℃)、5％CO2饱和湿度环境中培养1～5天(优选2～4天，最优选3天)。
三)选用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基，专用活化培养基组成为：添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优选2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优选1000IU/mL)重组人白介素-2、1～100ng/mL(优选1～20ng/mL，最优选10ng/mL)重组人白介素-15和1～100ng/mL(优选1～20ng/mL，最优选10ng/mL)重组人白介素-18的GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基。
利用该专用活化培养基，步骤1)中的活化培养方法更优选为：用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整脐血单个核细胞密度为0.5～5×106/mL(优选1～3×106个/mL，最优选2×106个/mL)，将细胞悬液接种细胞培养瓶中，再向GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基中添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优选2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优选1000IU/mL)重组人白介素-2、1～100ng/mL(优选1～20ng/mL，最优选10ng/mL)重组人白介素-15和1～100ng/mL(优选1～20ng/mL，最优选10ng/mL)重组人白介素-18，在36℃～38℃(优选37℃)、5％CO2饱和湿度环境中培养1～5天(优选2～4天，最优选3天)。
利用该专用活化培养基，改变培养条件，如在38℃～40℃(优选38.5℃～39.5℃，最优选39℃)、5％CO2饱和湿度环境中培养0.5～3天(优选0.5～1天，最优选1天)，将得到步骤1)活化培养脐血NK细胞的最优条件。
2)增殖培养脐血NK细胞：用移液管将步骤1)得到的细胞液移至离心管中，150g，离心10min,，弃上清，用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备20150008号)调整细胞密度为0.5～5×106个/mL(较优0.5～2×106个/mL，优选1×106个/mL)，将细胞悬液接种细胞培养瓶中，再添加200～2000IU/mL(较优500～1500IU/mL，优选1000IU/mL)重组人白介素-2(形成专用增殖培养基)，在36℃～38℃(优选37℃)、5％CO2饱和湿度环境中培养，每隔2～3天补充新鲜GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为0.5～5×106个/mL(较优0.5～2×106个/mL，优选1×106个/mL)，并添加200～2000IU/mL(较优500～1500IU/mL，优选1000IU/mL)重组人白介素-2，培养14～35天(较优18～24天，优选21天)，收获得到脐血NK细胞。
步骤2)中增殖培养中专用增殖培养基组成为：添加200～2000IU/mL(较优500～1500IU/mL，优选1000IU/mL)重组人白介素-2的GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基。
步骤2)增殖培养脐血NK细胞过程优选为：用移液管将细胞液移至离心管中，150g(离心力单位)，离心10min，弃上清，用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为1×106个/mL，将细胞悬液接种细胞培养瓶中，再向细胞培养瓶中添加1000IU/mL重组人白介素-2，在37℃、5％CO2饱和湿度环境中培养，每隔2～3天补充新鲜培养基并调整细胞密度为1×106个/mL，培养21天，收获得到脐血NK细胞。
上述方法中，步骤1)中用到的脐血单个核细胞分离于脐带血，分离方法如下：
1.1取新鲜抗凝脐血或冻存复苏脐带血100mL，添加100mL PBS稀释脐血；
