CN103080302A - 自激淋巴球培养用培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法 - Google Patents

自激淋巴球培养用培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及培养恶性肿瘤治疗用自激淋巴球的培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法，尤其涉及一种在培养基内添加白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素12（IL-12）及白细胞介素18（IL-18）外还添加CD3及CD16抗体，有效地增加、活化NK（自然杀手）)细胞、T细胞及NKT细胞，并显著提高NK细胞在淋巴球细胞中所占比例，可培养治疗各种恶性肿瘤疗效出色的免疫细胞的自激淋巴球培养用培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法。根据本发明，自激淋巴球培养方法包括以下步骤：从人类末梢血萃取淋巴球的阶段；首先，在添加有白细胞介素2（IL-2）、左旋谷酰胺（L-glutamine）、自体血浆（plasma）的培养液中，在存在白细胞介素12（IL-12）、白细胞介素18（IL-18）、抗CD3及抗CD16抗体的条件下，培养所述萃取的淋巴球的第1培养阶段；把第1培养阶段中培养结束的培养混合液，混合到添加有IL-2、左旋谷酰胺及自体血浆的培养液中，在存在IL-12、抗CD16抗体、IL-18的条件下，进行培养的第2培养阶段。

Description

自激淋巴球培养用培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法
技术领域
本发明涉及培养恶性肿瘤治疗用自激淋巴球的培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法，尤其涉及一种在培养基内添加白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素12（IL-12）及白细胞介素18（IL-18）外还添加CD3及CD16抗体，有效地增加、活化NK（自然杀手）细胞、T细胞及NKT细胞，并显著提高NK细胞在淋巴球细胞中所占比例，可培养治疗各种恶性肿瘤疗效出色的免疫细胞的自激淋巴球培养用培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法。
背景技术
最近抗癌治疗中，作为可代替原有手术或放射线疗法、化疗的过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)受到人们的瞩目。
过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)是从患者的血液萃取自然杀手(Natural Killer：NK)细胞、树突状细胞（DC）、B细胞、T细胞等对于抗癌治疗最重要的免疫细胞后，利用各种刺激剂，培养成抗癌作用非常强的免疫细胞后，重新注入到患者体内的方法。该方法由于使用患者本人的血液，与原先的化疗等相比，副作用小，实施方法也简便，最近被广泛研究。
过继免疫疗法中活化的各种免疫细胞中，NK细胞是淋巴球的一种，对感染的病毒、肿瘤细胞的消灭能力出色，而且不会杀死大部分正常细胞。据研究，这种NK细胞对初期生物体防御机制和人体肿瘤免疫起重要作用。即，NK细胞即便没有由主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex:MHC)表达带来的免疫获得过程，也能杀伤某些自身组织细胞、同种细胞、甚至异种癌细胞，特别对Class1MHC表达少或不表达的目标细胞的杀伤力大。因此，NK细胞可有效杀伤不表达MHC的大部分癌细胞，之外还能杀伤一些被病毒感染的细胞和伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)等细菌。
