CN105462923B - 一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法 - Google Patents

一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，包括在处理好的培养体系加入CD16单抗，ATG,IL‑2，37oC培养箱中孵育，计数，换液，添加新鲜IL‑2；定期换培养液，继续培养适当时间得到人自然杀伤细胞。本发明的有益效果是：NK细胞在不进行磁珠分离,肿瘤修饰细胞刺激的情况下，应用ATG,CD16单抗短时间内得以高效扩增，极大程度上节约了生产成本且操作简便；NK细胞的扩增倍数达千倍以上，终比例达到80%‑93%；生产效率较高，完全可以应用于大规模临床研究等；NK细胞的生长过程均在GMP条件下完成，保证无菌操作，并且在生产最后阶段进行各种安全检测，可应用于临床研究。

Description

一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法。
背景技术
自19世纪80年代NK细胞的生物学活性被发现以来，有关NK细胞的研究及其应用就不断进行。国内外均已有临床试验证明NK细胞治疗血液系统肿瘤是有效地，有望成为彻底治愈血液系统肿瘤的途径之一。但是NK细胞的临床应用同时也受到其数量有限的限制，NK细胞在人的外周血淋巴细胞中只占了5%-15%。故体内及体外高效扩增NK细胞是研究者们极其关注的问题及临床广泛应用NK细胞的瓶颈问题之一。只有解决了NK细胞数量的限制，才能使NK细胞应用于临床的实验广泛开展，尽快找到NK细胞治疗肿瘤的具有标准意义的有效途径。 国内外已有学者对NK扩增方法技术进行研究。
Carlens S等，应用抗CD3单抗和IL-2扩增来源于健康血库供者的NK细胞，经21天培养后扩增倍数达到193倍，NK(CD3-CD56+)细胞纯度55%左右。Klingeman H-G等体外应用IL-2及IL-15扩增经磁珠纯化的NK细胞，经14天培养后NK细胞扩增了5-20倍，与K562效靶比为10:1时杀伤能力可达75%,E:T为1:1时为45%。Evren Alici等应用抗CD3单抗和IL-2体外扩增来源于MM患者的NK细胞，经过20天培养后细胞总数扩增了511倍，其中NK细胞比例由11%扩增为65%，就NK细胞而言扩增了1624倍。NK细胞与K562效靶比为10:1时，其杀伤活性由初培养时的8%达到65%。Siegler U等首先磁珠纯化NK细胞，再应用IL-2，IL-15，抗CD3单抗及自体照射过的饲养细胞扩增NK细胞，并且于GMP条件下培养，NK细胞19天后扩增了117倍。Hiroyuki Fujisaki等应用IL-15及41BBL修饰了的K562(k562-mb15-41BBL)细胞作为饲养细胞扩增NK细胞，照射后的K562-mb15-41BBL与NK细胞共培养21天后，来源于外周血的CD3-CD56+NK细胞平均扩增了277倍，比例达到96.8%。与K562效靶比为4:1时，杀伤活性达到80%以上。 Gong W等通过基因修饰K562细胞使其共表达主要组织相容复合体I链相关蛋白A（MICA），4-1BBL，IL-15，统称为K562-MICA-41BBL-IL-15细胞，使其刺激NK细胞24天，NK细胞扩增达到了550倍，比例也有14.8%扩增到了86.7%，并且其杀伤活性也得到强化。后者虽然扩增的NK纯度高，但这种通过肿瘤细胞为滋养细胞的NK细胞扩增体系，在应用时存在培养体系中的肿瘤细胞有被输入患者体内的风险。
国内其他应用细胞因子及饲养细胞扩增NK细胞的报道，彭宝刚等采用PBMCs和附壁Wilms肿瘤细胞株HFWT细胞混合培养诱导扩增NK细胞，健康人PBMCs在HFWT细胞中培养10～21天后，CD56+CDl6+细胞占细胞总数50％以上。当效靶比为2：1时，NK细胞杀伤80％的HFWT细胞。如2007年李晓红等应用IL-2，IL-12，IL-15扩增磁珠纯化的NK细胞，15天后扩增倍数达到53倍。如2008年黄庆生等应用基因工程构建同时表达IL-15，IL-18及41BBL三种基因的K562细胞，来扩增NK细胞，经21天后，扩增倍数达到520倍。
国内外学者的以上方法有使NK细胞可大量扩增者，但是使用磁珠分离，大大增加了研究成本，而借助K562，Wilms肿瘤细胞株HFWT细胞等进行基因修饰的肿瘤细胞刺激NK扩增，其安全性存在隐患。另外一些学者的研究方法虽然操作简便，但是扩增效率较低。目前已有分离纯度可达95%以上的商品化NK细胞分离试剂盒，但其价格昂贵，难以满足大规模实验以及临床肿瘤免疫治疗的要求，所以研究操作简单而扩增效率高的NK细胞培养技术十分必要。本发明旨在寻求相对简单但可以大剂量扩增NK细胞的安全有效的方法；降低技术成本，减轻病患者负担，使NK产品可以广泛应用于临床研究及临床治疗肿瘤患者尤其是血液肿瘤患者的需求。
发明内容
为了实现体外高效无菌扩增NK细胞，突破因外周血NK细胞数量有限而不能大量用于临床以治疗肿瘤等的瓶颈；降低技术成本，减轻病患者负担，使NK产品可以广泛应用于临床研究及临床治疗肿瘤患者尤其是血液肿瘤患者的需求，本发明提供了一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，包括以下步骤:
a、配制细胞完全培养液，备用；所述完全培养液含有2mM Gluta-MAX和100μg/ml青链霉素，其余为GMP CellGroR DC Serum-free Medium与胎牛血清混合物或GMP CellGroRDC Serum-free Medium与自体血清混合物；
