CN111084783A - 鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖的应用,具体为在制备调节免疫功能或治疗免疫相关疾病的药物或保健食品中的应用。其中,鱼类体表多糖为黄鳝多糖、鲶鱼多糖、黄鲿鱼多糖、长吻黄鲿鱼多糖或鳗鱼多糖,鱼类体表消化多糖为黄鳝消化多糖、鲶鱼消化多糖、黄鲿鱼消化多糖、长吻黄鲿鱼消化多糖或鳗鱼消化多糖。该鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖能够调节免疫功能,特别是增强免疫功能,或治疗免疫相关疾病,或增强免疫功能治疗疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,特别是涉及鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖的应用。
背景技术
环磷酰胺(Cyclophosphamide)是一种抑制免疫系统的细胞毒性剂药物,已被用于治疗多种疾病,例如治疗血管炎、多发性硬化症、红斑狼疮和韦格纳肉芽肿等免疫系统疾病。另外,环磷酰胺也可诱导患者的免疫抑制,导致患者的免疫功能低下,形成免疫缺陷状态。
鱼类体表多糖是从鱼类体表获得的一种多糖,据报道具有抗氧化、清除氧自由基等活性功能。
目前有关于将多糖用于调节免疫功能或治疗免疫系统疾病的报道。而没有关于鱼类体表的多糖或消化多糖用于调节免疫功能或治疗免疫系统疾病的报道。
发明内容
基于此,有必要提供鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖在制备调节免疫功能或治疗免疫相关疾病的药物中的应用。
此外,该提供鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖在制备调节免疫功能的保健食品中的应用。
鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖在制备调节免疫功能或治疗免疫相关疾病的药物中的应用。
本申请发明人发现,在注射环磷酰胺了的小鼠,通过施用鱼类体表多糖或其消化体表多糖,能够在一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的巨噬细胞吞噬率、B淋巴细胞增值率、T淋巴细胞增值率、NK细胞活力的下降问题,具有恢复小鼠巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞的活力作用,且能够提高小鼠的血清溶血素含量的作用,表明鱼类体表多糖及其消化体表多糖具有不同程度的修复/提高小鼠免疫力的作用,从而能够治疗免疫性相关疾病。
在其中一个实施例中,所述鱼类为无磷或微小鳞片的且分泌体表多糖的鱼类。
在其中一个实施例中,所述鱼类体表多糖为黄鳝多糖、鲶鱼多糖、黄鲿鱼多糖、长吻黄鲿鱼多糖或鳗鱼多糖;所述鱼类体表消化多糖为黄鳝消化多糖、鲶鱼消化多糖、黄鲿鱼消化多糖、长吻黄鲿鱼消化多糖或鳗鱼消化多糖。
在其中一个实施例中,所述鱼类体表多糖的制备方法包括以下步骤:
用高温水处理鱼体,收集鱼类体表层黏液;
往鱼类体表层黏液加入酶,进行酶解,得到酶解液;
使酶解液静置沉淀;
过滤,将滤液进行浓缩,得到浓缩液;
向浓缩液加入醇,得到沉淀物;
对沉淀物进行干燥,得到鱼类体表多糖。
在其中一个实施例中,包括如下(a)~(e)的至少一项:
(a)所述高温水的温度为70℃~90℃;
(b)所述鱼体与高温水的重量体积比为1:1~2;
(c)所述酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的至少一种;
(d)所述酶解的温度为50℃~70℃;
(e)所述醇为乙醇;所述乙醇与浓缩液混合后的乙醇的浓度大于70%。
在其中一个实施例中,所述鱼类体表消化多糖的制备方法包括以下步骤:
