KR101133185B1

KR101133185B1 - 자연살해세포의 증식방법

Info

Publication number: KR101133185B1
Application number: KR1020080074069A
Authority: KR
Inventors: 안용운; 정미영; 허대석; 황유경
Original assignee: 서울대학교병원; 주식회사 녹십자랩셀
Priority date: 2008-07-29
Filing date: 2008-07-29
Publication date: 2012-04-06
Also published as: JP2011529341A; WO2010013947A2; JP5358683B2; CN102112600B; CN102112600A; WO2010013947A3; KR20100012586A

Abstract

본 발명은 향상된 자연살해 세포(Natural Killer cell, NK cell)의 증식방법에 관한 것으로, 구체적으로는 자연살해세포를 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 말초혈 백혈구 세포의 존재하에 배양하는 공정을 포함하는, 자연살해세포의 증식방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법은 기존 자연살해 세포의 증식방법에 비해 증식률을 현격히 증가시킴으로써, 다량의 자연살해 세포를 수득할 수 있는 획기적인 자연살해세포의 증식방법을 제공한다.

자연살해 세포(NK cell), 증식, 항CD3 항체, 인터루킨

Description

자연살해세포의 증식방법 {Method for Proliferating Natural Killer cell}

본 발명은 높은 수율로 자연살해 세포(Natural Killer cell, NK cell)를 증식시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 자연살해세포를 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 말초혈 백혈구 세포의 존재하에 배양하는 공정을 포함하는 자연살해세포의 증식방법에 관한 것이다.

자연살해 세포(이하, 「NK cell」로 약칭하는 경우가 있다)는 면역반응의 일익을 담당하는 림프구계 세포이다. 이 세포에는 여러 기능이 있지만, 특히 종양세포를 죽이는 강한 활성이 있기 때문에, 체내에서는 종양화된 또는 종양화하고 있는 이상이 있는 세포를 제거하는 면역 감시기구의 중요 멤버로 생각되고 있다. 따라서, 이 세포를 종양치료나, 종양의 발생원이 되는 것으로 상정되고 있는 바이러스 감염세포의 제거에 유효하게 이용하고자 하는 연구는 옛부터 행해지고 있었다.

정상인 체내에 존재하는 대부분의 NK cell은 비활성화 상태로 존재한다. 많은 연구자들이 정상혈액으로부터 혹은 비활성화된 환자혈액으로부터 NK cell을 활 성화시키는 연구를 진행하였다.

체외에서 활성화된 NK cell의 높은 세포독성(cytotoxicity)은 면역세포치료제로의 가능성을 열었으며, 다양한 암종에 대하여 in vitro에서, 혹은 동물실험으로 가능성을 확인하였다. 보통은 종양세포주(tumor cell line)를 이용하여 in-vitro 세포독성d을 확인하였으며, 혈액암, 간암, 폐암, 신장암, 소아신경암, 피부암 등 다양한 암종에 대하여 상당한 세포독성을 나타내었다. 특히 혈액암과 소아신경암종에 대하여 임상 및 비임상에서 긍정적 치료효과를 보여주었다.

이러한 임상 가능성에도 불구하고 체내에 존재하는 NK cell의 수는 그다지 많지 않고, 치료적 효과를 보이기 위해 필요한 유효 NK cell의 수는 매우 많으므로 백혈구 분반술 (Leukapheresis)을 시행하여 다량의 백혈구를 수집한다 하더라도 한 번 채혈로 한두 번의 치료밖에 할 수 없게 된다.

세포 치료요법(Cell therapy)에 있어서 충분한 세포 수(cell dose)와 반복투여는 매우 중요한 요소인데, NK cell의 증식이 미비하여 충분한 수의 세포가 투여되지 못한 경우는 임상에 적용하는 가장 큰 문제점이 되었고, 이러한 점을 극복하기 위해 NK cell 증식에 대한 많은 연구가 있었지만 임상에 적용 가능한 수준에 미치지 못하였다. 일반적으로 IL-2 혹은 그 밖의 사이토카인(cytokine) 및 화합물(chemical)을 이용한 NK cell 증식에 대한 연구는 초기 분리된 NK cell 수의 3~10배 정도의 증가에 미치지 못하였다.

