CN102112600A - 自然杀伤细胞的增殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提高自然杀伤细胞(Natural Killer cell，NK细胞)增殖的方法，具体地涉及包括在外周血淋巴细胞存在的条件下，在含有抗-CD3抗体及白介素蛋白的培养基中培养自然杀伤细胞的步骤的有关自然杀伤细胞的增殖方法。本发明提供了一种能够显著增殖自然杀伤细胞的方法，该方法可通过与现有的自然杀伤细胞增殖方法相比显著提高了增殖率来获得大量的自然杀伤细胞。

Description

自然杀伤细胞的增殖方法
技术领域
本发明涉及获得高收率的自然杀伤细胞(Natural Killer cell，NK细胞)的增殖方法。进一步涉及包括在外周血淋巴细胞存在的条件下，在含有抗-CD3抗体及白介素蛋白的培养基中培养自然杀伤细胞的步骤的自然杀伤细胞的增殖方法。
背景技术
自然杀伤细胞(以下有简称为“NK细胞”的情况)是担当免疫反应角色的淋巴细胞谱系细胞。该细胞具有多种功能，特别地具有很强的杀死肿瘤细胞的活性，因此被认为是体内清除已经肿瘤化的或正在肿瘤化的异常细胞的免疫监视系统中的重要成员。因此，将该细胞有效地用于肿瘤治疗或用于去除被认为是肿瘤的发生来源的病毒感染细胞的研究很早就开始了。
存在于健康人体内的大部分NK细胞为非活性状态。很多研究人员进行了从健康人的血液中或非活性的患者血液中将NK细胞活化的研究。
在体外被活化的NK细胞的高细胞毒性使其具有了作为免疫细胞治疗制剂的可能性，并通过体外或通过动物实验来确定了其对各种癌症的治疗可能性。一般，通过利用肿瘤细胞系来确认试管内的细胞毒性，对血癌、肝癌、肺癌、肾癌、小儿神经癌及皮肤癌等多种癌症显示出了一定的细胞毒性。特别地，对血癌和小儿神经癌显示出了肯定性的临床及非临床治疗效果。
虽然具有这种在临床上的应用可能性，但在体内的NK细胞的数量并不多，而为了达到治疗效果，所需的有效NK细胞的数量很多，因此即使是通过白细胞分离法(Leukapheresis)来收集大量的白细胞，一次采血也只能用于一两次的治疗。
在细胞疗法(Celltherapy)中充足的细胞数量(Celldose)和反复给药是非常重要的因素，但NK细胞的增殖很弱，无法提供充足数量的细胞进行给药，这成为将其应用于临床的最大的问题，为克服上述情况，有很多关于对NK细胞增殖的研究，但还没有达到适用于临床的水平。一般通过IL-2或除此之外的细胞因子及化合物来对NK细胞进行增殖的研究，只能够增加到初期分离的NK细胞数量的3～10倍左右。
1990年代后，对自然杀伤细胞的增殖在各个方面进行了研究。这些方面包括了用于现有T细胞增殖/活性的IL-2的研究；还包括有IL-15(Dunne J等，Immunology，vol.167：3129.2001；SA Perez，等，Blood，vol.106：158，2005)、LPS(MR Goodier等，Immunology 165：139，2000)、利用作为刺激CD3的OKT-3抗体(Condiotti R，等，Experimental Hematology 29：104，2001)，以单独或结合的使用形式来增殖自然杀伤细胞的研究。但上述这些仅是通过对一直使用的IL-2的变体及演化的形态找到了新的增殖物质，但并没能够提供具有突破意义的增殖方法。
并且，还有关于有些研究人员将肿瘤细胞株用作饲养细胞(feeder cell)来增殖NK细胞的报道，但大部分将肿瘤细胞株用作饲养细胞等，这些方法对于临床应用中非常重要的安全性没有保障。
因此，本发明人确认了具有下述优点，完成了本发明，即通过将失活的自体外周血细胞作为饲养细胞来确保了安全性，通过同时处理OKT-3抗体和IL-2来维持自然杀伤细胞的杀伤能力，并且能够显著地提高增殖率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以高效率对自然杀伤细胞增殖的方法。