将鱼类体表多糖与体外模拟胃液混合进行消化,得到胃液消化后的鱼类体表多糖溶液;
将消化后的鱼类体表多糖溶液加入体外模拟的肠消化液,得到胃肠液消化后的鱼类体表多糖溶液;
将胃肠液消化后的鱼类体表多糖溶液与离体肠道菌液混合,依次经过厌氧培养,灭菌、过滤,得到滤液;再将滤液进行干燥,得到鱼类体表消化多糖。
在其中一个实施例中,所述疾病为肿瘤、癌症或病毒相关的疾病。
一种调节免疫功能或治疗免疫相关疾病的药物,所述药物包括鱼类体表多糖或鱼类体表消化多糖及任选至少一种药学上可接受的赋形剂。
鱼类体表多糖及鱼类消化体表多糖在制备调节免疫功能的保健食品中的应用。
一种增强免疫力的保健食品,包括鱼类体表多糖或鱼类体表消化多糖。
本发明的保健食品中的鱼类体表多糖或鱼类体表消化多糖通过增加血清溶血素含量来增强免疫力。
在其中一个实施例中,所述鱼类体表多糖为黄鳝多糖、鲶鱼多糖、黄鲿鱼多糖、长吻黄鲿鱼多糖或鳗鱼多糖;鱼类体表消化多糖为黄鳝消化多糖、鲶鱼消化多糖、黄鲿鱼消化多糖、长吻黄鲿鱼消化多糖或鳗鱼消化多糖。
附图说明
图1是多糖小鼠注射环磷酰胺后体重变化图;
图2是显示多糖小鼠免疫器官指数测定结果的图;
图3A~3F是显示多糖小鼠巨噬细胞吞噬实验的图;
图4A是多糖小鼠巨噬细胞吞噬率测定结果图;
图4B是多糖小鼠巨噬细胞吞噬指数测定结果图;
图5A是显示多糖小鼠T淋巴细胞增殖率的图;
图5B是显示多糖小鼠B淋巴细胞增殖率的图;
图6是显示多糖小鼠NK细胞活性的图;
图7是显示消化多糖小鼠血清溶血实验HC50结果的图;
图8是消化多糖小鼠注射环磷酰胺后体重变化图;
图9是显示消化多糖小鼠免疫器官指数测定结果的图;
图10A~10F是显示消化多糖小鼠巨噬细胞吞噬实验的图;
图11A是消化多糖小鼠巨噬细胞吞噬率测定结果图;
图11B是消化多糖小鼠巨噬细胞吞噬指数测定结果图;
图12A是显示消化多糖小鼠T淋巴细胞增殖率的图;
图12B是显示消化多糖小鼠B淋巴细胞增殖率的图;
图13是显示消化多糖小鼠NK细胞活性的图;
图14是显示消化多糖小鼠血清溶血实验HC50结果的图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一实施方式的鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖在制备调节免疫功能或治疗免疫相关疾病的药物中的应用。
本申请发明人发现,在注射环磷酰胺了的小鼠,通过施用鱼类体表多糖或鱼类消化体表多糖,能够在一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的巨噬细胞吞噬率、B淋巴细胞增值率、T淋巴细胞增值率、NK细胞活力的下降问题,具有恢复小鼠巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞的活力作用,且能够提高小鼠的血清溶血素含量的作用,表明鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖具有不同程度的修复/提高小鼠免疫力的作用,从而能够治疗免疫性相关疾病。
具体地,鱼类体表多糖是从鱼类体表获得的一种多糖。鱼类体表消化多糖为鱼类体表多糖经胃肠消化后的溶液与离体肠道菌液混合后的经厌氧培养得到的物质。
本实施方式的免疫相关疾病可由免疫抑制剂诱导的,如环磷酰胺,还可以由环境因素引起的。
其中,鱼类为无磷或微小鳞片的且分泌体表多糖的鱼类。
在其中一个实施例中,鱼类体表多糖为黄鳝多糖、鲶鱼多糖、黄鲿鱼多糖、长吻黄鲿鱼多糖或鳗鱼多糖。采用上述鱼类体表多糖或消化多糖能够有效的增强机体免疫能力,治疗免疫相关疾病。
在其中一个实施例中,所述鱼类体表多糖的制备方法包括以下步骤:
步骤S100:用高温水处理鱼体,收集鱼类体表层黏液;
具体地,所述高温水的温度为70℃~90℃;鱼体与高温水的重量体积比为1:1~2;
步骤S110:往鱼类体表层黏液加入酶,进行酶解,得到酶解液;