1990년대 이후 자연살해세포 증식에 관한 연구가 여러 방면으로 진행되었다. 기존 T 세포 증식/활성에 사용하였던 IL-2 뿐만 아니라 IL-15 (Dunne J et al., Immunology, vol.167:3129. 2001; SA Perez, et al., Blood, vol.106:158, 2005), LPS (MR Goodier et al., Immunology 165:139, 2000), CD3를 자극하는 OKT-3항체(Condiotti R, et al., Experimental Hematology 29:104, 2001)를 이용하여 단독/복합 형태로 사용함으로써 자연살해세포를 증식시키는 연구가 있었다. 그러나, 이들은 고전적으로 사용하였던 IL-2 사용에 대한 변형 및 발전의 형태로 새로운 증식 물질을 찾았을 뿐, 획기적인 증식 방법을 제시하지는 못하였다.

한편, 일부 연구자에 의하여 종양 세포주를 지지세포(feeder cell)로 사용하여 NK cell을 증폭시킨 사례도 보고된 바가 있으나, 대부분 종양 세포주를 지지세포로 사용하는 등 임상 적용에 중요한 안전성을 보장하기에 적합하지 않은 방법을 사용한 것이었다.

이에 본 발명자들은 불활성화된 자가 말초혈액 세포를 지지세포(feeder cell)로 사용하여 안전성을 확보하고, OKT-3 항체와 IL-2를 동시에 처리함으로써 자연살해 세포의 살해능은 유지되면서 증식률은 현격히 증가되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 자연살해 세포를 높은 효율로 증식시키는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자연살해세포를 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 말초혈 백혈구 세포(peripheral blood lymphocyte, PBL)의 존재하에 배양하는 공정을 포함하는, 고순도의 자연살해세포를 단기간에 폭발적으로 증식시키는 방법을 제공한다.

바람직한 예로서, 본 발명은 자연살해세포의 배양에 있어서, 자기 PBL(peripheral blood lymphocyte)을 지지세포(feeder cell)로 사용하면서 OKT-3 항체와 IL-2를 동시에 처리한다.

또한, 상기 방법은 배양물에서 항-CD3 항체를 제거하는 공정 및 상기 항-CD3 항체가 제거된 배양액을 인터루킨 단백질이 함유된 배지에 첨가하여 추가 배양하는 공정을 포함하되, 이 때, 추가 배양을 위해 첨가하는 항-CD3 항체가 제거된 배양액 에는 1 x 10⁵내지 3 x 10⁶cells/well 농도의 자연살해세포가 함유되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 자연살해 세포 증식방법은 기존의 방법에 비하여 자연살해 세포의 살해능을 유지하면서 최대 증식이 가능한 획기적인 방법이므로, 적은 양의 채혈 로 많은 수의 자연살해 세포를 수득할 수 있게 됨으로써 세포치료제로의 상용화에 유용하다.

본 발명은 일 관점에서, 자연살해 세포(Natural killer cell, NK cell)를 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 말초혈 백혈구 세포(PBL; peripheral blood lymphocyte)의 존재하에 배양하는 공정을 포함하는, 자연살해 세포의 증식방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 자연살해 세포 증식방법은, 특별히 제한되지는 않지만 예를 들어, 이하와 같은 공정을 포함하여 수행될 수 있다:

(i) 인간 말초혈액으로부터 발초혈 백혈구 세포 및 자연살해 세포를 분리하는 공정;

(ii) 자연살해 세포를 분리하지 않은 자가 말초혈 백혁구 세포를 불활성화시키는 공정(불활성화된 지지세포를 준비하는 공정);

(iii) 자연살해세포를 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 불활성화된 말초혈 백혈구 세포의 존재하에 배양하는 공정;

(iv) 상기 배양물에서 항-CD3 항체를 제거하는 공정; 및

(v) 상기 항-CD3 항체가 제거된 배양액을 인터루킨 단백질이 함유된 배지에 첨가하여 추가 배양하는 공정.

자연살해 세포 (Natural killer cell, NK cell)는 정상인 혈액 내에 약 10~15% 가량 존재하며, 비자기(non-self)와 반응할 때 높은 살해능을 가진다. 각종 virus에 감염된 세포나 세균 침투, 혹은 비정상 세포의 생성에 있어, NK cell은 비특이적으로 즉각적으로 반응하여 이물질을 제거한다. 그러나, 체내에 존재하는 NK cell의 수는 그다지 많지 않고, 치료적 효과를 보이기 위해 필요한 유효 NK cell의 수는 매우 많아야 하므로, 효과적인 NK cell 증식 방법에 대한 필요성이 요구되고 있는 실정이다.