但是，对癌细胞具有出色杀伤功能的NK细胞，在正常人的体内只有末梢血淋巴球的5～15%，特别对癌症患者来说，该比例降低到1%以下，如果不实施过继免疫疗法、提高该细胞的比例，其攻击癌细胞的效率存在很大的局限。
因此，为了通过过继免疫疗法治疗癌症，需要根据患者的癌症病情，大量培养、活化诸如NK细胞在内的各种免疫细胞，而这需要研究相关培养基。现有技术的适用于过继免疫疗法的免疫细胞培养用培养基，其注重点是大量增加免疫细胞中的T细胞。
这种现有技术的免疫细胞培养用培养基在韩国发明专利第0735081号（发明名称：CD4T细胞活化方法）中有所展示。所述CD4T细胞活化方法从血液等生物学试料分离CD4T细胞后，把分离的CD4T细胞通过添加GM-CSF、IFN-gamma、TNF-alpha、植物血凝素(Lectin)及IL-4的细胞因子的培养基进行培养，在试管内活化CD4T细胞，获得预防或治疗细菌感染疾病的合成物。
但所述CD4T细胞活化方法适用的培养基合成物，只筛选、活化免疫细胞中的与获得性免疫相关的T细胞。因此，把该方法适用于治疗肿瘤时，虽然对事件记住的癌细胞可通过大量活化的T细胞有效攻击、杀伤，但对没有记住的各种癌细胞的杀伤效果有限，治疗恶性肿瘤存在局限性。
为了解决这一问题，本发明的发明人先前申请的专利——韩国公开专利第2008-0053929号（发明名称：自激淋巴球培养方法）中提供了一种从人的末梢血分离淋巴球后，在含白细胞介素2（IL-2）、抗CD3、抗CD16及抗CD56抗体的环境下，对其进行培养，提高淋巴球细胞中的NK细胞比例，均匀地活化NK细胞、T细胞及NKT细胞，有效杀伤多种癌细胞的方法。
图1及图2为通过所述自激淋巴球培养方法获得的活化淋巴球表现型变化图表。其中，H1区域为NK细胞、H4区域为T细胞、H2区域为NKT细胞、H3区域为其他免疫细胞的分布。
对以所述自激淋巴球培养方法培养的活化淋巴球，通过流式细胞分析仪(flowcytometry)，分析表面抗原的结果，如图1、图2所示，在培养前，如图1所示，表面抗原的分布最多的是H4区域，而培养后，如图2所示，表面抗体分布最多的是H1区域。而培养后的淋巴球所含CD16+CD56Positive NK细胞的比例由培养前的12.74%变化到培养后的63.42%，NK细胞的比例有所上升。
通过细胞毒性(cytotoxicity)分析，对培养后的活化淋巴球血癌细胞株杀伤能力进行了检测。其结果，与从普通血液萃取的淋巴球相比，活化淋巴球的细胞毒性增加了6～32倍。
如上所述，通过活化免疫细胞，扩大NK细胞的比例，以此提高细胞毒性，提高对癌细胞的杀伤能力，这显然有助于提高抗癌治疗效果。
而淋巴球细胞中NK细胞对未表达MHC的大部分癌细胞杀伤能力出色。大量提高该细胞的含量并活化该细胞时，可以实现更有效的抗癌治疗。为此，有关研究正致力于开发诣在培养NK细胞的淋巴球培养基合成物及淋巴球培养方法。
发明内容
发明的课题
本发明是为了解决现有技术的问题点而提出的发明，其目的在于提供一种在培养基内添加白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素12（IL-12）及白细胞介素18（IL-18）外还添加CD3及CD16抗体，有效地增加、活化NK细胞、T细胞及NKT细胞，并显著提高NK细胞在淋巴球细胞中所占比例，可培养治疗各种恶性肿瘤疗效出色的免疫细胞的自激淋巴球培养用培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法。
实施方案
本发明提供一种自激淋巴球培养用培养基合成物，由细胞培养用培养基及向细胞培养用培养基添加的添加剂构成，用于大量培养自激淋巴球，其特征在于：所述添加剂包括白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素12（IL-12）及白细胞介素18（IL-18）外还添加CD3及CD16抗体。