其中,酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的至少一种;酶的重量为鱼体重量的0.05%,酶解的温度为50℃~70℃;可以为60℃、65℃。更进一步地,可以在60℃水浴保温酶解6小时;加热至沸腾,保持20分钟;
步骤S120:使酶解液静置沉淀;
具体地,向酶解液加入鲶鱼重量0.2%的硅藻土,搅拌均匀后4℃静置4小时。
步骤S130:过滤,将滤液进行浓缩,得到浓缩液;
步骤S140:向浓缩液加入醇,得到沉淀物;
醇为高浓度95%乙醇;所述乙醇与浓缩液混合后的浓度大于70%。具体地,通过在4℃、10000r/min离心10min,得白色或类白色沉淀;
步骤S150:对沉淀物进行干燥,得到鱼类体表多糖。
具体地,沉淀用95%乙醇洗涤2次,然后在60℃经鼓风干燥,得到类白色粉末。
在其中一个实施例中,所述鱼类体表消化多糖为黄鳝消化多糖、鲶鱼消化多糖、黄鲿鱼消化多糖、长吻黄鲿鱼消化多糖或鳗鱼消化多糖。
具体地,鱼类体表消化多糖的制备方法包括以下步骤:
步骤S200:将鱼类体表多糖与体外模拟胃液混合进行消化,得到胃液消化后的鱼类体表多糖溶液;
步骤S210:将消化后的鱼类体表多糖溶液加入体外模拟的肠消化液,得到胃肠液消化后的鱼类体表多糖溶液;
步骤S220:将胃肠液消化后的鱼类体表多糖溶液与离体肠道菌液混合,依次经过厌氧培养,灭菌、过滤,得到滤液;再将滤液进行干燥,得到鱼类体表消化多糖。
在其中一个实施例中,在加入体外模拟的肠消化液之前,包括将胃液消化后的鱼类体表多糖溶液的pH调节至7的步骤。
具体地,鱼类体表多糖于150r/min、37℃的摇床中消化2h后取出,用1mol/LNaHCO3调节溶液pH值为7,然后向锥形瓶中加入48mL的体外模拟的肠消化液,充分混合后,于150r/min、37℃的摇床中消化4h,将离体肠道菌液与体表多糖经胃肠消化后的溶液,混合均匀,置于37℃厌氧培养4h,高压蒸汽121℃灭菌20min,过滤,滤液浓缩后60℃鼓风干燥。
体外模拟胃液、肠液均采用本领域常规技术实现,在其中一个实施例中,体外模拟胃液制备包括:
配制含3.1g/LNaCl、1.1g/LKCl、0.15g/LCaCl2、0.6g/LNaHCO3的胃电解质溶液;再将187.5mg胃蛋白酶和165mg胃脂肪酶中加入250mL胃电解质溶液,混合均匀;用HCl调pH值至2±0.2;及/或;
体外模拟肠液的制备包括:配制含5.4g/LNaCl、0.65g/L KCl、0.33g/L CaCl2的肠电解质溶液;将70g/L胰酶胰酶溶液与肠电解质溶液以1:1体积比混合均匀,用NaHCO3调节pH值至7±0.2。
在其中一个实施例中,所述免疫相关疾病是能通过恢复巨噬细胞活力或NK细胞活力;及/或,提高血清溶血素含量、增强T细胞或脾淋巴细胞增殖及活性治疗的疾病。
在其中一个实施例中,所述疾病为肿瘤、癌症或病毒相关的疾病。
一种调节免疫功能或治疗免疫相关疾病的药物,所述药物包括鱼类体表多糖或鱼类体表消化多糖及任选至少一种药学上可接受的赋形剂。
本实施方式的药物用于调节免疫功能,特别是增强免疫功能,或治疗免疫相关疾病,或增强免疫功能治疗疾病。
本实施方式的药物可根据本领域技术人员公知的方法制备。本发明的药物为片剂、丸剂、软胶囊剂、颗粒剂、散剂、溶液剂、糖浆剂以及任何其他合适的剂型。本实施方式的药物可口服施用。也可注射施用,例如经腹膜内、肌内、动脉内、静脉内、皮下、皮内等途径。
鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖在制备调节免疫功能的保健食品中的应用。该鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖可通过提高血清溶血素含量来提高免疫功能。
鱼类体表多糖为黄鳝多糖、鲶鱼多糖、黄鲿鱼多糖、长吻黄鲿鱼多糖或鳗鱼多糖;