자연살해 세포를 증식시키는 방법은 크게 두 가지로 생각할 수 있다. NK cell 만을 순수하게 분리한 다음 지지 세포(feeder cell)을 사용하면서 적절한 자극을 주어 증폭하는 방법이 있고, 전체 말초혈 백혈구 세포(PBL; peripheral blood lymphocyte) 또는 말초혈 단핵구 세포(PBMC; peripheral blood mononuclear cell)에서 NK cell을 선택적으로 증폭하여 상대적으로 많은 NK cell을 얻는 방법이 있다.

자연살해 세포의 분리를 거치지 않고 PBL로부터 자연살해 세포를 선택적으로 증폭시키는 방법으로 얻어진 세포는 순수 자연살해 세포군에 비하여 세포 살해능이 떨어지고, 순수한 자연살해 세포만이 아닌 T cell도 존재하기 때문에, 자가 MHC 분 자에 의하여 자기 (self)와비자기 (non-self)를 인식하는 T cell을 제거하지 않는 한 자가 이식에 한정될 수 밖에 없는 문제점이 있다.

본 발명은, 전자의 분리된 자연살해 세포(NK cell)을 증폭하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 증식 방법도 지지 세포(feeder cell)을 사용함을 특징으로 한다.

말초 혈액으로부터 자연살해 세포를 분리하는 방법은 당업자에게 공지되어 있는 통상의 방법을 사용할 수 있고, 시판되어 있는 것을 구입하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 Rosettesep NK cell enrichment cocktail (Stemcell technologies, 15065)을 구입하여 사용하였다.

한편, "Feeder cell(배양보조세포)"이란, 분열증식하지 못하게 하였으나 대사활성이 있기 때문에 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 세포의 증식을 돕는 세포로서, 최초에 이식한 세포를 '지지세포'라고 한다. 본 발명에서는 'feeder cell'을 지지세포라는 용어로 사용하기도 한다.

본 발명에서 사용하는 지지세포(feeder cell)로서는, 유전자가 도입된 동물 세포주(cell line)나 각종 사이토카인이나 화합물이 처리된 말초혈 백혈구 세포(PBL), 자기 또는 타인의 말초혈 백혈구 세포(PBL), T-cell, B-cell, 또는 ㄷ다단핵구(monocyte) 등을 들 수 있다. 가장 바람직하게는 자기 말초혈 백혈구 세포(PBL)를 사용할 수 있다.

상기 지지세포로 이용되는 자기 말초혈 백혈구 세포는 불활성화시켜 사용함 으로써 안전성을 확보한다. 불활성화시키는 방법으로는 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용하여도 무방하며, 예를 들어 감마선(gamma-ray)을 조사하는 방법을 사용할 수 있다. 이와 같은 불활성화시킨 지지세포(feeder cell)는 분리된 T-세포(purified T cell)를 포함한다.

본 발명과 같이 지지 세포를 사용하는 증식 방법은 자연살해 세포를 순수 분리한 후 증식시키는 방법으로, 이후에도 계속 순수 자연살해세포만 증식하게 할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 증식방법은, 자연살해 세포를 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 한다.

CD3 항체란, T 세포 수용체(TCR)과 회합하여 항원인식복합체를 형성하는 분자군인 CD3 항원에 특이적으로 반응하는 단백질로서, CD3 분자는 TCR과 비교하여 세포내 영역이 길고 항원인식신호를 세포 내에 전달하는 역할을 담당하고 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 항-CD3 항체의 예로서는, OKT-3, UCHT1, HIT3a 등을 들 수 있고, 바람직하게는 OKT-3 항체이다.

인터루킨(Interleukin, IL) 단백질이란 림프구나 단구 및 대식세포 등 면역담당세포가 생간하는 단백질성 생물활성물질의 총칭으로, 사이토카인(cytokine) 내의 일 군의 분자종을 가리킨다.

본 발명에서 사용할 수 있는 인터루킨 단백질의 예로서는, IL-2, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21 등을 들 수 있고, 바람직하게는 IL-2 단백질이다.