1.2于10个50mL离心管中分别加入20mL样本密度分离液(专利号：ZL201110456878.2，医疗器械备案号：京海械备20150002号；也可以是市售其它淋巴细胞分离液)，将200mL稀释脐血均分分别缓慢加入分离液面上方，每个离心管加20mL稀释脐血，保持两液面界面清晰；
1.3室温，400～1200g(优选980g，为一种离心力单位。市售其它淋巴细胞分离液按照说明书操作)离心20～40min(优选30min)；
1.4离心结束后，离心管中由上至下分为界面清晰的四层，从上而下依次为：浅黄色的血浆层、白膜状的单个核细胞层、透明的分离液层以及红色的红细胞层，小心吸取白膜状的单个核细胞层到另一离心管中，用PBS清洗，得到脐血单个核细胞。
依据以上方法，本发明还提供了一种脐血NK细胞的体外扩增试剂盒，主要包括以下试剂：
1)脐血单个核细胞的样本密度分离液：样本密度分离液(专利号：ZL201110456878.2，医疗器械备案号：京海械备20150002号)，或市售其它淋巴细胞分离液；
2)脐血NK细胞活化培养基：AIMMedium CTSTM(购自美国Life Technology公司)培养基或GMP S&XFMTM-CD培养基；以及按上述一)至四)描述的其它试剂，包括唑来膦酸、重组人白介素-2、重组人白介素-15和重组人白介素-18；
3)脐血NK细胞增殖培养基：GMP S&XFMTM-CD细胞培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备20150008号)，以及上述描述的试剂重组人白介素-2。
以下结合实施例进一步描述本发明，实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、体外扩增脐血NK细胞及检测
一、体外扩增脐血NK细胞(活化培养方案一)
如图1所示，本发明脐血NK细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
1)分离脐血单个核细胞
1.1分别取100mL的新鲜抗凝脐血(样本1)和冻存复苏脐带血(样本2，脐带血均由武警总医院妇产科提供，并经医院伦理委员会批准)，添加100mL PBS(配方：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，添加蒸馏水至1000mL，调节pH 7.4)稀释脐血；
1.2于10个50mL离心管中分别加入20mL样本密度分离液(专利号：ZL201110456878.2，医疗器械备案号：京海械备20150002号)，将稀释脐血分别缓慢加入分离液面上方，每个离心管加20mL稀释脐血，保持两液面界面清晰；
1.3室温，980g,离心30min；
1.4离心结束后，离心管中由上至下分为界面清晰的四层，从上而下依次为：浅黄色的血浆层、白膜状的NK细胞层、透明的分离液层以及红色的红细胞层，小心吸取白膜状的单个核细胞层到另一离心管中，用PBS清洗2～3次，得到单个核细胞。
2)活化培养脐血NK细胞
用AIMMedium CTSTM淋巴细胞培养基(购自美国Life Technology公司)调整单个核细胞密度为2×106个/mL(0.5～5×106/mL均可，较优1～3×106个/mL。低于0.5×106/mL或者高于5×106/mL，都不利于NK细胞的活化)，将单个核细胞悬液接种细胞培养瓶中，再向AIMMedium CTSTM淋巴细胞培养基中添加2μg/mL(1～10μg/mL均可，较优1～5μg/mL。低于1μg/mL，影响NK细胞活化；高于10μg/mL，对NK的活化影响不大)唑来膦酸(择泰，诺华制药)和1000IU/mL(200～2000IU/mL均可，较优500～1500IU/mL。低于200IU/mL，影响NK细胞的活化；高于2000IU/mL，细胞容易死亡)重组人白介素-2(德路生，北京四环生物)，在37℃(36℃～38℃均可，低于36℃或者高于38℃，细胞均无法正常生长)、5％CO2饱和湿度环境中培养3天(1～5天均可，较优2～4天。低于1天，NK细胞活化较低；高于5天后，对NK的活化影响不大)。
3)增殖培养脐血NK细胞