具体地,鱼类体表消化多糖为黄鳝消化多糖、鲶鱼消化多糖、黄鲿鱼消化多糖、长吻黄鲿鱼消化多糖或鳗鱼消化多糖。
一种增强免疫力的保健食品,包括鱼类体表多糖或鱼类消化体表多糖。
本实施方式的保健食品还可包含在食品中通常使用的其他组分,例如各种添加剂等。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但不用于限制本发明。
下述实施例1~4中所用鱼类体表多糖可按中国专利(申请号为201811215236.1)中所述方法制备。或按钦传光等(钦传光,黄开勋,徐辉碧,泥鳅多糖的免疫作用研究,中国药学杂志,2002年8月第37卷第8期)方法制备。
1.多糖的检测
硫酸-苯酚法标准曲线:精密称取葡萄糖对照品100mg,置于1000mL容量瓶中,加适量水溶解,稀释至刻度,摇匀,即得0.1mg/mL葡萄糖母液。分别吸取葡萄糖母液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL至25mL加塞试管中,加水补足至2.0mL,加入5%苯酚水溶液1.0mL并混匀。随后快速加入5mL浓硫酸,10min后摇匀30s,30℃水浴20min。准确吸取150μl葡萄糖溶液至96孔板中,在490nm波长处以试剂空白溶液为参比,测定吸光度。以吸光度为横坐标,葡萄糖浓度为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程:Y=0.1707X+0.0007(R2=0.9997)。
样品配制:精密称取适量样品,置于25mL容量瓶中,加适量水溶解,稀释至刻度,摇匀,即得样品溶液。吸取样品1mL至25mL加塞试管中,加水补足至2.0mL,加入5%苯酚水溶液1.0mL混匀。随后快速加入5mL浓硫酸,10min后摇匀30s,30℃水浴20min。准确吸取150μl葡萄糖溶液至96孔板中,在490nm波长处以试剂空白溶液为参比,测定吸光度。
鱼类体表多糖浓度={0.1707×(A样品-A空白)+0.0007}/1×2×25/M取样量×100%。
2.体外模拟胃液和模拟肠液的配制:胃电解质溶液:1.55g NaCl、0.55g KCl、0.075g CaCl2、0.3g NaHCO3溶于0.5L的去离子水中。体外模拟胃液:187.5mg胃蛋白酶和165mg胃脂肪酶中加入250mL胃电解质溶液,混合均匀,用1mol/L HCl调pH值至2。肠电解质溶液:0.54gNaCl、0.065g KCl、0.033g CaCl2溶于100mL的去离子水。7g/100mL胰酶:7g胰酶溶于100mL水,4800×g离心10min,取上清液待用。体外模拟肠液:90mL胰酶溶液中加入90mL肠电解质溶液,混合均匀,用1mol/LNaHCO3调节pH值至7。
3.厌氧培养基制备培养基组成:
A为7.5mL(1%K2HPO4·3H2O);B为37.5mL(0.47%KH2PO4、1.18%NaCl、1.2%(NH4)2SO4、0.16%CaCl2·H2O、0.45%MgSO4·7H2O);C为50mL(8%Na2CO3);0.5g L~半胱氨酸,2mL(25%L-抗坏血酸),1g牛肉浸膏,1g蛋白胨。以上加超纯水适量,1mol/L HCl调节pH至7.5~7.7,定容至1000mL,所得培养基分配于管,115℃下以0.07MPa高压灭菌30min,4℃下贮存或立即使用。
4.粪便采集与处理(所用器具均经高压蒸汽121℃灭菌20min):
筛选6例健康人体(男女各3例)收集新鲜粪便1次,将所得标本尽快置于-80℃冰箱中。取1个离心管,充满氮气,装入4g粪便并加入40mL生理盐水,涡旋混合制成悬浊液,5000r/min离心10min后得上清液,作为肠菌液。取肠菌液10mL置于培养瓶中,加入30mL厌氧培养液,混匀,作为肠菌培养液(整个过程于N2流下操作),迅速置于厌氧培养罐中,加入1个厌氧产气袋后盖上培养罐盖,置于37℃恒温培养箱中培养24h,使肠菌培养液中的肠道菌充分成长。