본 발명의 배양방법은 AIM-V media, RIMI1640, CellGro SCGM, X-VIVO20과 같은 통상의 동물세포배양용 배지에 인간 말초혈로부터 분리한 NK cell 및 PBL를 가하고, 이 배양물에 항 CD3항체 및 인터루킨 단백질을 첨가하여 배양한다. 본 발명의 일 구체예에서는 OKT-3 항체와 IL-2를 첨가하여 배양하였다. 첨가하는 OKT-3 항체의 농도는 0.1~100 ng/ml 바람직하게는 약 10 ng/ml을 사용하고, IL-2의 농도는 10~2000 U/ml 바람직하게는 약 500 U/ml을 사용한다.

또한, 여기에 혈청 또는 혈장과 림프구의 증식을 지지하는 추가의 증식인자를 첨가하여 배양할 수도 있다. 배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않아, 시판의 각종 동물 유래의 것을 사용할 수 있지만, 인간 유래로서 본인 유래의 것이 더욱 바람직하다. 예를 들어, PBMC로부터 림프구를 증식시키는 사이토카인의 조합이나, 림프구증식을 자극하는 렉틴류 등을 첨가하는 등 당업자에게 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 자연살해 세포를 현저히 증식시킬 수 있는 최적의 자연살해 세포의 배양 농도를 제공한다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 하나의 태양을 보다 구체적으로 기술하면, 우선 분리한 자연살해세포를 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 말초혈 백혈구 세포의 존재하에 배양하는 공정; 상기 배양물에서 항-CD3 항체를 제거하는 공정; 및 상기 항-CD3 항체가 제거된 배양액을 인터루킨 단백질이 함유된 배지에 첨가하여 추가 배양하는 공정을 포함한다.

이 때, 항-CD3 항체가 제거된 배양액을 인터루킨 단백질이 함유된 배지에 첨가하여 추가 배양함에 있어서, 배지에 접종(seeding)하는 자연살해세포의 농도가 증식률에 큰 영향을 끼친다.

바람직하게는, 자연살해세포가 1 x 10⁵내지 1 x 10⁶cells/well의 농도로 접종되는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 1 x 10⁵내지 3 x 10⁶cells/well의 농도가 좋다. 특히, 2 x 10⁵cells/well의 농도로 접종한 경우, 배양후 14일에 약 900배의 증식율을 보이는 것을 실험을 통해 확인하였다.

본 발명에서는 자연살해 세포를, 적정 농도로, 지지세포를 사용하면서 OKT-3 항체와 같은 항 CD3항체와 IL-2와 같은 인터루킨 단백질을 동시에 처리함으로써, 지지세포만 사용하거나 OKT-3 항체 자극만 사용한 기존 연구에 비하여 고순도의 자연살해세포를 단기간에 더욱 폭발적으로 증식시킬 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 방법으로 수득한 자연살해세포에 관한 것이다. 상기 방법에 따라 증식 배양된 자연살해세포의 표면형 특성을 이하에 설명한다.

정상인 말초혈액 분리한 초기 NK cell은 90% 이상이 CD3-/CD56+의 표면형을 가지고 있다. 이를 본 발명의 방법에 따라서 증식 배양시키면, 7일 경에는 CD3+ T cell이 상대적으로 줄어들고 CD3-/CD56+ NK cell이 더 많게 되며, 배양일로부터 10경에는 거의 모든 CD3+ T cell은 사라지고 95%이상의 세포 모두가 CD16을 발현하는 활성화된 NK 세포이다. 즉, CD16+의 표면형을 가지는 고순도의 자연살해세포를 단기간에 증식하여 수득할 수 있다.

따라서, 임상 적용이 가능한, 다량의 활성화된 NK cell을 이용하여 종양치료나 종양의 발생원이 되는 것으로 상정되고 있는 바이러스 감염세포의 제거에 유효한 세포치료제를 제조할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 지지세포( Feeder cell ) 준비 및 자연살해세포( NK cell )의 분리

(1) 지지세포(Feeder cell) 준비

정상인의 말초혈액 20 ml을 채혈하여, 채혈액 5 ml을 15 ml conical 튜브에 넣었다. 생리식염수 5 ml을 혈액에 추가로 더 넣고 파이펫으로 고르게 섞어주었다. 새로운 15ml conical 튜브에 피콜(ficoll) (GE healthcare, Uppsala, 17-1440-03)을 5 ml 넣고, 피콜이 들어있는 15 ml 튜브에 상기 섞어준(희석된) 혈액을 조심스럽게 얹은 다음, 2000 rpm으로 상온에서 30분간 원심 분리(한일, 한국, Union32-R)하였다.