b、取室温淋巴细胞分离液，将备用的人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心,形成细胞分层；
c、吸取所述步骤b所得所述细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，得白膜层细胞团；
d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤，弃去上层清液，得到细胞；
e、将所述步骤d的所得的细胞用步骤a所配制的完全培养液重新悬浮，计数并调整活细胞浓度至0.5×106-2×106 cells/ml；
f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于细胞培养板中加入CD16单抗，ATG,IL-2记为第一天;将所述细胞培养板放入37oC培养箱中孵育适当时间后，更换所述完全培养液，第二次添加新鲜IL-2；
g、之后定期更换所述细胞完全培养液，培养适当时间，得到人自然杀伤细胞。
所述步骤a中，所述GMP CellGroR DC Serum-free Medium和所述胎牛血清体积比为19:1～4:1；
所述自体血清占所述完全培养液的体积比为1-15%。
所述步骤f中，所述ATG 浓度为50 ng/ml-1000ng/ml, CD16 单抗浓度为 2μg/ml-100μg/ml；IL-2浓度为200 U/ml-1000U/ml;所述第二次添加新鲜IL-2，使IL-2的浓度为200 U/ml-1000U/ml。
所述步骤b中第一次离心条件为1200-2500rpm, 15-25mins 。
所述步骤c中第二次离心条件为800-2000rpm,5-15mins 。
所述步骤g中2-3天更换所述细胞完全培养液，培养20-25天，得到人自然杀伤细胞。
所述步骤f中孵育的时间为2-4天。
本发明还提供一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法中的因子组合应用，所述步骤f中，因子CD16单抗，ATG和IL-2组合应用。
所述ATG的浓度为50 ng/ml-1000ng/ml, CD16 单抗的浓度为 2μg/ml-100μg/ml；IL-2的浓度为200 U/ml-1000U/ml。
本发明的技术方案带来的有益效果是：
1、NK细胞在不进行磁珠分离,肿瘤修饰细胞刺激的情况下，应用ATG,CD16单抗,IL-2短时间内得以高效扩增，极大程度上节约了生产成本且操作简便。
2、NK细胞的扩增倍数达千倍以上，终比例达到80%以上；最高可以达到92-93%，生产效率高，完全可以应用于大规模临床研究等。
3、NK细胞的生长过程均在GMP条件下完成，保证无菌操作，并且在生产最后阶段进行各种安全检测，可应用于临床研究及治疗。
附图说明
图1为本实施例1的产品检测图。
具体实施方式
针对现有的NK细胞培养方法因外周血NK细胞数量有限而不能大量用于临床以治疗肿瘤；成本高病患者难以负担，使NK产品不能广泛应用于临床研究及临床治疗肿瘤患者尤其是血液肿瘤患者的问题，本发明提供一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法。
包括以下步骤:
a、配制细胞完全培养液，备用；完全培养液含有2mM Gluta-MAX和100μg/ml青链霉素，其余为GMP CellGroR DC Serum-free Medium与胎牛血清混合物或GMP CellGroR DCSerum-free Medium与自体血清混合物；
b、取室温淋巴细胞分离液，将备用的人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心,形成细胞分层；
c、吸取步骤b所得细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，得白膜层细胞团；
d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤，弃去上层清液，得到细胞；
e、将所述步骤d所得的细胞用步骤a所配制的完全培养液重新悬浮，计数并调整活细胞浓度至0.5×106-2×106 cells/ml；
f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于细胞培养板中加入CD16单抗，ATG,IL-2记为第一天;将所述细胞培养板放入37oC培养箱中孵育适当时间后，更换所述完全培养液，第二次添加新鲜IL-2；
g、之后定期更换所述细胞完全培养液，培养适当时间，得到人自然杀伤细胞。
其中，步骤a中，所述GMP CellGroR DC Serum-free Medium和所述胎牛血清体积比为19:1～4:1。
其中，自体血清占完全培养液的体积比为1-15%。
其中，步骤f中，ATG 浓度为50 ng/ml -1000ng/ml, CD16 单抗浓度为 2μg/ ml-100μg/ml；IL-2浓度为200U/ml-1000U/ml;第二次添加新鲜IL-2，使IL-2的浓度为200 U/ml-1000U/ml。
其中，步骤b中第一次离心条件为1200-2500rpm, 15-25mins 。
其中，步骤c中第二次离心条件为800-2000rpm, 5-15mins 。
其中，步骤g中2-3天更换所述细胞完全培养液，培养20-25天，得到人自然杀伤细胞。
其中，步骤f中孵育的时间为2-4天。
本发明还提供一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法中的因子组合应用，所述步骤f中，因子CD16单抗，ATG和IL-2组合应用。