为达到上述目的，本发明提供包括在外周血淋巴细胞存在的条件下、在含有抗-CD3抗体及白介素蛋白的培养基中培养自然杀伤细胞的步骤的，以在短时间内能够爆发性地增殖高纯度的自然杀伤细胞的方法。
在自然杀伤细胞的培养中本发明优选例为，将自体外周血淋巴细胞(PBL，peripheral blood lymphocyte)作为饲养细胞，对OKT-3抗体和IL-2同时进行处理。
进一步地，上述方法包括在培养物中除去抗-CD3抗体的步骤，及在含有白介素蛋白的培养基内加入除去上述抗-CD3的培养液的步骤。此时，用于追加培养而加入的除去了抗-CD3抗体的培养液，优选为含有1×105至3×106细胞/孔浓度的自然杀伤细胞。
附图说明
图1为从健康人体内的外周血中分离的初期NK细胞的表面形态的分析结果。
图2为通过本发明方法进行培养获得的NK-细胞的表面形态的分析结果。
图3为确认了通过本发明方法进行培养获得的NK-细胞的肿瘤杀伤能力的结果。
图4为确认了通过本发明方法进行培养获得的NK-细胞的增殖能力的结果。
图5为对在有或无饲养细胞外周血单核细胞、作为抗CD3抗体的OKT-3及IL-2的各种培养条件下进行培养获得的NK-细胞的增殖能力的比较结果。
图6为改变自然杀伤细胞接种浓度来进行培养获得的NK-细胞的增殖能力的比较结果。
具体实施方式
下面将对本发明详细说明。
本发明第一个观点为有关包括在外周血淋巴细胞存在的条件下，在含有抗-CD3抗体及白介素蛋白的培养基中培养NK细胞的步骤的自然杀伤细胞的增殖方法。
本发明的上述自然杀伤细胞的增殖方法没有特别地限定，例如可通过包括下列步骤进行。
(i)从人体外周血中分离外周血淋巴细胞及自然杀伤细胞的步骤；
(ii)将没有分离自然杀伤细胞的自体外周血淋巴细胞进行失活的步骤(制备经过了失活的饲养细胞的步骤)；
(iii)在外周血淋巴细胞存在的条件下，在含有抗-CD3抗体及白介素蛋白的培养基中培养自然杀伤细胞的步骤；
(iv)从上述培养物中除去抗-CD3抗体的步骤；及
(v)将上述除去了抗-CD3抗体的培养液加入到含有白介素蛋白的培养基中进行追加培养的步骤。
在正常的血液中含有约10～15％的NK细胞，与非自体(non-self)反应时具有很强的杀伤能力。NK细胞对于被各种病毒感染的细胞或细菌的侵入及非正常细胞的生成，以非特异性地即刻反应去除异物。但是存在于体内的NK细胞数量并不多，为了得到治疗效果，需要很多的有效的NK细胞，因此实际情况为对于有效的NK细胞增殖方法有必要进行研究。
对于自然杀伤细胞的增殖方法大致可分为两种。仅将NK细胞纯粹地分离后，使用饲养细胞通过适当的刺激来达到增殖的方法，另一种是在整体外周血淋巴细胞或外周血单核细胞(PBMC；peripheral blood mononuclear cell)中选择性地对NK细胞增殖，以获得相对较多的NK细胞。
通过不经过自然杀伤细胞的分离，从外周血淋巴细胞中选择性地对自然杀伤细胞增殖的方法而得到的细胞与纯粹的自然杀伤细胞系相比，细胞杀伤能力下降，不仅存在纯粹的自然杀伤细胞，由于还存在T细胞，因此如果不通过自体主要组织相容性复合物(MHC)分子去除识别自体(self)和非自体(non-self)的T细胞，则会有只能限于自体移植的问题。
本发明是有关对前者的已分离的自然杀伤细胞(NK细胞)进行增殖的方法，本发明中的增殖方法也是以使用饲养细胞为特征的。
从外周血中分离自然杀伤细胞的方法可以采用本领域人员公知的常用方法，也可以在市场上购买使用。本发明的一个具体例中使用了购买的Rosettesep NK细胞富集混合物(Stem cell technologies，15065)。
另一方面，培养饲养细胞虽然没有让其进行分裂增殖，但具有代谢活性，通过生产各种代谢物质来帮助目标细胞增殖的细胞，将最初移植的细胞称为“饲养细胞”。本发明中还将‘feeder cell’称为饲养细胞。
本发明中所使用的饲养细胞，例如有导入了基因的动物细胞系或各种对细胞因子及化合物进行了处理的外周血淋巴细胞(PBL)、自体或非自体的外周血淋巴细胞(PBL)、T-细胞、B-细胞或单核细胞等。最优选为使用自体外周血淋巴细胞(PBL)。