피콜과 플라즈마(plasma) 사이에 생긴 면역세포층을 취하여 새로운 15 ml conical 튜브에 옮겨 담은 후, HBSS를 10 ml까지 채우고 세포를 고르게 섞고 1200 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상층액은 진공흡입(suction)하여 깨끗이 제거하였다. 다시 HBSS 10 ml를 첨가하고 원심분리하는 과정을 반복하였다.

세포배양액 (hAB serum (Sigma, H4522)이 5% 포함된 AIM-V media (Invitrogen, 12055091)을 1 ml 넣고 세포를 풀어준 후, 상기 세포 용액 중 10 ul를 마이크로튜브로 옮기고 트립판 블루(trypan blue) (Gibco) 90 ul를 넣어 파이펫으로 잘 섞고, 트립판블루 (Gibco, 15250-061) 염색약으로 염색하여 역상 현비경(inverted microscope)(Olympus, CK2-TRC-2)을 이용하여 세포수가 5 x 10^6 cell/ml이 되도록 세포배양액을 넣어 희석하였다.

FACS 분석을 위하여 1 ml의 세포를 5 ml 튜브에 옮겨 담고, 나머지 세포는 2000cGy의 감마(gamma) 선을 조사하여 불활성화 시켜(gamma-irradiatior, MDS Nordion, Gammacell 3000 Elan) 지지세포(feeder cell)를 준비하였다.

(2) NK cell 분리

앞서 정상인으로부터 채혈한 혈액 중 15 ml을 새로운 50ml conical 튜브에 옮겨 담고, Rosettesep NK cell enrichment cocktail (Stemcell technologies, 15065) 750 ul 을 첨가한 후, 상온에서 20분간 서서히 회전시키며 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 혈액에 15 ml 생리식염수를 추가하여 잘 섞어주었다.

새로운 15 ml conical 튜브 3개에 각각 피콜을 5 ml씩 넣고, 피콜이 들어있 는 15 ml conical 튜브에 상기 생리식염수를 섞어둔 혈액 10 ml씩을 조심스럽게 넣은 후, 2000 rpm으로 상온에서 30분간 원심분리하였다. 원심분리가 끝나면, 피콜과 자가혈장액 사이의 자연살해세포층을 모두 취하여 새로운 15 ml conical 튜브에 옮겨 넣고, HBSS로 10 ml까지 채우고, 1500 rpm으로 10분간 추가로 원심 분리하였다. 상층액을 깨끗이 제거하고, 다시 HBSS를 10 ml까지 채우고 세포를 잘 풀어준 후, 1200rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 진공으로 상층액을 제거하고 세포배양액을 1 ml 넣어 세포를 잘 풀어주었다.

세포희석액 중 10 ul를 마이크로튜브에 옮기고 40 ul의 트립판블루를 넣어 파이펫으로 잘 섞은 다음 트립판블루로 염색하여 세포수를 측정하면서, 세포수가 1 x 10⁶ cells/ml이 되도록 세포배양액으로 희석하였다.

(3) 분리된 초기 NK-cell의 특성

상기 분리된 NK cell에 anti-human CD3-FITC와 anti-human CD56-APC antibody를 염색(staining)하여 표면형을 분석하였다. 그 결과, 도 1에서 알 수 있는 바와 같이 초기 분리된 세포의 90% 이상이 CD3-/CD56+인 NK cell임을 확인하였다.

실시예 2: 분리한 자연살해 세포의 배양

초기 세포는 12-well plate (Falcon)에 배양하였다. 실시예 1-(1)에서 준비 된 지지세포 500 ul를 well에 넣고, 실시예 1-(2)에서 분리한 자연살해세포 500 ul를 지지세포가 들어있는 well에 추가로 넣었다.

세포가 들어있는 각 well에 500 U/ml 농도의 IL-2 (Norvatis) 사이토카인과 OKT-3 항체 (ebioscience, 16-0037) 10 ng/ml을 넣어주고, 플레이트를 조심스럽게 흔들어 세포와 사이토카인을 고르게 섞었다.

플레이트는 5% 이산화탄소가 포함된 섭씨 37도 습윤 배양기에 넣어 5일간 배양하였고, 이 때, 어떠한 배양액이나 사이토카인도 첨가하지 않았다.

