CN107541491A - 一种nk细胞体外培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NK细胞体外培养方法，包括NK细胞提取和NK细胞培养的方法，所述NK细胞提取和NK细胞培养的方法包括下述步骤：1)抽取病人的外周血分装在红盖管和绿盖管内，所述红盖管与率盖管各盛有60ml外周血；2)向绿盖管的血液中加入悬浮液，轻轻摇动混合均匀，向离心管里加入细胞分离液，将离心管放入离心机进行离心操作，离心结束后将白膜层取出，放于一个新的离心管中；3)向取出的白膜层中加入细胞洗液，用吸管吹打数次，吹打匀后，放入离心机离心内，离心结束，弃上清。通过取用病人本体外周血液中的细胞，有效防止细胞排异性的发生，提高治疗过程的安全性，通过在体外大量培养NK细胞，便于对病人进行治疗。
Description
技术领域
本发明涉及人类细胞培养技术领域，具体为一种NK细胞体外培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，是机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。在杀伤靶细胞的过程中，NK细胞可以非特异性识别靶细胞，并且不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)的限制，对多种肿瘤细胞有迅速杀伤和溶解作用。但是正常人体外周血中的NK细胞数量较少，仅占外周血淋巴细胞的10％～20％。因此，获得高质量高纯度的NK细胞成为其临床应用最为关键的问题之一。目前，随着生物治疗临床应用的广泛开展，NK细胞治疗取得了一定的临床疗效。
目前，体外培养的NK细胞具有排异性，不能对任何病人使用，在对病人进行治疗时，具有一定的安全风险，对病人的生命安全造成影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NK细胞体外培养方法，通过取用病人本体外周血液中的细胞，有效防止细胞排异性的发生，提高治疗过程的安全性，通过在体外大量培养NK细胞，便于对病人进行治疗。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种NK细胞体外培养方法，包括NK细胞提取和NK细胞培养的方法，所述NK细胞提取和NK细胞培养的方法包括下述步骤：
1)抽取病人的外周血分装在红盖管和绿盖管内，所述红盖管与率盖管各盛有60ml外周血；
2)向绿盖管的血液中加入悬浮液，轻轻摇动混合均匀，向离心管里加入细胞分离液，将离心管放入离心机进行离心操作，离心结束后将白膜层取出，放于一个新的离心管中；
3)向取出的白膜层中加入细胞洗液，用吸管吹打数次，吹打匀后，放入离心机离心内，离心结束，弃上清，再次向白膜层中加入细胞洗液，放入离心机离心内，完成操作；
4)向离心好的细胞中加入细胞接种液，用电动助吸器吹打数次，吹打匀后，转入准备好的培养瓶里，将处理过的血清加入培养瓶中，将培养瓶置培养箱内培养；
5)约培养至第十五或十六天，进行计数，当细胞达到所需剂量时，即可离心收细胞待用。
优选的，所述培养基内设有修正液和白介素，所述培养基内的比例为每1000ml培养基中加入2-3ml修正液和2支白介素-2。
优选的，所述培养瓶使用PBS进行清洗。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过取用病人本体外周血液中的细胞，有效防止细胞排异性的发生，提高治疗过程的安全性，通过在体外大量培养NK细胞，便于对病人进行治疗。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明提供一种技术方案：一种NK细胞体外培养方法，包括NK细胞提取和NK细胞培养的方法，所述NK细胞提取和NK细胞培养的方法包括下述步骤：
1)抽取病人的外周血分装在红盖管和绿盖管内，所述红盖管与率盖管各盛有60ml外周血；
2)向绿盖管的血液中加入悬浮液，轻轻摇动混合均匀，向离心管里加入细胞分离液，将离心管放入离心机进行离心操作，离心结束后将白膜层取出，放于一个新的离心管中；
3)向取出的白膜层中加入细胞洗液，用吸管吹打数次，吹打匀后，放入离心机离心内，离心结束，弃上清，再次向白膜层中加入细胞洗液，放入离心机离心内，完成操作；
4)向离心好的细胞中加入细胞接种液，用电动助吸器吹打数次，吹打匀后，转入准备好的培养瓶里，将处理过的血清加入培养瓶中，将培养瓶置培养箱内培养；