实施例1黄鳝多糖的制备
经浸养干净的黄鳝2kg,置于带盖不锈钢桶中,将80℃2倍黄鳝重量体积的热水倒入桶中,盖好盖子,搅拌1分钟,过滤,收集热水液;收集液放冷后加入黄鳝重量0.05%的木瓜蛋白酶(800μ/mg),60℃水浴保温酶解6小时;加热至沸腾,保持20分钟;向酶解液加入黄鳝重量0.2%的硅藻土,搅拌均匀后4℃静置4小时,过滤,浓缩至200mL左右,加4倍95%乙醇,使醇浓度大于70%,混合均匀,4℃静置8小时;4℃、10000r/min离心10min,得白色或类白色沉淀,沉淀用95%乙醇洗涤2次,然后在60℃经鼓风干燥,得到类白色粉末,根据检测,黄鳝多糖含量为27.8%。
实施例2鲶鱼多糖的制备
经浸养干净的鲶鱼2kg,置于带盖不锈钢桶中,将80℃1倍鲶鱼重量体积的热水倒入桶中,盖好盖子,搅拌1分钟,过滤,收集热水液;收集液放冷后加入鲶鱼重量0.05%的木瓜蛋白酶(800μ/mg),60℃水浴保温酶解6小时;加热至沸腾,保持20分钟;向酶解液加入鲶鱼重量0.2%的硅藻土,搅拌均匀后4℃静置4小时,过滤,浓缩至200mL左右,加4倍95%乙醇,使醇浓度大于70%,混合均匀,4℃静置8小时;4℃、10000r/min离心10min,得浅棕色或类白色沉淀,沉淀用95%乙醇洗涤2次,然后在60℃经鼓风干燥,得到浅棕色粉末。根据检测,鲶鱼多糖含量为21.9%。
实施例3黄鲿鱼多糖的制备
经浸养干净的黄鲿鱼2kg,置于带盖不锈钢桶中,将80℃1.5倍黄鲿鱼重量体积的热水倒入桶中,盖好盖子,搅拌1分钟,过滤,收集热水液;收集液放冷后加入黄鲿鱼重量0.05%的木瓜蛋白酶(800μ/mg),60℃水浴保温酶解6小时;加热至沸腾,保持20分钟;向酶解液加入黄鲿鱼重量0.2%的硅藻土,搅拌均匀后4℃静置4小时,过滤,浓缩至200mL左右,加4倍95%乙醇,使醇浓度大于70%,混合均匀,4℃静置8小时;4℃、10000r/min离心10min,得白色或类白色沉淀,沉淀用95%乙醇洗涤2次,然后在60℃经鼓风干燥,得到类白色粉末。根据检测,黄鲿鱼多糖含量为19.2%。
实施例4鳗鱼多糖的制备
经浸养干净的鳗鱼2kg,置于带盖不锈钢桶中,将80℃1倍鳗鱼重量体积的热水倒入桶中,盖好盖子,搅拌1分钟,过滤,收集热水液;收集液放冷后加入鳗鱼重量0.05%的木瓜蛋白酶(800μ/mg),60℃水浴保温酶解6小时;加热至沸腾,保持20分钟;向酶解液加入鳗鱼重量0.2%的硅藻土,搅拌均匀后4℃静置4小时,过滤,浓缩至200mL左右,加4倍95%乙醇,使醇浓度大于70%,混合均匀,4℃静置8小时;4℃、10000r/min离心10min,得白色或类白色沉淀,沉淀用95%乙醇洗涤2次,然后在60℃经鼓风干燥,得到类白色粉末。根据检测,鳗鱼多糖含量为21.3%。
实施例5多糖动物实验
5.1动物实验方案
5.1.1实验动物
雄性清洁级Bclb/c小鼠,18g±2g(5w),90只,6组,每组15只。
5.1.2饲养条件
12h交替光照,充足食物和水供给。
5.1.3实验分组
5.1.3.1小鼠适应性培养一周后,造模小鼠(随机选取75只)按照80mg/kg/d剂量腹腔注射环磷酰胺,对照组给予相同体积的生理盐水。
5.1.3.2注射3天后,按照不同组给予药物/生理盐水,各组均自由进食进水。
5.1.3.3随机分成6组如下:
A:正常组:生理盐水200μl/d,连续灌胃28天,每天灌胃一次;
B:模型组:生理盐水200μl/d,连续灌胃28天,每天灌胃一次;
C:药物1组:剂量250mg/kg/d,连续灌胃28天,每天灌胃一次;
D:药物2组:剂量250mg/kg/d,连续灌胃28天,每天灌胃一次;
E:药物3组:剂量250mg/kg/d,连续灌胃28天,每天灌胃一次;
F:药物4组:剂量250mg/kg/d,连续灌胃28天,每天灌胃一次;