用移液管将细胞液移至离心管中，150g，离心10min，弃上清，用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备20150008号)调整细胞密度为1×106个/mL(0.5～5×106/mL均可，较优0.5～2×106个/mL。低于0.5×106个/mL或者高于5×106/mL时，都不利于NK细胞的增殖)，接种至细胞培养瓶中，再添加1000IU/mL(200～2000IU/mL均可，较优500～1500IU/mL。低于200IU/mL，影响NK细胞的增殖；高于2000IU/mL，细胞容易死亡)重组人白介素-2，37℃(36℃～38℃均可，低于36℃或者高于38℃时，细胞不能正常生长)、5％CO2饱和湿度环境中培养，每隔2～3天补充新鲜淋巴细胞培养基调整细胞密度为0.5～5×106个/mL(优选1×106个/mL，较优0.5～2×106个/mL。细胞密度低于0.5×106个/mL，细胞将增殖缓慢；当细胞高于5×106个/mL，细胞容易很快形成接触抑制，影响细胞的增殖)，并添加1000IU/mL(200～2000IU/mL均可，较优500～1500IU/mL)重组人白介素-2，培养14～35天(较优18～24天，最优选21天)，得到脐血NK细胞。由于细胞在21天时扩增数量较多，且杀伤活性最大，21天后细胞进入稳定期，细胞的杀伤活性下降，所以优选21天作为脐血NK细胞的收获点。
二、检测体外扩增的脐血NK细胞
1、脐血NK细胞计数
1)轻轻吹打脐血NK细胞悬液，成NK单细胞悬液；
2)取NK单细胞悬液20μl，加入20μl 0.2％台盼蓝染色液(购自SIGMA公司)中，反复抽吸轻轻混合均匀；
3)取20μl混合液加入Countstar(IC1000)细胞计数仪(购自上海睿钰生物科技有限公司)的计数板槽中；
4)静置1分钟，读数。
结果：从新鲜抗凝脐血或冻存复苏脐带血中分离的脐血NK细胞经过体外活化、扩增培养后(用上述一的方法获得)，在显微镜下观察，细胞形态由扩增前的圆形、大小各异，逐渐变为均一的不规则细胞形态，细胞胞体和胞核体积增大(扩增培养21天的细胞如图3所示)；细胞数量由最初的4.36×108个/mL(新鲜脐血)、3.25×108个/mL(冻存复苏脐血)增殖至扩增培养21天的5.08×1010个/mL(新鲜脐血)、3.94×1010个/mL(冻存复苏脐血)，如图4所示。图4还显示扩增培养14天至21天为细胞快速增殖期，之后至35天为缓慢凋零期，因此可根据情况在14～35天培养期内收获脐血NK细胞。
2、流式细胞仪检测脐血NK细胞的纯度
1)取单细胞悬液,150g离心10分钟；
2)用PBS重悬细胞沉淀，调节细胞浓度为1×106个/100μl，置流式检测管中；
3)加抗体CD56、CD3(购自BD公司)，轻轻吹打混匀，4℃避光孵育30分钟，同时设置同型对照；
4)1500g离心5分钟,弃上清；
5)加100μl PBS，轻轻吹打混匀，上机检测。
结果：一中扩增培养21天的NK细胞的纯度由最初的1.23％(新鲜脐血)、0.79％(冻存复苏脐血)提高至94.58％(新鲜脐血)、94.37％(冻存复苏脐血)，如图5所示。
3、CCK-8法测定脐血NK细胞的杀瘤活性
1)取生长良好的A549细胞(人肺腺癌细胞，来源于ATCC)为靶细胞，用0.25％胰蛋白酶消化；
2)台盼蓝染色计数，调整细胞浓度至5×104个/mL；
3)每孔100ul于96孔板中，置于37℃5％CO2孵育过夜。
4)取脐血NK细胞悬液为效应细胞，调整细胞浓度至2×l06个/mL；
5)按照效靶比为5：1、10：1、20：1加入96孔板中，每组设3复孔；
6)37℃5％CO2的孵箱中培养4h；
7)每孔加入15μl CCK-8(购自碧云天)，继续孵育2h；
8)用酶标仪检测450nm波长的OD值；
9)计算杀伤率：杀伤率(％)＝[1-(实验组OD值-单独效应细胞OD值)÷单独靶细胞OD值]×100％。
结果：荧光显微镜下观察一中体外扩增培养21天的脐血NK细胞对A549肿瘤细胞的杀伤能力大大提高，如图6所示。
上述检测结果表明，用本发明方法体外扩增的脐血NK细胞数量高、纯度高、对肿瘤细胞的杀伤活性高。
实施例2、体外扩增脐血NK细胞(活化培养方案二)
如图1所示，脐血NK细胞的体外扩增包括以下过程：
1)从冻存复苏脐带血中分离脐血单个核细胞
取10ml冻存复苏脐带血(样本3)，方法与实施例1相同。
2)活化培养脐血NK细胞(对照组为实施例1)