배양일로부터 5일째 되는 날, 세포가 들어있는 모든 well을 파이펫팅하여 15 ml conical 튜브에 세포를 수거하였다. 세포가 제거된 각 well에 세포배양액을 각 1 ml씩 넣고 남은 세포를 깨끗이 수거하고, 수거한 세포는 1200 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상층액은 깨끗이 진공흡입하여 OKT-3 항체를 제거하였다.

남은 세포는 세포배양액 2 ml를 넣고 희석하였고, 희석된 세포 10 ul를 취하여 micro튜브에 넣고 trypan blue 용액 90 ul와 잘 섞어 trypanblue로 염색하여 세포수를 측정하였다. 2 x 10⁵ cells/well이 되도록 세포배양액을 넣어 희석하였다.

그리고, 500 U/ml이 되도록 IL-2를 첨가하고, 세포와 고루 섞은 후, 12-well 플레이트에 2 x 10⁵ cells/ml/well로 세포를 접종하였다. 상기 플레이트를 5% 이산화탄소가 포함된 섭씨 37도 습윤 배양기에 넣어 12일간 더 배양하였다.

이 때, OKT-3 항체를 제거한 다음날부터 최초 배양일로부터 10일까지 500 U/ml의 IL-2가 첨가되어있는 세포배양액을 1 ml씩 넣어주었다.

최초 배양일로부터 10일째 되는 날, 세포를 수거하여 수를 측정하고, 수거된 세포는 T75 flask에 1 x 10⁷ cell만큼씩 다시 심고 500 U/ml의 IL-2가 들어있는 세포배양액을 5 ml씩 넣어주었다. 세포 배양액은 다음 flask로 옮겨줄 때까지 매일 5 ml씩 넣어주었다.

더 이상 세포가 증식될 수 없을 정도가 되면 새로운 flak에 옮겨 심고 IL-2 (500U/ml)가 들어있는 세포배양액을 17일째 되는 날까지 매일 5 ml씩 넣어주었다.

실시예 3: 수득한 NK - cell 의 표면형 분석

OKT-3 제거 후, IL-2만 단독 처리하여 7일째와 10일째되는 날 일부 세포를 수거하여 표면형을 분석하였다.

배양 전, 중간, 혹은 배양이 끝난 세포를 수거하여 12000 rpm으로 5분간 원심분리하고, 배양 용액을 suction하여 제거하였다. 1 ml의 FACS buffer (2.5 % FBS + PBS)로 희석하여 세포수를 측정하고, 5 x 10⁶ cells/ml이 되도록 FACS buffer로 희석하였다. FACS 튜브(Falcon)에 희석한 세포 용액을 100 ul씩 넣고, 다음과 같이 antibody를 넣었다.

Tube 1 : 염색 않음(un-staining)

Tube 2 : anti-human CD3 -FITC (BD Pharmingen, 5555339) + anti-human CD56 -APC (BD Pharmingen, 555518) + anti-human CD16-PE (BD Pharmingen, 555407)

Tube 3 : anti-CD16-FITC (Color control) (BD Pharmingen, 555406)

Tube 4 : anti-CD56-PE (Color control) (BD Pharmingen, 555516)

Tube 5 : anti-CD56-APC (Color control)

상기 튜브들을 30분간 냉장 온도에 방치하여 염색한 후, 염색이 끝난 세포에2 ml FACS buffer를 넣고, 1500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 2 ml FACS buffer를 넣고 1500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 다시 상층액을 제거하고, 300 ul FACS buffer를 넣고 볼텍싱(vortexing) 하여 세포를 풀어주었다. FACSCalibur (Becton Dickinson)를 이용하여 표면형을 분석하였다.

그 결과, 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 7일째 OKT-3를 처리했을 경우가 처리하지 않고 배양한 것 보다 CD3+ T cell이 상대적으로 줄어들고 CD3-CD56+ NK cell이 더 많았다. CD3+ cell은 아직 죽지 않고 남아있는 irradiated PBMC로 추정되었다. 배양일로부터 10일째 되는 날, OKT-3와 feeder PBMC를 모두 사용하여 배양한 경우, 거의 모든CD3+ T cell은 사라지고 95%이상의 세포가 NK cell임을 확인하였다. 즉, 증식된 NK cell은 모두 CD16을 발현하는 활성화된 NK 세포였다.