其中药物1组的药物采用实施例1的黄鳝多糖、药物2组的药物采用实施例2的鲶鱼多糖、药物3组的药物采用实施例3的黄鲿鱼多糖、药物4组的药物采用实施例4的鳗鱼多糖。
5.1.3.4末次给药24h后,各个小鼠称重,各个随机选取3只小鼠用于小鼠巨噬细胞吞噬实验;3只用于脾淋巴细胞转化实验;3只用于NK细胞活力检测,3只小鼠摘取眼球取血清于后续检测,同时,此3只小鼠颈脱臼处死,取脾脏和胸腺称重;3只用于检测血清溶血素测定(给药前五天每天腹腔注射2%SRBC0.2mL,连续五天)。
5.2小鼠体重增长变化
分别于实验注射环磷酰胺前(图中负d3)、1d(图中d1)、4d(图中d4)、9d(图中d9)、14d(图中d14)、21d(图中d21)和28d(图中d28)对小鼠进行称重,观察小鼠的体重变化和精神状态。
实验结果显示,造模小鼠注射环磷酰胺后,均出现不同程度的体重下降、活动减少的情况,停止注射后体重开始上升,状态开始好转。结果见图1。
5.3小鼠免疫器官指数测定
小鼠免疫器官指数测定结果显示于图2。**表示和正常组相比,具有显著性差异;^^表示和模型组相比,具有显著性差异。
5.3.1和正常组相比,模型组、药物1~4组对脾指数影响无差异,提示对脾脏影响有限;
5.3.2和模型组相比,药物1~4组均能一定程度的改善由环磷酰胺造成的小鼠胸腺损伤,其中药物1~2组具有显著性差异。
5.4小鼠巨噬细胞吞噬指数测定
5.4.1实验步骤
5.4.1.1用生理盐水将4%的鸡红细胞稀释成1%的鸡红细胞;
5.4.1.2每只受试小鼠腹腔注射上述鸡红细胞1mL,轻揉腹部使其分散;
5.4.1.330min后处死小鼠,固定小鼠后轻轻剪开小鼠表皮层并将其撕裂(切勿剪破腹膜层);
5.4.1.4注射5mL的生理盐水并轻柔腹部使其充分分散;
5.4.1.5用10mL注射器针头刺入腹部,并吸出腹腔液;
5.4.1.6取200μl腹腔液置于载玻片上并分散,37度培养箱孵育30min;
5.4.1.7生理盐水从玻片一端滴下,使废液从另外一端流出,轻轻洗涤2min;
5.4.1.8丙酮:甲醇(1:1)固定液固定5min后晾干玻片;
5.4.1.9滴加吉姆萨染色液固定5min左右;
5.4.1.10自来水从玻片一端滴下,使废液从另外一端流出,轻轻洗涤3min;
5.4.1.11将洗涤好的片子放到片架上,放入冰箱使其自然干燥;
5.4.1.12显微镜观察玻片,随机选取视野计算100个巨噬细胞(深紫色,个体较大,形状不定,核大),并计算其中的鸡红细胞(细胞核淡紫色,个体小,被吞噬的鸡红细胞部分可见裂解,核小(需要区分小鼠单核细胞));
5.4.1.13分别计算吞噬率(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞/计数的巨噬细胞*100%)和吞噬指数(被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞)
5.4.1.14照片见图3A~图3E(400x)
图3A是正常组的结果,图3B是模型组的结果,图3C是药物1组的结果,图3D是药物2组的结果,图3E是药物3组的结果,图3F是药物4组的结果。
5.4.2实验结果
实验结果见图4A~4B。**表示和正常组相比,具有显著性差异;^^表示和模型组相比,具有显著性差异。
5.4.3实验结论
5.4.3.1药物1~4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的巨噬细胞吞噬指数下降问题,表明药物1~4有恢复小鼠巨噬细胞活力的作用,其中药物3组具有显著性差异;
5.4.3.2药物1~4组均一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的巨噬细胞吞噬率下降问题,表明药物1~4有恢复小鼠巨噬细胞活力的作用,其中药物3组具有显著性差异。
5.5、小鼠脾淋巴细胞转化实验
5.5.1实验步骤
5.5.1.1颈椎脱臼法处死小鼠,75%酒精中浸泡5min;