用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备20150008号)调整单个核细胞密度为2×106个/mL(0.5～5×106/mL均可，较优1～3×106个/mL)，将细胞悬液接种细胞培养瓶中，再向GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基中添加2μg/mL(1～10μg/mL均可，较优1～5μg/mL)唑来膦酸(择泰，诺华制药)和1000IU/mL(200～2000IU/mL均可，较优500～1500IU/mL)重组人白介素-2(德路生，北京四环生物)，在37℃(36℃～38℃均可)、5％CO2饱和湿度环境中培养1～5天(较优2～4天，优选3天。低于1天，NK细胞活化较低；高于5天后，对NK的活化影响不大)。
相同的添加试剂对细胞活化的影响与实施例1描述的相同，不再赘述。
3)增殖培养脐血NK细胞
与实施例1相同。
实施例3、体外扩增脐血NK细胞及检测(活化培养方案三)
如图1所示，脐血NK细胞的体外扩增包括以下过程：
1)从冻存复苏脐带血中分离脐血单个核细胞
取10ml冻存复苏脐带血(样本3)，方法与实施例1相同。
2)活化培养脐血NK细胞
用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备20150008号)调整单个核细胞密度为2×106个/mL(0.5～5×106/mL均可，较优1～3×106个/mL)，将细胞悬液接种细胞培养瓶中，再向GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基中添加2μg/mL(1～10μg/mL均可，较优1～5μg/mL)唑来膦酸(择泰，诺华制药)、1000IU/mL(200～2000IU/mL均可，较优500～1500IU/mL)重组人白介素-2(德路生，北京四环生物)、10ng/mL(1～100ng/ml均可，较优1～20ng/ml均可。低于1ng/ml时，对NK的活化无作用，高于100ng/mL时，对NK活性影响不大)重组人白介素-15(购自Peprotech公司)和10ng/mL(1～100ng/ml均可，较优1～20ng/ml均可。低于1ng/ml时，对NK的活化无作用，高于100ng/mL时，对NK活性影响不大)重组人白介素-18(购自Peprotech公司)，在37℃(36℃～38℃均可)、5％CO2饱和湿度环境中培养3天(1～5天均可，较优2～4天。低于1天，NK细胞活化较低；高于5天后，对NK的活化影响不大)。
相同的添加试剂对细胞活化的影响与实施例1描述的相同，不再赘述。
3)增殖培养脐血NK细胞
与实施例1相同。
实施例4、体外扩增脐血NK细胞(活化培养方案四)
如图1所示，脐血NK细胞的体外扩增包括以下过程：
1)从冻存复苏脐带血中分离脐血单个核细胞
取10ml冻存复苏脐带血(样本3)，方法与实施例1相同。
2)活化培养脐血NK细胞
使用与活化培养方案三相同的活化培养基，培养条件变化为在39℃±0.5℃(38℃～40℃均可，提高培养温度，一方面有益于加快脐血NK细胞活化，活化效率提高，另一方面可以提高脐血NK的扩增倍数、纯度和生物活性。但高于40℃时，NK细胞不能适应，出现死亡)、5％CO2饱和湿度环境中培养1天(0.5～3天均可，低于0.5天，NK的活化较低，高于3天后，NK细胞会出现死亡)。
3)增殖培养脐血NK细胞
与实施例1相同。
脐血NK细胞检测
用实施例1中二描述的方法对从10ml冻存复苏脐带血(样本3)体外扩增的脐血NK细胞进行以下检测(利用实施例1-实施例4方法以样本3为起始血源进行平行操作)：
1、脐血NK细胞计数
从冻存复苏脐带血中分离的脐血单个核细胞经过体外活化、扩增培养21天后，细胞扩增结果如表1-1和表1-2所示。
本发明是从脐血单个核细胞(此时NK细胞在单个核细胞所占比例较低，见表2,0天的NK细胞比例仅仅为9.56％)，经过活化和扩增两步骤，可以获得高纯度的NK细胞。表1-1显示扩增前后所计数都是细胞(包括扩增后的NK细胞和其它细胞)的总数。NK细胞的绝对数是细胞总数×NK细胞的比例，即：表1-1数据×表2＝表1-2。
0天脐血单个核细胞是本发明活化和扩增前的细胞(包括少量NK细胞和其它细胞)，相当于对照；0天脐血NK细胞是指其中的NK细胞。21天脐血NK细胞是单个核细胞扩增21天后的细胞总数，但因为此时NK纯度很高，绝大多数都是NK细胞，所以21天扩增后的细胞被称为NK细胞(严格来讲是以NK细胞为主的单个核细胞)。