本发明提供一种自激淋巴球培养方法，其特征在于：包括从人类末梢血萃取淋巴球的阶段；在添加有白细胞介素2（IL-2）、左旋谷酰胺（L-glutamine）、自体血浆（plasma）的培养液中，在存在白细胞介素12（IL-12）、白细胞介素18（IL-18）、抗CD3及抗CD16抗体的条件下，培养所述萃取的淋巴球的第1培养阶段；把第1培养阶段中培养结束的培养混合液，混合到添加有IL-2、左旋谷酰胺及自体血浆的培养液中，在存在IL-12、抗CD16抗体、IL-18的条件下，进行培养的第2培养阶段。
发明效果
本发明的自激淋巴球培养用培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法有效地增加并活化NK细胞、T细胞及NKT细胞的同时，增加淋巴球细胞中的NK细胞相对所占比例，通过大量活化的NK细胞，对未表达MHC的大部分癌细胞进行杀伤，适用于副作用少、实施方法简单的过继免疫疗法，对广大因恶性肿瘤受折磨的癌症患者恢复健康有很大的帮助。
附图说明
图1为通过现有技术的培养方法获得的活化淋巴球表现型变化示意图。
图2为通过现有技术的培养方法获得的活化淋巴球表现型变化示意图。
图3为通过本发明的自激淋巴球培养方法获得的活化淋巴球表现型变化示意图。
图4为通过本发明的自激淋巴球培养方法获得的活化淋巴球表现型变化示意图。
图5为通过本发明的自激淋巴球培养方法获得的NK细胞数变化与通过现有技术的自激淋巴球培养方法获得的NK细胞数变化比较示意图。
图6为通过本发明的自激淋巴球培养方法培养的活化淋巴球细胞毒性分析结果与通过现有技术的自激淋巴球培养方法培养的活化淋巴球细胞毒性分析结果比较示意图。
具体实施方式
本发明提供一种生产自激淋巴球的方法，为了把来自人类末梢血的淋巴球培养，生成具恶性肿瘤疗效出色的免疫细胞构成比例的自激淋巴球，把白细胞介素12（IL-12）、白细胞介素18（IL-18）、CD3及CD16抗体作为添加剂使用，通过培养基有效增加及活化养NK细胞、T细胞及NKT细胞。
说明本发明具体实施例之前，先说明各免疫细胞的特征和用于增加及活化各免疫细胞的所述各添加物的作用。
NK细胞是淋巴球的一种，作为一种大颗粒淋巴球(LGL,Large granularlymphocytes)，其抗肿瘤作用是通过细胞坏死(necrosis)或程序性细胞死亡(apoptosis)，或者两者同时起作用所显现。NK细胞与IL-2、IL-12、干扰素(Interferon)等细胞因子(cytokine)反应，通过此其细胞毒性（cytotoxicity）、分泌性(secretory)、增殖性(proliferative)功能上升。NK细胞的表现型(phenotype)对于人来说是CD16(FcγRIII)、CD56。CD16与CD56由于在细胞表面没有TRC(胸腺衍生细胞受体复合物)，被当做NK细胞的标记（marker）利用。
IL-2是T细胞认知抗原、被激活时生成的分质量为14～17kDa的糖蛋白(glycoprotein)，被分泌到T细胞外后，与生产IL-2的T细胞反应，促进相应T细胞的成长。IL-2还作用于NK细胞，促进其成长，强化NK细胞的杀伤能力，作用于B细胞，促进其成长。
IL-12由树突状细胞（DC）和巨噬细胞、B细胞生产。IL-12在NK细胞和T淋巴球中，诱导IFN-γ和TNR-α的生产，起减少IL-4生产的作用。而IL-4阻碍IFN-γ。另外IL-12增加NK细胞和CD8+cytotoxic T淋巴球细胞毒性。IL-12与NK细胞内IL-2信号传达体系有密切关系。另外，IL-2诱导NK细胞内的IL-12受体β1和IL-12受体β2的表达，让与IL-12信号传达体系相关的各种蛋白质表达及活化。这种机能在NK细胞的IFN-γ生产能力与目标细胞杀伤能力上已得到很好的证明。据知，IL-12受体β对IL-12功能起重要作用，据研究，其阻碍Th2生成的同时，让Th1的生成正常进行。T细胞与NK细胞细胞中，IL-12的信号传达包含于JAK-STAT信号传达体系，IL-12受体β2的活性诱导转录因子STAT4的磷酸化，为其活化起重要作用。