5.5.1.2在生物安全柜中解剖小鼠,分离出脾脏;
5.5.1.3用眼科手术剪取部分脾脏(绿豆大小),用注射器的注射器芯(橡胶部分)在200目的不锈钢筛上研磨,同时滴加pbs,收集透过不锈钢筛的细胞悬液;
5.5.1.4离心收集细胞,用完全培养基重悬细胞,计数;
5.5.1.5将细胞浓度调整成1*106个/mL,取100μl培养基加入到96孔细胞培养板中;
5.5.1.6每个样本设置3组(对照组、LPS组、ConA组),每组三重复,LPS的终浓度为1μg/mL,ConA的终浓度为5μg/mL;
5.5.1.737度,5%CO2的培养箱中培养68h;
5.5.1.8每孔加入10μl cck8试剂,继续培养4h;
5.5.1.9酶标仪450nm处测定OD值;
5.5.1.10计算细胞增殖率((1-对照组OD值/实验组OD值)*100%)。
5.5.2实验结果
实验结果见图5A~5B。**表示和正常组比较有显著性差异;^^表示和模型组比较有显著性差异。
5.5.3实验结论
5.5.3.1药物1~4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的T淋巴细胞增值率下降问题,提示药物1~4有恢复小鼠T淋巴细胞活力的作用,药物1~2组具有显著性差异;
5.5.3.2药物1~4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的B淋巴细胞增值率下降问题,提示药物1~4有恢复小鼠B淋巴细胞活力的作用。
5.6NK细胞活力测定
5.6.1实验步骤
5.6.1.1.颈椎脱臼法处死小鼠,无菌条件下取出脾脏,用无菌HANK’S液清洗数次;
5.6.1.2.用手术剪刀剪碎脾脏(尽量剪成小块)后研磨,用HANK’S液洗涤数次,将洗涤液过200目无菌不锈钢网筛;
5.6.1.3.1000rpm/min离心5分钟,弃上清,用完全培养液重悬细胞,台酚蓝染色计数(活细胞在95%以上),调整细胞浓度为2*105个/mL;
5.6.1.4.将培养好的靶细胞(YAC-1细胞),调整细胞浓度为1*107个/mL;
5.6.1.5.靶细胞和脾淋巴细胞各取50μl(数量比50:1),加入准备好的96孔板中,混匀,37度,5%CO2,培养4小时;(设立靶细胞自发释放组(不含效应细胞,用完全培养基代替)和靶细胞最大释放组(额外添加2.5%triton))。
5.6.1.6.1000rpm/min,离心5min,收集上清液待测LDH含量;
5.6.1.7.取20μl待测样本,分别加入25μl基质缓冲液和5μl辅酶I,混匀,37度温育15min。
5.6.1.8.加入2,4-二硝基苯肼25μl,混匀,37度温育15min;
5.6.1.9.加入250μl 0.4M NaOH溶液,混匀,室温放置5min;
5.6.1.10.酶标仪450nm测定OD值。
5.6.2实验结果
实验结果见图6。**表示和正常组比较有显著性差异;^^表示和模型组比较有显著性差异。
5.6.3实验结论
药物1~4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的NK细胞活力下降问题,提示药物1~4有恢复小鼠NK细胞活力的作用,其中药物3组具有显著性差异。
5.7、小鼠血清溶血素测定
5.7.1实验步骤
5.7.1.1在小鼠给药结束前5天,受试小鼠每组5只腹腔注射2%的SRBC200μl;
5.7.1.2五天后,摘除眼球取全血,室温放置1h后,2500rpm/min 10min分离血清;
5.7.1.3取血清,用SA缓冲液200x稀释至1mL;
5.7.1.4加入用SA缓冲液稀释(1:8)的补体1mL;
5.7.1.5加入10%SRBC 0.5mL,轻轻混匀,37度孵育30min;
5.7.1.6冰浴终止反应,2000rpm离心10min;
5.7.1.7取1mL上清液,加入3mL氰化高铁血红蛋白检测液(南京建成,C021~1),同时取10%SRBC 0.25mL加入3.75mL氰化高铁血红蛋白检测液;