所述ATG的浓度为50 ng/ml -1000ng/ml, CD16 单抗的浓度为 2μg/ml-100μg/ml；IL-2的浓度为200U/ml-1000U/ml。
实施例1：
一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，包括以下步骤：
a、配制细胞完全培养液，备用，为NK细胞提供其生存和扩增所需要的营养成分；完全培养液含有2mM Gluta-MAX、100μg/ml青链霉素，其余为GMP CellGroR DC Serum-freeMedium与胎牛血清的混合物；其中GMP CellGroR DC Serum-free Medium与胎牛血清摩尔比为19:1；
b、取室温淋巴细胞分离液50ml，将200 ml备用的人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心, 离心条件为2500rpm, 15mins ，形成细胞分层；
c、吸取所述步骤b所得细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，离心条件为2000rpm,5mins，得白膜层细胞团；
d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤二次，弃去上层清液，得到细胞；
e、将所述步骤d的所得的细胞用步骤a所配制的完全培养基重新悬浮，台盼蓝染色，细胞计数板计数，调整活细胞浓度至0.5×106cells/ml，；
f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于培养体系中加入CD16单抗，ATG, IL-2记为第一天，使得 ATG 浓度为50ng/ml, CD16 单抗浓度为 2μg/ml；IL-2浓度为200U/ml，均为所占培养体系的浓度。将细胞培养板放入37oC培养箱中孵育2天，更换完全培养液，添加新鲜IL-2，使IL-2所占培养体系的浓度为200U/ml；
g、2天更换一次培养液，继续培养21天，得到人自然杀伤细胞。
以上操作均需在GMP条件下完成，以确保NK细胞生长的无菌环境。
参见图1， 经检测，本实施例中的CD3-CD56+NK细胞，扩增后比例高达85%。
实施例2：
一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，包括以下步骤：
a、配制细胞完全培养液，备用，为NK细胞提供其生存和扩增所需要的营养成分；完全培养液含有2mM Gluta-MAX、100μg/ml青链霉素，其余为GMP CellGroR DC Serum-freeMedium与胎牛血清的混合物；其中GMP CellGroR DC Serum-free Medium与胎牛血清摩尔比为4:1；
b、取室温淋巴细胞分离液300ml，将200ml备用的人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心, 离心条件为1200rpm, 25mins ，形成细胞分层；
c、吸取所述步骤b所得细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，离心条件为800rpm, 15mins，得白膜层细胞团；
d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤三次，弃去上层清液，得到细胞；
e、将所述步骤d的所得的细胞用步骤a所配制的完全培养基重新悬浮，台盼蓝染色，细胞计数板计数，调整活细胞浓度至2×106cells/ml，；
f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于培养体系中加入CD16单抗，ATG, IL-2，使得 ATG 浓度为1000ng/ml, CD16 单抗浓度为100μg/ml；IL-2浓度为1000U/ml，均为所占培养体系的浓度，记为第一天；将细胞培养板放入37oC培养箱中孵育4天，更换完全培养液，添加新鲜IL-2，使IL-2所占培养体系的浓度为1000U/ml；
g、3天更换一次培养液，继续培养25天，得到人自然杀伤细胞。
以上操作均需在GMP条件下完成，以确保NK细胞生长的无菌环境。
经检测，本实施例中的CD3-CD56+NK细胞，扩增后比例高达83%。
实施例3：
一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，包括以下步骤：
a、配制细胞完全培养液，备用，为NK细胞提供其生存和扩增所需要的营养成分；完全培养液含有2mM Gluta-MAX、100μg/ml青链霉素，其余为GMP CellGroR DC Serum-freeMedium与自体血清混合物，其中，自体血清占完全培养液体积的1%；
b、取室温淋巴细胞分离液100ml，将200 ml备用人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心, 离心条件为1800rpm, 20mins ，形成细胞分层；
c、吸取所述步骤b所得细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，离心条件为1200rpm,10mins，得白膜层细胞团；
d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤二，弃去上层清液，得到细胞；
e、将所述步骤d的所得的细胞用步骤a所配制的完全培养基重新悬浮，台盼蓝染色，细胞计数板计数，调整活细胞浓度至1×106cells/ml，；