실시예 4: 배양된 NK - cell 의 세포살해능 평가( Cr - release assay )

(1) Effector cell 준비

자연살해세포 배양 14일째 일부 세포를 수거하여, 1200 rpm으로 5분간 원심 분리하고 상층액을 제거한 후, 2 ml 세포 배양액을 넣어 희석하였다. 세포 수가 3 x 10⁶ cells/ml이 되도록 세포 배양액을 첨가하여 희석한 후, Effector : Target cell (E:T) ratio = 30:1로 조정하였다.

상기 준비된 세포 중 1ml을 취하여 새로운 튜브에 넣고, 세포배양액을 2 ml 더 첨가하여 잘 섞어주면서 Effector : Target cell (E:T) ratio = 10:1로 맞추었다. 또한, 세포 중 500 ul를 취하여 새로운 튜브에 넣고, 세포배양액을 4.5 ml 더 첨가하여 잘 섞어주면서, Effector : Target cell (E:T) ratio = 3:1로 조정하였다.

96-well plate에 각 target에 대하여 3 well/ratio가 되도록 상기 특정 비율로 조정된 자연살해세포를 100ul씩 넣어주었다.

(2) Target cell 준비

80% confluency가 되어있는 acute lymphoblastic leukemia cell line인 CEM과 chronic myelogenous leukemia (CML) cell line인 K562를 준비하여, 상기 두 cell line을 수거한 후, 15 ml conical 튜브에 담고, 1200 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 5 ml 세포배양액을 넣어 세포를 희석하혔다. 세포수를 측정하고, 1x10⁶ 세포만큼 새로운 15 ml 튜브에 옮겨 담았다. 옮겨진 세포에 세포배양액을 10 ml이 되도록 넣은 후, 1200 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고 FBS 25 ul를 넣어 세포를 희석한 후, Cr-51 (Perkin Elmer)을 100 ul씩 첨 가하였다.

튜브를 5% 이산화탄소가 포함된 섭씨 37도 습윤 배양기에 넣어 1시간 방치한 후, 세포를 꺼내어 세포배양액을 10 ml까지 채우고 1200 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 같은 방법으로 두 번 더 세척하였다. 세척이 끝난 세포는 세포 배양액을 10 ml 넣고 파이펫으로 고르게 희석하였다.

(3) 살해능 측정

희석된 cell line을, 앞서 준비한 effector cell이 들어있는 바닥이 둥근 (U-bottom) 96-well plate (FALCON)에 target 당 100 ul씩 추가로 넣어주었다. 각 target에 대한 spontaneous control로, effector cell이 없는 3개 well에 target cell 100ul를 넣어주고, 세포배양액을 100ul 넣어주었다. 각 target에 대한 maximum control로 effector cell이 없는 3개 well에 target cell 100ul를 넣어주고, 1% triton X-100이 포함된 PBS를 100 ul 넣어, 4시간 동안 배양하였다.

그 후, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 가라앉히고, 5 ml test 튜브에 상층액을 100ul씩 옮겨 담고, gamma-counter (COBRA)를 이용하여 gamma-ray를 측정하였다. 다음 공식을 이용하여 세포독성(cytotoxicity)을 계산하였다.

그 결과, 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 두 cell line간의 세포독성은 달랐지만, 두 종류 target cell에서 모두에서 최대 70% 이상의 높은 세포독성을 나타내었다.

실시예 5: 배양된 NK - cell 의 세포 증식능 평가( CFSE - proliferation assay )

실시예 1에서와 같이, 정상인의 말초 혈액 15ml으로부터 Rossetsep을 이용하여 NK cell을 분리하고, 자가 말초혈액세포를 방사선 조사하여 증식을 억제한 다음 feeder cell로 사용하였다. PBL 자극에 anti-CD3 antibody (OKT-3)를 저농도로 5일 동안 자극하고 이후 IL-2가 첨가된 media로 17일 동안 배양하여 최대 600배의 NK cell 증식을 확인하였다.

그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, OKT-3 항체의 자극이 없을 경우 10일 배양 후 20배의 증식에 그치는 반면 OKT-3의 자극으로 10일 배양 후 112배, 17일 배양 후 최대 600배의 증식을 확인하였다.