将上述用作饲养细胞的自体外周血淋巴细胞经失活处理后使用，以确保安全性。作为失活方法可采用业界公知的常用方法，例如可以使用照射伽马线的方法。这种失活的饲养细胞包括纯化的T-细胞。
像本发明这样使用饲养细胞的增殖方法是将自然杀伤细胞纯粹分离后再进行增值的方法，具有之后也可以继续只增殖纯粹的自然杀伤细胞的优点。
并且，本发明的增殖方法的特征为在含有抗-CD3抗体及白介素蛋白的培养基中培养自然杀伤细胞。
CD3抗体是指对与T细胞抗原受体(TCR)进行结合后形成抗原识别复合体的分子系的CD3抗原进行特异性反应的蛋白，CD3分子与T细胞抗原受体相比，细胞内区域长，起到将抗原识别信号传递到细胞内的作用。
本发明可以使用的抗-CD3抗体有，如OKT-3、UCHT1、HIT3a等，优选为OKT-3抗体。
白介素(Interleukin，IL)蛋白是淋巴细胞或单核及巨噬细胞等免疫细胞生成的蛋白特性的生物活性物质的总称，指细胞因子内的一群分子种系。
本发明能够使用的白介素蛋白例如有，IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21等，优选为IL-2蛋白。
本发明的培养方法为在一般用于培养动物细胞的如AIM-V培养基、RIMI1640、CellGro SCGM、X-VIVO20等培养基上，加入从人体外周血分离的NK细胞及外周血淋巴细胞，在该培养物中加入抗CD3抗体及白介素蛋白进行培养。本发明的一个具体例中加入了OKT-3抗体和IL-2进行了培养。加入的OKT-3抗体的浓度为0.1～100ng/ml，优选为约使用10ng/ml，IL-2的浓度为10～2000U/ml，优选为约使用500U/ml。
并且，这里也可以加入血清或血浆和追加地加入对淋巴细胞的增殖起到支持的增殖因子进行培养。加入到培养基内的血清或血浆的种类没有特别的限制，因此可以使用市售的来自各种动物的血清或血浆，但作为来自人体的血清或血浆，优选其本人的血清或血浆。也可以使用本领域技术人员公知的方法，例如有加入由外周血单核细胞来增殖淋巴细胞的细胞激素的组合或加入对淋巴细胞增殖起到刺激的植物血凝素等。
另一观点认为，本发明提供了能够使自然杀伤细胞显著增殖的最优选的自然杀伤细胞的培养浓度。
如前面所述，对本发明的培养更加具体的叙述为，本发明包括首先在外周血淋巴细胞存在的条件下、在含有抗-CD3抗体及白介素蛋白的培养基中培养分离的自然杀伤细胞的步骤；在上述培养物中除去抗-CD3抗体的步骤；及在含有白介素蛋白的培养基内加入上述除去了抗-CD3抗体的培养液的追加培养步骤。
此时，就去除了抗-CD3抗体的培养液加入到含有白介素蛋白的培养基中进行的追加培养来说，接种于培养基的自然杀伤细胞的浓度对增殖率有很大的影响。
优选为以1×105至1×106细胞/孔的浓度进行接种，更优选为以1×105至3×106细胞/孔的浓度进行接种。特别地，通过实验确认了以2×105细胞/孔的浓度接种时，培养后第14天时显示出了约900倍的增殖率。
本发明中通过以适当的自然杀伤细胞浓度，使用饲养细胞，并同时处理如OKT-3抗体的抗-CD3抗体和如IL-2的白介素蛋白，与仅使用饲养细胞或仅通过OKT-3抗体刺激的现有研究相比，能够在短时间内更显著地增殖高纯度的自然杀伤细胞。
另一方面，本发明是有关通过上述方法得到的自然杀伤细胞。下面对根据上述方法增殖培养的自然杀伤细胞的表面形态特征进行说明。
健康人的外周血分离的初期NK细胞的90％以上具有CD3-/CD56+的表面形态。将其通过本发明方法进行增殖培养时，在第7天时CD3+T细胞会相对地减少，而CD3-/CD56+NK细胞会增多，在培养的第10天时基本上所有的CD3+T细胞几乎全部消失，95％以上的细胞全为表现CD16的活化的NK细胞。即、能够在短时间内获得具有CD16+的表面形态的高纯度的自然杀伤细胞。
并且通过利用大量可临床应用的活化的NK细胞，能够制造出有效去除被认为是肿瘤发生来源的病毒感染细胞的细胞治疗剂。
实施例