5)约培养至第十五或十六天，进行计数，当细胞达到所需剂量时，即可离心收细胞待用。
所述培养基内设有修正液和白介素-2，所述培养基内的比例为每1000ml培养基中加入2-3ml修正液和2支白介素，通过在培养基内添加修正液和白介素-2，便于配置合适NK细胞生长的培养基。
所述培养瓶使用PBS进行清洗，通过使用PBS对培养瓶进行清洗，便于对培养瓶进行清洁。
工作原理：抽取病人的外周血分装在红盖管和绿盖管内，所述红盖管与率盖管各盛有60ml外周血，将红盖管里的血转入50ml离心管里，离心转速为2000r，离心过后取上层血清，并加入3P-A-L溶液，所述3P-A-L溶液浓度为10％；向绿盖管的血液中加入悬浮液，所述血液与悬浮液比例为10:1，轻轻摇动混合均匀，向50ml离心管里加入细胞分离液，并将绿盖管内血液与悬浮液的混合液沿离心管的管壁缓慢倒入50ml离心管里，混合液与分离液比例为2:1，将离心管放入离心机进行离心操作，离心转速为2000r，持续20min，离心结束后将白膜层取出，放于一个新的50ml离心管中；向取出的白膜层中加入细胞洗液10ml，用吸管吹打数次，吹打匀后，放入离心机离心内，离心转速为1500r，持续8min，离心结束，弃上清，再次向白膜层中加入细胞洗液6ml，放入离心机离心内，离心转速为1500r，持续5min，完成操作；向离心好的细胞中加入细胞接种液，用电动助吸器吹打数次，吹打匀后，转入准备好的培养瓶里，将处理过的血清加入培养瓶中，血清浓度10％，将培养瓶置于37℃，5％二氧化碳培养箱培养；细胞生长到第三天时，向培养瓶中加入NKB1和NKB2各1ml，当细胞生长到第四天时，向培养瓶中加入100ml处理好的培养基，以后每天观察，根据细胞悬液颜色添加培养基，每次按瓶中已有培养基等比例添加，若一个培养瓶中培养物的量达到max线，则采取分瓶处理，当细胞生长到约第9-11天时，根据细胞的生长情况,转移到培养袋培养，约培养至第十五或十六天，进行计数，当细胞达到所需剂量时，即可离心收细胞待用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种NK细胞体外培养方法，包括NK细胞提取和NK细胞培养的方法，其特征在于：所述NK细胞提取和NK细胞培养的方法包括下述步骤：
1)抽取病人的外周血分装在红盖管和绿盖管内，所述红盖管与率盖管各盛有60ml外周血；
2)向绿盖管的血液中加入悬浮液，轻轻摇动混合均匀，向离心管里加入细胞分离液，将离心管放入离心机进行离心操作，离心结束后将白膜层取出，放于一个新的离心管中；
3)向取出的白膜层中加入细胞洗液，用吸管吹打数次，吹打匀后，放入离心机离心内，离心结束，弃上清，再次向白膜层中加入细胞洗液，放入离心机离心内，完成操作；
4)向离心好的细胞中加入细胞接种液，用电动助吸器吹打数次，吹打匀后，转入准备好的培养瓶里，将处理过的血清加入培养瓶中，将培养瓶置培养箱内培养。
5)约培养至第十五或十六天，进行计数，当细胞达到所需剂量时，即可离心收细胞待用。
2.根据权利要求1所述的一种NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述培养基内设有修正液和白介素，所述培养基内的比例为每1000ml培养基中加入2-3ml修正液和2支白介素-2。
3.根据权利要求1所述的一种NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述培养瓶使用PBS进行清洗。
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| WO2010013947A2 (ko) * | 2008-07-29 | 2010-02-04 | 주식회사 녹십자 | 자연살해세포의 증식방법 |
| US20120258085A1 (en) * | 2009-03-26 | 2012-10-11 | Evren Alici | Expansion of NK Cells |
| CN106754701A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-05-31 | 弎西艾斯（苏州）生物科技有限公司 | 一种nk细胞体外诱导、扩增方法 |
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2017
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