该结果显示实施例1-实施例4方案均使脐血细胞总数成百倍扩增(表1-1)，其中NK细胞的绝对数上千倍扩增(表1-2)，且扩增效果实施例4＞实施例3＞实施例2＞实施例1。
表1-1脐血细胞的总体数量及扩增倍数(10ml脐血量)
表1-2脐血NK细胞的绝对数量及扩增倍数(10ml脐血量)
2、流式细胞仪检测脐血NK细胞的纯度
从冻存复苏脐带血中分离的脐血单个核细胞经过体外活化、扩增培养21天后，NK细胞纯度结果如表2所示。
表2脐血NK细胞的纯度
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | |
| 0天脐血NK细胞纯度 | 9.56％ | 9.56％ | 9.56％ | 9.56％ |
| 21天脐血NK细胞纯度 | 90.69％ | 92.46％ | 93.75％ | 95.39％ |
表2数据表明脐血单个核细胞中NK比例由原来的9.56％，经过各实施例的扩增，NK细胞纯度均能达到90％以上，且实施例4＞实施例3＞实施例2＞实施例1。
3、CCK-8法测定脐血NK细胞的杀瘤活性
实验以0天脐血单个核细胞(活化和扩增前的细胞)为阴性对照，以CIK细胞(一种杀伤肿瘤的免疫细胞)为阳性对照。CIK细胞的培养参照文献(Adoptiveimmunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new goodmanufacturing practice-grade protocol.Cytotherapy,2012；Early Online:1–10.DOI:10.3109/14653249.2012.681038)获得。
结果如表3所示，荧光显微镜下观察各实施例体外扩增21天收获的脐血NK细胞均显示对A549肿瘤细胞较强的杀伤能力，与阳性对照CIK细胞相比，本发明扩增的NK细胞具有更强的活性。同样效靶比下实施例4＞实施例3＞实施例2＞实施例1，表明实施例4扩增的细胞杀伤能力最强。
表3脐血NK细胞对A549肿瘤细胞的杀伤能力
由以上实施例可以看出，本发明所提供的脐血NK细胞体外扩增方法操作简单且安全，与现有的分离及扩增脐血NK细胞的方法(现有技术)的比较如表4所示。
综上，本发明具有以下优点：
1)不需要细胞分选；
2)不需要滋养层细胞；
3)操作简单，通用性好；
4)成本低；
5)所用试剂不含动物源成分，安全性好；
6)NK细胞产量高：获得的脐血NK细胞的纯度达90％以上，细胞总数可达1010-11个/份脐血(按实施例1样本为100ml)；
7)对肿瘤细胞的杀伤力高。
表4现有技术与本发明技术的比较
注：每份脐血量为100ml(通常一份脐血的量约在50ml-120ml之间)。
实施例5、脐血NK细胞的体外扩增试剂盒
本发明脐血NK细胞的体外扩增试剂盒，主要包括以下试剂：
1)脐血NK细胞的样本密度分离液：样本密度分离液(专利号：ZL 201110456878.2，医疗器械备案号：京海械备20150002号)，或市售其它淋巴细胞分离液；
2)脐血NK细胞活化培养基：AIMMedium CTSTM(购自美国Life Technology公司)培养基或GMP S&XFMTM-CD培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备20150008号)，以及唑来膦酸、重组人白介素-2、重组人白介素-15和重组人白介素-18；
3)脐血NK细胞增殖培养基：GMP S&XFMTM-CD细胞培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备20150008号)和重组人白介素-2。
该试剂盒可参照实施例1-4的方法进行使用。
工业应用性
本发明从分离的脐血单个核细胞通过活化培养和增殖培养获得脐血NK细胞，不需要细胞分选，不需要滋养层细胞，操作简单，通用性好，成本低，所用试剂不含动物源成分，安全性好，且收获的NK细胞产量高，细胞总数可达1010-11个/份脐血，纯度达90％以上，对肿瘤细胞的杀伤力高。本发明能应用于肿瘤免疫治疗药物的制备中。
Claims (10)
1.一种脐血NK细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：