下面通过实施例来进一步详细说明本发明。这些实施例仅是为了举例说明本发明，这些实施例并不能够限制本发明的范围，这是具有本领域公知常识的技术人员所公知的。
实施例1：饲养细胞的制备及自然杀伤细胞(NK细胞)的分离
(1)制备饲养细胞
取健康人的外周血20ml，将采集的5ml血放入15ml体积容量的锥形管中。在血液中追加加入5ml生理盐水，用吸液管搅拌均匀。在新的15ml体积容量的锥形管中加入5ml淋巴细胞分离液(ficoll)(GE healthcare，Uppsala，17-1440-03)，在装有淋巴细胞分离液的15ml锥形管上小心地加上上述经过搅拌的(稀释的)血液后，以2000rpm的转速在常温下进行30分钟离心分离(韩一集团，韩国，Union32-R)。
取出淋巴细胞分离液和血浆之间生成的免疫细胞层并移至新的15ml体积容量的锥形管中后，添加HBSS至10ml，将细胞混合均匀后以1200rpm的转速进行10分钟的离心分离。上层液经真空抽吸被去除干净。然后再加入10ml的HBSS反复进行离心分离操作过程。
加入1ml的含有5％细胞培养液hAB血清(Sigma，H4522)的AIM-V培养基(Invitrogen，12055091)使细胞散开，将10ul上述细胞溶液移到微管，加入90ul台盼蓝(Gibco)后用吸液管混合均匀，用台盼蓝(Gibco，15250-061)染色剂进行染色后，利用倒置显微镜(Olympus，CK2-TRC-2)观察并加入细胞培养液稀释至细胞数达到5×106细胞/ml。
为了进行FACS分析，将1ml的细胞移入5ml的试管中，剩余的细胞用2000cGy的伽马射线(γ-发射仪，MDS Nordion，Gammacell3000Elan)照射，进行失活处理来制备饲养细胞。
(2)NK细胞的分离
在之前从健康人体内采集的15ml血液移至新的50ml的锥形管中，加入750ul的Rosettesep NK细胞富集混合物(Stemcell technologies，15065)后，在常温下缓慢地旋转20分钟进行反应。在结束了上述反应的血液中追加15ml生理盐水，并混合均匀。
分别在3个新的15ml锥形管中各加入淋巴细胞分离液5ml，往加入了淋巴细胞分离液的15ml锥形管中分别小心地加入混有上述生理盐水的10ml血液后，在常温下以2000rpm的转速进行30分钟离心分离。离心分离结束后，取出淋巴细胞分离液和自体血浆液之间的所有的自然杀伤细胞并移入新的15ml锥形管中，加入HBSS至10ml，以1500rpm的转速追加进行10分钟离心分离。彻底去除上层溶液，再加入HBSS至10ml，以使细胞完全散开，以1200rpm的转速进行10分钟离心分离。用真空去除上层溶液，加入1ml细胞培养液使细胞充分散开。
从细胞稀释液中取10ul移入微管中，加入40ul的台盼蓝后，用吸液管混合均匀后，用台盼蓝进行染色并测定细胞数量，同时用细胞培养液进行稀释至细胞数达到1×106细胞/ml。
(3)分离的初期NK-细胞的特性
对上述分离的NK细胞中的抗-人CD3-FITC和抗-人CD56-APC抗体进行染色并分析了表面形态。结果为，如从图1可知，初期分离的90％以上的细胞为CD3-/CD56+的NK细胞。
实施例2：对已分离的自然杀伤细胞的培养
在12-孔板(Falcon)上培养初期细胞。将实施例1-(1)中准备的500ul饲养细胞放入孔中，将通过实施例1-(2)中分离的500ul自然杀伤细胞追加地加入到装有饲养细胞的孔中。
在装有细胞的各个孔中加入500U/ml浓度的IL-2(Norvatis)的细胞因子和10ng/ml的OKT-3抗体(ebioscience，16-0037)后，小心地摇晃孔板，以使细胞和细胞因子混合均匀。
将孔板放入含有5％二氧化碳的37℃的湿润培养箱内进行5天培养，这时，没有添加任何的培养液或细胞因子。
从培养日开始算起，到第5天时，吸取装有细胞的孔中的所有细胞至15ml的锥形管内。在去除了细胞的各个孔中分别加入1ml的细胞培养液，将剩余的细胞收取干净，将收得的细胞以1200rpm的转速进行10分钟离心分离。将上层液真空抽吸干净，去除了OKT-3抗体。