IL-18生产与巨噬细胞，是促炎细胞因子的基因。IL-18结合在IL-18受体，与IL-12一起对感染于细菌或病毒的细胞起免疫反应，在NK细胞和T细胞中提高IFN-γ的生产。本发明中，向培养液添加IL-12，诱导IFN-γ表达的同时，诱导IFN-γ生成所必须的因子IL-18受体的表达，活化NK细胞。
NK细胞的癌细胞作用机制通常是抗体依赖的细胞介导的细胞毒（antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity:ADCC）。NK细胞表达对免疫球蛋白G（IgG）的Fc的受体——CD16，通过该受体可事实另一形式的MHC非限制性杀伤。即，NK细胞的ADCC依赖于认知目标细胞的抗体的存在，抗体与抗原结合时，抗体的Fc部位露出。而露出的Fc部位与NK细胞的受体结合形成桥后，由于受体结合发生的信号传达，让NK细胞细胞释放细胞杀伤物质，让目标细胞受到伤害。
存在抗CD16抗体或抗原抗体复合体的情况下培养淋巴球时，抗CD16抗体附着到NK细胞，发生信号传达。在这些刺激作用下，NK细胞的IL-2受体α链等转铁蛋白(transferrin)受体得到表达，或者肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor;TNF)或IFN-γ得到生产。
另外，T细胞指在细胞表面具有抗原受体(T cell receptor;TCR)的细胞。TCR与α链和β链的二聚体CD3抗原形成异质二聚体。T细胞的一部分（末梢血T细胞的5%左右）形成γ链和δ链的二聚体，而非αβ二聚体。TCR与CD3抗原（γ、δ、ε、ζ、ζ或η）形成复合体，CD3抗原在TCR认知抗原后，把该信号传达到细胞内部。
辅助性T细胞通常促进对癌细胞的免疫反应，通过释放多种细胞因子，活化杀手T细胞、B细胞及巨噬细胞、NK细胞等。其细胞因子的种类有细胞与细胞之间的信息传达物质IL-1、IL-2、IL-3、TNF-α及IFN-γ等多种物质。本发明中，向培养液添加IL-2，活化T细胞、NK细胞、NKT细胞等免疫细胞。
NKT细胞是内在免疫的一个执行员，是较晚才发现其一些功能的一种T细胞。从名称可以知道，其表达T细胞的受体和NK细胞特有的细胞表面标记(surface marker)。NKT细胞的一种令人吃惊的特征为活化后再很短时间内分泌IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNR-α等各种细胞因子。这种特征意味着NKT细胞可以在适应免疫反应中产生巨大的影响。
从而，本发明为了均匀活化取自人类末梢血淋巴球中的自NK细胞、T细胞及NKT细胞，在培养时把IL-2、IL-12和IL-18细胞激素以及抗CD3抗体、抗CD16抗体等单一抗体作为添加物添加到培养基中。而添加物中的IL-2、IL-12、IL-18起增加NK)胞的作用，各单一抗体其抗原作用、在免疫细胞上表达CD3、CD16。
下面，对本发明自激淋巴球培养方法进行详细说明。
本发明的自激淋巴球培养方法大体上由淋巴球萃取阶段，第1培养阶段，第2培养阶段及第3培养阶段构成。
首先，对各培养阶段使用的培养基合成物进行说明。
第1培养基合成物
第1培养基合成物用于第1培养阶段，由细胞培养用培养基、添加到细胞培养用培养基的各种添加剂构成，以细胞培养用培养基39ml为准，作为免疫细胞培养所需营养成分，添加190～210mM的左旋谷酰胺（L-glutamine）350～430ul及2～5ml自体血浆（plasma）；作为免疫细胞活化成分，添加17×106～19×106IU/ml的IL-23～10ul、由90～110ug/ml的IL-123～10ul、90～110ug/ml的IL-1810～30ul；作为最终培养的免疫细胞（NK细胞、NKT细胞、T细胞）相对比例调节成分，添加0.9～1.1mg/ml的抗CD3及抗CD16抗体抗体各2～30ul。
利用这种培养基合成物培养淋巴球的过程中，为了提高培养效率，适用继代培养方式为宜。首先利用如上配比培养基合成物，培养3～4天后，以3～4天时间，把培养有淋巴球的培养基合成物，混入到具有如下配比的第2培养基合成物中，追加培养1～2天为宜。
第2培养基合成物