1)活化培养脐血NK细胞：用淋巴细胞培养基调整脐血单个核细胞密度为0.5～5×106个/mL，再至少添加1～10μg/mL唑来膦酸和200～2000IU/mL重组人白介素-2，在36℃～40℃、5％CO2饱和湿度环境中培养1～5天，收集细胞液；
2)增殖培养脐血NK细胞：从步骤1)的细胞液中获取细胞，用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为0.5～5×106个/mL，再添加200～2000IU/mL重组人白介素-2，在36℃～38℃、5％CO2饱和湿度环境中培养，每隔2-3天补充新鲜培养基并调整细胞密度为0.5～5×106个/mL，培养14～35天，收获得到脐血NK细胞。
2.根据权利要求1所述的脐血单个核细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述步骤1)中用到的脐血单个核细胞分离自新鲜抗凝脐血或冻存复苏脐带血，分离过程如下：
1.1取新鲜抗凝脐血或冻存复苏脐带血，用1～2倍体积的PBS稀释；
1.2向淋巴细胞分离液上方缓慢加入等体积的稀释脐血，保持两液面界面清晰；
1.3室温980g，离心20～30min；
1.4离心结束后，吸取上面第二层的白膜状的单个核细胞层，用PBS清洗，得到脐血单个核细胞。
3.根据权利要求1或2所述的脐血NK细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述步骤1)中的淋巴细胞培养基可为AIMMedium CTSTM(购自美国Life Technology公司)或GMP S&XFMTM-CD细胞培养基，优选为GMP S&XFMTM-CD细胞培养基。
4.根据权利要求3所述的脐血NK细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述步骤1)中的淋巴细胞培养基为AIMMedium CTSTM，活化培养优选为：用AIMMediumCTSTM淋巴细胞培养基调整细胞密度为1～3×106个/mL，再添加1～5μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，在36℃～38℃、5％CO2饱和湿度环境中培养2～4天；活化培养更优为：用AIMMedium CTSTM淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×106个/mL，再添加2μg/mL唑来膦酸和1000IU/mL重组人白介素-2，在37℃、5％CO2饱和湿度环境中培养3天。
5.根据权利要求3所述的脐血NK细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述步骤1)中的淋巴细胞培养基为GMP S&XFMTM-CD，活化培养优选为以下之一种：
A.用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为1～3×106个/mL，再添加1～5μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，在36℃～38℃、5％CO2饱和湿度环境中培养2～4天；活化培养更优为：用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×106个/mL，再添加2μg/mL唑来膦酸和1000IU/mL重组人白介素-2，在37℃、5％CO2饱和湿度环境中培养3天；
B.用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为1～3×106个/mL，再添加1～5μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，1～100ng/mL(较好1～20ng/mL)重组人白介素-15和1～100ng/mL(较好1～20ng/mL)重组人白介素-18，在36℃～38℃、5％CO2饱和湿度环境中培养2～4天；活化培养更优为：用GMPS&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×106个/mL，再添加2μg/mL唑来膦酸和1000IU/mL重组人白介素-2、10ng/mL重组人白介素-15和10ng/mL重组人白介素-18，在37℃、5％CO2饱和湿度环境中培养3天；