비교예 1: 배양된 NK - cell 의 세포 증식능 비교

NK-cell 증식능 평가 비교를 위하여 다음과 같이 조건으로 각각 배양하였다.

a. NK cell + IL-2 (500 U/ml)

b. NK cell + IL-2 (500U/ml)+ OKT-3 (10 ng/ml)

c. NK cell + IL-2 (500 U/ml) + irradiated PBMC

d. NK cell + IL-2 (500 U/ml) + irradiated PBMC + OKT-3 (10 ng/ml)

모든 NK cell은 실시예 1에서처럼, Rosettesep을 이용하여 분리하였고, irradiated PBMC는 NK cell의 5배수로 seeding 하였다. 배양일로부터 5일째 되는 날 각 세포는 수거하여 세포수를 측정하였다.

상기 각 조건별로 1 x 10⁶cell을 준비하여 5 ml 튜브에 옮겨 담고, 세포 배양액이 최종 500 ul가 되도록 채우고, 5uM의 CFSE solution을 넣은 후, 세포배양기에서 30분간 방치하였다. PBS를 이용하여 3번 washing 한 후, FACS Calibure를 이용하여 530 nm 파장을 분석하였다.

그 결과, 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, NK cell만 단독으로 배양하는 것 보다 feeder와 함께 배양하는 것이 세포 증식을 촉진하고, feeder와 함께 OKT-3를 처리하였을 경우 훨씬 세포 증식에 효과적이라는 것을 확인하였다. 그리고, 가장 현저한 효과를 발휘하는 것은 d조건인 IL-2와 OKT-3를 동시에 처리한 경우로서, 14일 배양으로 약 200배 전후, 17일 배양으로 약 600배 이상의 증식 능력을 보여주었다.

실시예 7: 배양된 NK - cell 의 농도별 세포 증식능 평가

실시예 2와 같이 초기 배양과 OKT-3제거는 동일하게 진행한 후, NK-cell 수 가 측정되면 다음과 같이 상이한 농도별로 세포를 희석한 후, 12-well plate에 seeding하고, 세포 배양기에서 9일간 더 배양하고, 세포수를 측정하였다

a. 1 x 10⁵ cells/ml/well

b. 2 x 10⁵ cells/ml/well

c. 5 x 10⁵ cells/ml/well

d. 1 x 10⁶ cells/ml/well

각 조건에 따른 세포 증식을 비교해 본 결과, 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 2 x 10⁵ cell/ml로 seeding한 경우 14일에 약 900배로 최대 증식을 보였으며, 1 x 10⁶ cells/ml로 seeding한 경우 14일에 약 100배로 가장 증식정도가 낮았다. 따라서 OKT-3를 제거한 후, seeding 농도가 자연살해세포 증식에 매우 큰 요소로 작용함을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 정상인의 말초혈액으로부터 분리한 초기 NK cell의 표면형을 분석결과이다.

도 2는 본 발명의 방법에 따라 배양하여 수득한 NK-cell의 표면형을 분석한 결과이다.

도 3은 본 발명의 방법에 따라 배양하여 수득한 NK-cell의 종양 살해능을 확인한 결과이다.

도 4는 본 발명의 방법에 따라 배양하여 수득한 NK-cell의 증식능을 확인한 결과이다.

도 5는 지지세포 PBMC, 항 CD3항체 OKT-3 및 IL-2의 유무에 따른 각각의 배양조건에서 배양하여 수득한 NK-cell의 증식능을 비교한 결과이다.

도 6는 자연살해 세포의 씨딩(seeding) 농도를 달리하여 배양하여 수득한 NK-cell의 증식능을 비교한 결과이다.

Claims

지지세포로써 분열증식을 억제시킨 말초혈 백혈구 세포의 존재하에, 성장인자로써 인터루킨 단백질과 상기 지지세포를 자극하기 위한 항-CD3 항체를 함유하는 배지에서, 자연살해세포를 배양하는 공정을 포함하는, 자연살해세포의 증식 방법.
제1항에 있어서, 항-CD3 항체는 OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 증식방법.
제2항에 있어서, 항-CD3 항체는 OKT-3항체인 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 증식방법.
제1항에 있어서, 상기 인터루킨 단백질은 IL-2, IL-15, IL-12, IL-18 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 증식방법.
제4항에 있어서, 상기 인터루킨 단백질은 인터루킨-2(IL-2)인 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 증식방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 분열증식을 억제시킨 말초혈 백혈구 세포가 분리된 T 세포(purified T cell)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 증식 방법.
제1항에 있어서, 상기 말초혈 백혈구 세포는 자기 말초혈 백혈구 세포인 것을 특징으로 하는 자연살해세포의 증식방법.
삭제
삭제
삭제
삭제