第2培养基合成物用于继代培养，向细胞培养用培养基以所述细胞培养用培养基67ml为准，作为免疫细胞培养所需营养成分，添加190～210mM的左旋谷酰胺（L-glutamine）650～740ul及2～5ml自体血浆（plasma）；作为免疫细胞活化成分，添加17×106～19×106IU/ml的IL-23.5～7.8ul、由90～110ug/ml的IL-122～10ul、90～110ug/ml的IL-1820～50ul；作为最终培养的免疫细胞（NK细胞、NKT细胞、T细胞）相对比例调节成分，添加0.9～1.1mg/ml的抗CD16抗体4～80ul。
用于所述第1及第2培养基合成物的细胞培养用培养基是向含氨基酸、维生素、有无机化合物、蛋白质等细胞生长与生存所必须营养素的普通培养基，添加800～1200IU（国际单位）/ml的IL-2的培养基，作为其一例有NKB6040（NKBIO,KOREA）。
下面，对利用所述培养基合成物的本发明自激淋巴球培养方法，进行详细说明。
本发明的自激淋巴球培养方法大体上由淋巴球萃取阶段，第1培养阶段，第2培养阶段及第3培养阶段构成。
淋巴球萃取阶段
利用人类的淋巴球或单核球等单核细胞的比重小于1.077的特点，把治疗对象患者的血液，添加到1.077比重的淋巴细胞分离液（Ficoll-Paque Plus溶液），以一定的离心力，进行离心沉淀，让比重大于1.077的红血球和粒细胞层沉淀，让比重小于1.077的单核细胞层和血小板等浮上，获得含淋巴球的单核细胞层，从分离的单核细胞层只萃取淋巴球。
第1培养阶段
把通过所述淋巴球萃取阶段获得的淋巴球，在添加有IL-2、左旋谷酰胺（L-glutamine）、自体血浆（plasma）的培养液中，在存在IL-12、IL-18、抗CD3及抗CD16抗体的条件下，培养3～4天。这里，在添加有IL-2、左旋谷酰胺（L-glutamine）、自体血浆的培养液中，先在存在抗CD3抗体的条件下培养后，在IL-12、抗CD16抗体及IL-18存在的条件下再次培养为宜，其具体过程如下。
首先，用获得的淋巴球通过5ml培养液制成悬浊液后，混入到装放有含17×106～19×106IU/ml的IL-2的稀释液2～10ul、190～210mM的左旋谷酰胺（L-glutamine）350～430ul及2～5ml自体血浆（plasma）的培养液29～32ml，固化有抗CD3抗体的25cm2的第1培养容器，在37℃条件下，CO2培养器中培养30分钟至2小时。以此，首先以少量培养液制造淋巴球悬浊液，可降低淋巴球细胞损失的同时，可以防止少量添加的IL-2、左旋谷酰胺及自体血浆的损失。
这里，在把单一抗体抗CD3抗体固化在培养容器的状态下，培养淋巴球。这是因为，可通过抗CD3抗体在培养初期诱导T细胞的活性，诱导NK细胞增殖所需各因子的表达及分泌。这里，如果在存在抗CD3抗体的条件下，培养过长时间，则存在大部分细胞分布向T细胞增殖的倾向。因此培养适当时间，对于提高NK细胞比例非常重要。
接下来，把固化有抗CD3抗体的第1培养容器内的培养混合液移到固化有抗CD3抗体的25cm2第2培养容器，添加90～110ug/ml的IL-123～10ul及0.9～1.1mg/ml的抗CD16抗体2～30ul，以37℃CO2培养器中培养1小时至3小时后，把90～110ug/ml的IL-1810～30ul添加到固化有抗CD3抗体的25cm2第2培养容器中，培养48小时至78小时。这里，第1培养容器及第2培养容器中固化有抗CD3抗体2～30ul。
上面，把IL-12和抗CD16抗体同时添加到第2培养容器，这与分别添加IL-12和抗CD16抗体的情况相比，可更加提高转录因子的活性，诱导IFN-γ的表达，可以促进NK细胞的增殖和活性。另外，IL-18是IFN-γ生成所必须的因子，由于IL-12诱导IL-18受体的表达，因此在添加IL-12后把IL-18添加到第2培养容器为宜。
之后再添加含IL-2、左旋谷酰胺、自体血浆的5ml培养液，培养12至18小时后，移到75cm2的第3培养容器，添加含IL-2、左旋谷酰胺、自体血浆的30ml培养液，培养2至3天。