C.用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为1～3×106个/mL，再添加1～5μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，1～100ng/mL(较好1～20ng/mL)重组人白介素-15和1～100ng/mL(较好1～20ng/mL)重组人白介素-18，在38.5℃～39.5℃、5％CO2饱和湿度环境中培养0.5～1天；活化培养更优为：用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×106个/mL，再添加2μg/mL唑来膦酸和1000IU/mL重组人白介素-2、10ng/mL重组人白介素-15和10ng/mL重组人白介素-18，在39℃、5％CO2饱和湿度环境中培养1天。
6.根据权利要求1-5任一所述的脐血NK细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述步骤2)增殖培养脐血NK细胞优选为：用移液管将细胞液移至离心管中，150g，离心10min，弃上清，用GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基调整,细胞密度为0.5～2×106个/mL(更优选1×106个/mL)，再添加500～1500IU/mL(更优选1000IU/mL)重组人白介素-2，在37℃、5％CO2饱和湿度环境中培养，每隔2-3天补充新鲜培养基调整细胞密度为0.5～2×106个/mL(更优选1×106个/mL)，并添加500～1500IU/mL(更优选1000IU/mL)重组人白介素-2，培养18～24天(更优选21天)，得到脐血NK细胞。
7.权利要求1至6任一项所述脐血NK细胞体外扩增方法中步骤1)使用的专用活化培养基，为以下组配之一：
添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优1000IU/mL)重组人白介素-2的AIMMedium CTSTM淋巴细胞培养基；
添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优1000IU/mL)重组人白介素-2的GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基；
添加1～10μg/mL(优选1～5μg/mL，最优2μg/mL)唑来膦酸和200～2000IU/mL(优选500～1500IU/mL，最优1000IU/mL)重组人白介素-2、1～100ng/mL(优选1～20ng/mL，最优10ng/mL)重组人白介素-15和1～100ng/mL(优选1～20ng/mL，最优10ng/mL)重组人白介素-18的GMP S&XFMTM-CD淋巴细胞培养基。
8.权利要求1至6任一项所述脐血NK细胞体外扩增方法中步骤2)使用的专用增殖培养基，为添加200～2000IU/mL(优选1000IU/mL)重组人白介素-2的GMPS&XFMTM-CD淋巴细胞培养基。
9.用权利要求1-6任一所述方法体外扩增收获的纯度在90％以上的脐血NK细胞，以及该脐血NK细胞在制备肿瘤免疫治疗药物或在肿瘤免疫治疗中的应用。
10.一种脐血NK细胞的体外扩增试剂盒，主要包括以下试剂：
1)脐血NK细胞的样本密度分离液：样本密度分离液(专利号：ZL 201110456878.2，医疗器械备案号：京海械备20150002号)，或市售其它淋巴细胞分离液；
2)脐血NK细胞活化培养基：AIMMedium CTSTM(美国Life Technology公司)培养基或GMP S&XFMTM-CD培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备20150008号)，以及唑来膦酸、重组人白介素-2、重组人白介素-15和重组人白介素-18；
3)脐血NK细胞增殖培养基：GMP S&XFMTM-CD细胞培养基(专利申请号：201310082166.8；医疗器械备案号：京海械备20150008号)和重组人白介素-2。
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