f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于培养体系中加入CD16单抗，ATG, IL-2，使得 ATG 浓度为500ng/ml, CD16 单抗浓度为5μg/ ml；IL-2浓度为500U/ml，均为所占培养体系的浓度，记为第一天; 将细胞培养板放入37oC培养箱中孵育3天，更换完全培养液，添加新鲜IL-2，使IL-2所占培养体系的浓度为500U/ml；
g、2天更换一次培养液，继续培养20天，得到人自然杀伤细胞。
以上操作均需在GMP条件下完成，以确保NK细胞生长的无菌环境。
经检测，本实施例中的CD3-CD56+NK细胞，扩增后比例高达88%。
实施例4：
一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，包括以下步骤：
a、配制细胞完全培养液，备用，为NK细胞提供其生存和扩增所需要的营养成分；完全培养液含有2mM Gluta-MAX、100μg/ml青链霉素，其余为GMP CellGroR DC Serum-freeMedium与自体血清混合物，所述自体血清占完全培养液体积的15%；
b、取室温淋巴细胞分离液150ml，将200ml备用人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心, 离心条件为1500rpm, 23mins ，形成细胞分层；
c、吸取所述步骤b所得细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，离心条件为1500rpm,8mins，得白膜层细胞团；
d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤三次，弃去上层清液，得到细胞；
e、将所述步骤d的所得的细胞用步骤a所配制的完全培养基重新悬浮，台盼蓝染色，细胞计数板计数，调整活细胞浓度至1.5×106cells/ml，；
f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于培养体系中加入CD16单抗，ATG, IL-2使得 ATG 浓度为800ng/ml, CD16 单抗浓度为50μg/ml；IL-2浓度为800U/ml，均为所占培养体系的浓度，记为第一天; 将细胞培养板放入37oC培养箱中孵育4天，更换完全培养液，添加新鲜IL-2，使IL-2所占培养体系的浓度为800U/ml；
g、3天更换一次培养液，继续培养24天，得到人自然杀伤细胞。
以上操作均需在GMP条件下完成，以确保NK细胞生长的无菌环境。
经检测，本实施例中的CD3-CD56+NK细胞，扩增后比例高达90%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，其特征在于，包括以下步骤:
a、配制细胞完全培养液，备用；所述完全培养液含有2mM Gluta-MAX和100μg/ml青链霉素，其余为GMP CellGroR DC Serum-free Medium与胎牛血清混合物或GMP CellGroR DCSerum-free Medium与自体血清混合物；
b、取室温淋巴细胞分离液，将备用的人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心,形成细胞分层；
c、吸取所述步骤b所得所述细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，得白膜层细胞团；
d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤，弃去上层清液，得到细胞；
e、将所述步骤d所得的细胞用步骤a所配制的完全培养液重新悬浮，计数并调整活细胞浓度至0.5×106-2×106 cells/ml；
f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于细胞培养板中加入CD16单抗，ATG, IL-2记为第一天;将所述细胞培养板放入37℃ 培养箱中孵育适当时间后，更换所述完全培养液，第二次添加新鲜IL-2；
g、之后定期更换所述细胞完全培养液，培养适当时间，得到人自然杀伤细胞；
其中，所述ATG 浓度为50 ng/ml -1000ng/ml, CD16 单抗浓度为 2μg/ ml-100μg/ml；IL-2浓度为200U/ml-1000U/ml;所述第二次添加新鲜IL-2，使IL-2的浓度为200 U/ml-1000U/ml。
2.根据权利要求1所述的人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，其特征在于，所述步骤a中，所述GMP CellGroR DC Serum-free Medium和所述胎牛血清体积比为19:1～4:1。
3.根据权利要求1所述的人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，其特征在于，所述自体血清占所述完全培养液的体积比为1-15%。
4.一种因子组合应用，其特征在于，所述因子组合为：CD16单抗，ATG和IL-2；所述因子组合应用于人自然杀伤细胞体外高效扩增；其中，所述ATG的浓度为50 ng/ml -1000ng/ml,CD16 单抗的浓度为 2μg/ ml-100μg/ml；IL-2的浓度为200U/ml-1000U/ml。
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