往剩余的细胞中加入2ml的细胞培养液进行稀释，取稀释了的10ul细胞放入微管中，与90ul台盼蓝溶液混合均匀后用台盼蓝进行染色测定细胞数量。加入细胞培养液稀释至2×105细胞/孔。
然后加入IL-2至500U/ml，与细胞均匀混合后，在12-孔板上以2×105细胞/ml/孔接种细胞。将上述孔板放入含有5％二氧化碳的37℃的湿润培养箱内再进行12天培养。
这时，从去除了OKT-3抗体之后的下一天开始，即从最初培养日至10天期间分别加入1ml含有500U/ml的IL-2的细胞培养液。
从最初培养日开始至第10天的时候，收取细胞并测定细胞数量，将收得的细胞在T75烧瓶(flask)内重新移植1×107细胞数后加入5ml含有500U/ml IL-2的细胞培养液。关于细胞培养液，直至移入下一个烧瓶为止，每天加入5ml细胞培养液。
直至不能够再增殖细胞时，移植到新的烧瓶内，每天加入5ml的含有IL-2(500U/ml)的细胞培养液，直至第17天为止。
实施例3：对获得的NK-细胞的表面形态的分析
去除OKT-3后，仅单独处理IL-2，在第7天和第10天时，收取一部分细胞进行了表面形态的分析。
收取培养之前阶段、中间阶段、或培养结束后的细胞，以12000rpm的转速进行5分钟离心分离，通过真空抽吸去除培养溶液。用1ml的FACS缓冲液(2.5％FBS+PBS)稀释后，测定了细胞数量，用FACS缓冲液稀释至5×106细胞/ml。在FACS试管(Falcon)中加入100ul的稀释的细胞溶液，按照下述内容加入了抗体。
试管1：没有染色
试管2：抗-人CD3-FITC(BD Pharmingen，5555339)+抗-人CD56-APC(BD Pharmingen，555518)+抗-人CD16-PE(BD Pharmingen，555407)
试管3：抗-CD16-FITC(颜色对照)(BD Pharmingen，555406)
试管4：抗-CD56-PE(颜色对照)(BD Pharmingen，555516)
试管5：抗-CD56-APC(颜色对照)
将上述各试管放置于冷藏温度下进行30分钟染色处理，染色后在细胞中加入2ml的FACS缓冲液，以1500rpm的转速进行5分钟离心分离。去除上层液后再加入2ml的FACS缓冲液，以1500rpm的转速进行5分钟离心分离。再次去除上层液，加入300ul的FACS缓冲液，利用涡流使细胞散开，并利用FACSCalibur(Becton Dickinson)对表面形态进行了分析。
如图2所示，结果为，第7天时对OKT-3进行处理的情况与没有进行处理就培养的情况相比，CD3+T细胞相对减少，CD3-CD56+NK细胞更多。CD3+细胞还没有死掉，而是被推定为是剩下的被辐射的外周血单核细胞。从培养日起第10天的时候，同时使用OKT-3和饲养外周血单核细胞进行培养时，几乎所有的CD3+T细胞都消失了，并且确认95％以上的细胞为NK细胞。即增殖的NK细胞都是表达CD16的活化了的NK细胞。
实施例4：对培养的NK-细胞的细胞杀伤能力的评价(Cr-释放法)
(1)制备效应细胞
在培养自然杀伤细胞第14天时，收得一部分细胞，以1200rpm的转速进行5分钟离心分离后去除上层液，加入2ml细胞培养液进行稀释。加入细胞培养液使细胞数量达到3×106细胞/ml后，调节为效应细胞∶靶细胞(E∶T)比＝30∶1。
从上述制备的细胞中取1ml放入新的试管中，再加入2ml的细胞培养液混合均匀，调节为效应细胞∶靶细胞(E∶T)比＝10∶1。并且，在细胞中取500ul放入新的试管中，再加入4.5ml的细胞培养液进行充分混合，调节为效应细胞∶靶细胞(E∶T)比＝3∶1。
在96孔板上，分别加入按上述特定比率调节好的自然杀伤细胞100ul，使针对各个靶的比率达到3孔/比率。
(2)制备靶细胞