第2培养阶段
首先，把第1培养阶段培养结束的培养混合液混入到含IL-2、左旋谷酰胺、自体血浆的培养液中，在存在IL-12和抗CD16抗体的条件下，进行培养。之后再添加IL-18进行培养。其具体过程如下。
首先，向装放有含17×106～19×106IU/ml的IL-2的稀释液3.5～7.8ul、190～210mM的左旋谷酰胺（L-glutamine）650～740ul及2～5ml自体血浆（plasma）的培养液2～7ml的150cm2的第4培养容器，转移经所述第1培养阶段培养的培养混合液。之后，向第4培养容器添加含IL-2、左旋谷酰胺、自体血浆的培养液20ml的同时，添加90～110ug/ml IL-121～10ul和0.9～1.1ml/ml抗CD16抗体2～40ul，培养1至3小时。在这一阶段，与前述第1培养阶段相同，同时添加IL-12和抗CD16抗体，更加提高转录因子的活性，诱导IFN-γ的表达，促进NK细胞的增殖和活性，之后再添加IL-18，通过IL-12诱导IL-18受体的表达。
接下来，向第4培养容器添加90～110ug/ml的IL-1820～50ul，培养12至18小时后，一边添加含IL-2、左旋谷酰胺、自体血浆的培养液40ml，一边添加0.9～1.1mg/ml的抗CD16抗体2～40ul后，再培养12至18小时。
第3培养阶段
向所述第2培养阶段培养结束的培养混合液（86～119ml），添加自体血浆（5～10ml），把添加有自体血浆的培养混合液注入到含1升培养液的透气性培养袋后，再培养6～9天，让细胞大量增殖。
在第3培养阶段使用的培养液与前述两个阶段相同，使用含氨基酸、维生素、有无机化合物、蛋白质等细胞成长和生存所必须营养素的培养液，包括IL-2100～200IU/ml为宜。
进行如上第1、第2及第3培养阶段的过程中，NK细胞、T细胞、NKT细胞数量大量增加，各细胞的大小也会增加，实际培养试验结果，从60cc血液分离淋巴球时的总细胞数为2.0×106～4.0×107，而培养后增加到1.0×109～3.0×109。
下面，通过具体实施例，查看利用本发明自激淋巴球培养用培养基合成物培养自激淋巴球后，从培养的自激淋巴球观察到的淋巴球表现型及细胞数的变化、培养的自激淋巴球细胞毒性分析结果。但，这些实施例的目的只是帮助理解本发明，本发明的范围不受限于此。
首先，利用本发明的自激淋巴球培养用培养基合成物，培养自激淋巴球的过程，通过实施例1，进行说明。
实施例1：自激淋巴球的制造
用取自患者末梢血60cc的淋巴球1×107个细胞，以1ml培养液支撑悬浊液后，混入到添加有IL-2、左旋谷酰胺、自体血浆的9ml培养液中，在存在IL-12、IL-18、抗CD3抗体、抗CD16抗体的条件下，培养4天，实施第1培养阶段。
这里第1培养阶段中使用的培养液为以培养液39ml为准，作为免疫细胞培养所需营养成分，添加200mM的左旋谷酰胺400ul及4ml自体血浆；作为免疫细胞活化成分，添加18×106IU/ml的IL-24ul、由100ug/ml的IL-124ul、100ug/ml的IL-1820ul；作为最终培养的免疫细胞相对比例调节成分，添加1mg/ml的抗CD3及抗CD16抗体抗体各2.5ul的培养液。
接下来，把通过第1培养阶段获得的培养混合液，混入到含IL-2、左旋谷酰胺、自体血浆的培养液30ml中，在存在IL-12、IL-18及抗CD16抗体的条件下，再培养2天，实施第2培养阶段。
这里，第2培养阶段使用的培养液为以培养液67ml为准，作为免疫细胞培养所需营养成分，添加200mM的左旋谷酰胺670ul及5ml自体血浆；作为免疫细胞活化成分，添加18×106IU/ml的IL-26.5ul、由100ug/ml的IL-128ul、100ug/ml的IL-1840ul；作为最终培养的免疫细胞相对比例调节成分，添加1mg/ml的抗CD16抗体5ul的培养液。
之后，向第2培养阶段培养结束的培养混合液，添加自体血浆10ml，把添加有自体血浆的培养混合液注入到含1升培养液的透气性培养袋后，再培养7天，实施第3培养阶段。