制备好80％培养融汇率的急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia)细胞系CEM和慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)细胞系K562，获得上述两个细胞系后，装入15ml的锥形管中，以1200rpm的转速进行5分钟离心分离。去除上层液，加入5ml细胞培养液稀释细胞。测定细胞数量并将1×106的细胞移入新的15ml试管中。在被移入的细胞中加入细胞培养液至10ml，以1200rpm的转速进行5分钟离心分离。去除上层液，加入25ul的胎牛血清(FBS)稀释细胞后，各加入100ul的Cr-51(Perkin Elmer)。
将试管在含有5％二氧化碳的37℃的湿润培养箱内放置一个小时后，将细胞取出，加入细胞培养液至10ml，以1200rpm的转速进行5分钟离心分离。去除上层液，用同样的方法再洗涤两次。在洗涤后的细胞中再放入10ml的细胞培养液，用吸液管进行稀释。
(3)杀害能力测试
将稀释了的细胞以每种靶细胞各为100ul的量追加加入到之前准备好的装有效应细胞的板底呈圆形的(U型-底部)96孔板(FALCON)中，以各靶的自发性控制(spontaneous control)，在没有效应细胞的3个孔中加入100ul靶细胞，加入100ul细胞培养液。以各靶的最佳控制(maximum control)，在没有效应细胞的3个孔中加入100ul的靶细胞，加入100ul含有1％氚核X-100(triton X-100)的磷酸盐缓冲液(PBS)，培养4小时。
然后，以2000rpm的转速进行3分钟离心分离并使细胞沉淀，往5ml的测试管中移入100ul的上层液，利用伽马计数器(γ-计数器；COBRA)测定伽马射线。然后利用下列公式计算细胞毒性。
Figure BPA00001308477200131
如图3所示，结果为虽然两个细胞株之间的细胞毒性不同，但在两种靶细胞中均显示出了70％以上的高细胞毒性。
实施例5：对培养的NK-细胞的增殖能力的评价(CFSE-增殖法)
如实施例1所述，利用Rossetsep从健康人体内的15ml外周血中分离NK细胞，将自体外周血液细胞用放射线进行照射，抑制增殖后，用作饲养细胞。通过外周血淋巴细胞的刺激，将抗-CD3抗体(OKT-3)以低浓度刺激5天，然后用添加有IL-2的培养基培养17天，确认了最大达到600倍的NK细胞增殖。
如从图4能够看出，结果显示当没有OKT-3抗体的刺激时，培养10天后只达到20倍的增殖后即停止，相反，通过OKT-3的刺激培养10天后却达到了112倍，培养17天后最大达到了600倍的增殖。
比较例1：对培养的NK-细胞的细胞增殖能力的比较
为了对NK-细胞增殖能力进行评价比较，按照下述条件各自进行了培养。
a、NK细胞+IL-2(500U/ml)
b、NK细胞+IL-2(500U/ml)+OKT-3(10ng/ml)
c、NK细胞+IL-2(500U/ml)+经辐射的PBMC
d、NK细胞+IL-2(500U/ml)+经辐射的PBMC+OKT-3(10ng/ml)
所有的NK细胞如实施例1，同样是利用Rosettesep进行分离，被辐射的外周血单核细胞接种量为NK细胞的5倍数量。从培养日起至5天时，收取各细胞测定了细胞数量。
分别按照上述条件准备了1×106的细胞移入5ml的试管中，使细胞培养液加至最终为500ul，加入5uM的CFSE溶液后，在细胞培养箱中放置30分钟。利用磷酸盐缓冲液洗涤3次后，用FACS Calibure分析了在530nm下的波长。
结果为，如图5所示，与单独培养NK细胞相比，和饲养细胞一起培养会促进细胞增殖，与饲养细胞一起对OKT-3进行处理时，对细胞增殖更为有效。并且发挥了最为显著效果的是d条件中将IL-2和OKT-3同时进行处理的时候，当培养至14天时增殖达到了200倍左右，当培养至17天时显示出了约600倍以上的增殖能力。
实施例7：培养的NK-细胞各浓度下的细胞增殖能力评价
如实施例2所示，同时进行初期培养和OKT-3去除，测定NK-细胞数量并按照下述不同浓度稀释细胞后，接种于12-孔板上，在细胞培养箱中再培养9天后测定了细胞数量。