从以此培养的活化淋巴球所观察到的培养前后表现型及细胞数变化和对各种癌细胞的细胞毒性分析结果，如实施例2及实施例3所示。
实施例2：观察培养前后表现型及细胞数变化
图3及图4为培养前后淋巴球表现型变化示意图，H1区域为NK细胞，H4区域为T细胞，H2区域为NKT细胞，H3区域为其他免疫细胞分布区域。图5为通过本发明的自激淋巴球培养方法获得的NK细胞数变化与通过现有技术的自激淋巴球培养方法获得的NK细胞数变化比较示意图。
对以实施例1的方法培养的活化淋巴球，通过流式细胞分析仪(flowcytometry)，分析了表面抗原。结果，如图3、图4所示，培养前如图3所示，表面抗原分布最多的是H4区域，而培养后如图4所示，表面抗原分布最多的是H1区域。
计算实际CD16+CD56Positive NK细胞比例的结果，如图5所示，培养的活化淋巴球中CD16+CD56Positive NK细胞比例为平均86.7%，非常高。
换句话说，与本发明申请人的在存在IL-2、抗CD3抗体、抗CD16抗体、抗CD56抗体的条件下，培养来自人类末梢血的淋巴球的现有培养方法（韩国公开专利第2008-0053929号）培养出的NK细胞平均比例（63.42%）相比，本发明培养的活化淋巴球，由于IL-2、IL-18的添加，其NK细胞比例，高出20～30%，而这种NK细胞比例的增加，可通过后述的细胞毒性分析，确认其与疗效有直接关系。
实施例3：对各种癌细胞的细胞毒性（cytotoxicity）分析
图6为通过本发明的自激淋巴球培养方法培养的活化淋巴球细胞毒性分析结果与通过现有技术的自激淋巴球培养方法培养的活化淋巴球细胞毒性分析结果比较示意图。
本细胞毒性分析中，把实施例1培养的活化淋巴球作为效应细胞（effectorcell），把血癌细胞株（K562）作为靶细胞（target cell）使用，与癌细胞相对的活化淋巴球比例设置为10：1，对活化淋巴球的血癌细胞株的杀伤能力进行了检测。
另外，以与上述条件相同的条件，把本发明申请人曾经获取专利的现有技术培养法培养出的活化淋巴球作为效应细胞使用，进行了相同的细胞毒性分析。分析结果如图6所示。
如图6所示，现有培养法培养出的活化淋巴球平均细胞毒性为47%，而本发明培养方法所培养出的活化淋巴球平均细胞毒性为93%，与现有技术相比，本发明培养的活化淋巴球表现出高2倍以上的癌细胞杀伤能力。另外，本实施例适用的培养前淋巴球具有平均5%以下的细胞毒性。这说明本发明培养的活化淋巴球的细胞毒性与培养前相比提高20倍以上。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
产业利用可行性
本发明的自激淋巴球培养用培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法，有效地增加并活化NK细胞、T细胞及NKT细胞的同时，增加淋巴球细胞中的NK细胞相对所占比例，通过大量活化的NK细胞，对未表达MHC的大部分癌细胞进行杀伤，适用于副作用少、实施方法简单的过继免疫疗法，对广大因恶性肿瘤受折磨的癌症患者恢复健康有很大的帮助。

Claims (14)

1.一种自激淋巴球培养用培养基合成物，由细胞培养用培养基及向细胞培养用培养基添加的添加剂构成，用于大量培养自激淋巴球，其特征在于：
所述添加剂包括白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素12（IL-12）及白细胞介素18（IL-18）外还添加CD3及CD16抗体。
2.根据权利要求1所述的自激淋巴球培养用培养基合成物，其特征在于：
所述细胞培养用培养基含有800～1200IU（国际单位）/ml的IL-2。
3.根据权利要求1所述的自激淋巴球培养用培养基合成物，其特征在于：
所述添加到细胞培养用培养基的添加剂，以所述细胞培养用培养基39ml为准，由17×106～19×106IU/ml的IL-23～10ul、由90～110ug/ml的IL-123～10ul、90～110ug/ml的IL-1810～30ul、0.9～1.1mg/ml的抗CD3抗体2～40ul及0.9～1.1mg/ml的抗CD16抗体2～40ul构成。
4.根据权利要求3所述的自激淋巴球培养用培养基合成物，其特征在于：
所述添加剂以所述细胞培养用培养基39ml为准，还包括190～210mM的左旋谷酰胺（L-glutamine）350～430ul及2～5ml自体血浆（plasma）。
5.根据权利要求1所述的自激淋巴球培养用培养基合成物，其特征在于：
所述添加到细胞培养用培养基的添加剂以所述细胞培养用培养基67ml为准，由
17×106～19×106IU/ml的IL-23.5～7.8ul、由90～110ug/ml的IL-122～10ul、90～110ug/ml的IL-1820～50ul、0.9～1.1mg/ml的抗CD16抗体4～80ul构成。
6.根据权利要求5所述的自激淋巴球培养用培养基合成物，其特征在于：
所述添加剂以细胞培养用培养基67ml为准，还包括190～210mM的左旋谷酰胺（L-glutamine）650～740ul及2～5ml自体血浆（plasma）。
7.一种自激淋巴球培养方法，其特征在于：包括
从人类末梢血萃取淋巴球的阶段；
在添加有白细胞介素2（IL-2）、左旋谷酰胺（L-glutamine）、自体血浆（plasma）的培养液中，在存在白细胞介素12（IL-12）、白细胞介素18（IL-18）、抗CD3及抗CD16抗体的条件下，培养所述萃取的淋巴球的第1培养阶段；
把第1培养阶段中培养结束的培养混合液，混合到添加有IL-2、左旋谷酰胺及自体血浆的培养液中，在存在IL-12、抗CD16抗体、IL-18的条件下，进行培养的第2培养阶段。
8.根据权利要求7所述的自激淋巴球培养方法，其特征在于：
所述第1培养阶段中，把所述萃取的淋巴球首先以添加有IL-2、左旋谷酰胺、自体血浆的培养液，在固化有抗CD3抗体的第1培养容器内进行培养后，再把所述第1培养容器内的培养混合液移到第2培养容器，添加IL-12及抗CD16抗体、再次进行培养后，向所述第2培养容器内添加IL-18、再一次进行培养。
9.根据权利要求7所述的自激淋巴球培养方法，其特征在于：
所述第1培养阶段中，把所述萃取的淋巴球首先以装放有IL-2、左旋谷酰胺及自体血浆，固化有抗CD3抗体的第1培养容器，培养30分钟至2小时后，把所述第1培养容器内的培养混合液移到第2培养容器中，添加IL-12及抗CD16抗体，培养1小时至3小时后，再向所述第2培养容器添加IL-18，培养48小时至72小时后，向所述第2培养容器内一边添加含IL-2、左旋谷酰胺及自体血浆的培养液，一边培养12小时至18小时后，把所述第2容器内的培养混合液移到第3培养容器，添加添加IL-2、左旋谷酰胺、自体血浆，培养2天至3天。
10.根据权利要求7所述的自激淋巴球培养方法，其特征在于：
所述第2培养阶段中，把第1培养阶段培养出的培养混合液，首先以添加有IL-2、左旋谷酰胺及自体血浆的培养液，添加IL-12及抗CD16抗体，进行培养后，向所述培养的培养混合液中添加IL-18，再次进行培养。
11.根据权利要求7所述的自激淋巴球培养方法，其特征在于：
所述第2培养阶段中，向装放有含IL-2、左旋谷酰胺、自体血浆的培养液的第4培养容器，混入经过所述第1培养阶段培养的培养混合液，培养1小时至3小时后，向所述第4培养容器添加IL-18，培养12小时至18小时后，一边添加含IL-2、左旋谷酰胺、自体血浆的培养液，一边添加抗CD16抗体，培养12小时至18小时。
12.根据权利要求7所述的自激淋巴球培养方法，其特征在于：
所述第1及第2培养阶段使用的培养液包括IL-2800～1200IU（国际单位）/ml。
13.根据权利要求7所述的自激淋巴球培养方法，其特征在于：
还包括向经所述第2培养阶段培养的培养混合液中添加自体血浆后，把添加有所述自体血浆的培养混合液注入到含培养液的透气培养袋后，进行培养的第3培养阶段。
14.根据权利要求13所述的自激淋巴球培养方法，其特征在于：
在所述第3培养阶段使用的培养液包括IL-2100～200IU/ml。
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