a、1×105细胞/ml/孔
b、2×105细胞/ml/孔
c、5×105细胞/ml/孔
d、1×105细胞/ml/孔
根据上述不同条件，对细胞增殖进行比较的结果，如图6所示，以2×105细胞/ml进行接种时，14天显示出了约900倍的最大增殖，以1×106细胞/ml进行接种时，14天显示出了约为100倍的最低的增殖程度。并且可确认当去除了OKT-3后，接种浓度对自然杀伤细胞增殖起到了很大的作用。
以上详细地说明了本发明的内容，对于本领域具有基本知识的技术人员来说，应当知道这些具体技术只是优选的实施形态，但并不因此而限制本发明的范围。并且本发明的实质范围由附加的权利要求及其等同要求定义。
工业实用性
本发明的自然杀伤细胞的增殖方法与现有的方法相比较，在维持自然杀伤细胞的杀伤能力的同时，是可以达到最大增殖的具有突破意义的方法，因此可通过采少量血来获得大量的自然杀伤细胞，因此对于细胞治疗剂的商业化来说是有用的。
通过上述内容，对本发明内容的特定部分详细地进行了叙述，对于具有本领域公知常识的人应该知道这些具体的技术只是优选的实施形态，而并不能限定本发明的范围。并且本发明的实质范围由附加的权利要求及其等同要求定义。

Claims (12)

1.一种自然杀伤细胞的增殖方法，该方法包括在外周血淋巴细胞存在的条件下，在含有抗-CD3抗体及白介素蛋白的培养基中培养自然杀伤细胞的步骤。
2.如权利要求1所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，抗-CD3抗体选自OKT-3、UCHT1及HIT3a。
3.如权利要求2所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，抗-CD3抗体为OKT-3抗体。
4.如权利要求1所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，所述白介素蛋白选自IL-2、IL-15、IL-12、IL-18及IL-21。
5.如权利要求4所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，所述白介素蛋白为白介素-2(IL-2)。
6.如权利要求1所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，所述外周血淋巴细胞为经过失活的外周血淋巴细胞。
7.如权利要求6所述的自然杀伤细胞的增殖方法，所述经过失活的外周血淋巴细胞为经纯化的T细胞。
8.如权利要求1所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，所述外周血淋巴细胞为自体外周血淋巴细胞。
9.如权利要求1所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，包括在外周血淋巴细胞存在的条件下、在含有抗-CD3抗体及白介素蛋白的培养基中培养自然杀伤细胞的步骤；在所述培养物中除去抗-CD3抗体的步骤；及在含有白介素蛋白的培养基内加入所述除去了抗-CD3的培养液来进行追加培养的步骤。
10.如权利要求9所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，所述抗-CD3抗体为OKT-3抗体，所述白介素蛋白为白介素-2(IL-2)。
11.如权利要求9所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，以1×105至1×106细胞/孔的浓度加入所述去除了抗-CD3抗体的培养液。
12.如权利要求11所述的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，以1×105至3×106细胞/孔的浓度加入所述去除了抗-CD3抗体的培养液。
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