5.7.1.8充分混匀后,放置10min,以对照管为空白,于540nm处测定OD值;
5.7.1.9计算HC50,HC50=样品OD值/SRBC半数溶血值OD值*稀释倍数。
5.7.2实验结果
实验结果见图7。**表示和正常组比较有显著性差异;^^表示和模型组比较有显著性差异。
5.7.3实验分析
5.7.3.1和正常组相比,模型组的HC50低于正常组,且显著性差异,提示模型组的小鼠抗体生成能力低于正常组;
5.7.3.2和正常组相比,各个药物组的HC50逐渐升高,但无差异。
5.7.3.3和模型组相比,正常组的HC50高于模型组,且显著性差异,提示模型组造模成功;
5.7.3.4和模型组相比,药物1~4组的HC50逐渐升高,提示药物1~4组不同程度的有修复/提高小鼠免疫力的作用。
下述实施例6~9中所用鱼类体表多糖原料可按上述实施例1~4方法制备;或按钦传光等(钦传光,黄开勋,徐辉碧,泥鳅多糖的免疫作用研究,中国药学杂志,2002年8月第37卷第8期)方法制备;也可高温杀死鱼后刮取。
实施例6黄鳝消化多糖的制备
取其中1份黄鳝多糖,20mL纯化水溶解,80mL体外模拟胃液充分混合后,于150r/min,37℃的摇床中消化。2h后取出,用1mol/LNaHCO3调节溶液pH值为7,然后向锥形瓶中加入48mL的体外模拟的肠消化液,充分混合后,于150r/min,37℃的摇床中消化。4h后取出,将离体肠道菌液与黄鳝多糖经胃肠消化后的溶液,混合均匀,立即置于于厌氧培养罐中,加入1个厌氧产气袋后迅速盖上培养罐盖,置于37℃恒温培养箱,分别培养4h后,高压蒸汽121℃灭菌20min,过滤,滤液浓缩后60℃鼓风干燥,作为药物1组。
实施例7鲶鱼消化多糖的制备
取其中1份鲶鱼多糖,20mL纯化水溶解,80mL体外模拟胃液充分混合后,于150r/min,37℃的摇床中消化;2h后取出,用1mol/LNaHCO3调节溶液pH值为7,然后向锥形瓶中加入48mL的体外模拟的肠消化液,充分混合后,于150r/min,37℃的摇床中消化。4h后取出,将离体肠道菌液与鲶鱼多糖经胃肠消化后的溶液,混合均匀,立即置于于厌氧培养罐中,加入1个厌氧产气袋后迅速盖上培养罐盖,置于37℃恒温培养箱,分别培养4h后,高压蒸汽121℃灭菌20min,过滤,滤液浓缩后60℃鼓风干燥,作为药物2组。
实施例8黄鲿鱼消化多糖的制备
取其中1份黄鲿鱼多糖,20mL纯化水溶解,80mL体外模拟胃液充分混合后,于150r/min,37℃的摇床中消化。2h后取出,用1mol/LNaHCO3调节溶液pH值为7,然后向锥形瓶中加入48mL的体外模拟的肠消化液,充分混合后,于150r/min,37℃的摇床中消化。4h后取出,将离体肠道菌液与黄鲿鱼多糖经胃肠消化后的溶液,混合均匀,立即置于于厌氧培养罐中,加入1个厌氧产气袋后迅速盖上培养罐盖,置于37℃恒温培养箱,分别培养4h后,高压蒸汽121℃灭菌20min,过滤,滤液浓缩后60℃鼓风干燥,作为药物3组。
实施例9.鳗鱼消化多糖的制备
取其中1份鳗鱼多糖,20mL纯化水溶解,80mL体外模拟胃液充分混合后,于150r/min,37℃的摇床中消化。2h后取出,用1mol/LNaHCO3调节溶液pH值为7,然后向锥形瓶中加入48mL的体外模拟的肠消化液,充分混合后,于150r/min,37℃的摇床中消化。4h后取出,将离体肠道菌液与鳗鱼多糖经胃肠消化后的溶液,混合均匀,立即置于于厌氧培养罐中,加入1个厌氧产气袋后迅速盖上培养罐盖,置于37℃恒温培养箱,分别培养4h后,高压蒸汽121℃灭菌20min,过滤,滤液浓缩后60℃鼓风干燥,作为药物4组。
实施例10消化多糖动物实验
10.1动物实验方案
10.1.1实验动物
雄性清洁级Bclb/c小鼠,18g±2g(5w),90只,6组,每组15只。
10.1.2饲养条件
12h交替光照,充足食物和水供给。
10.1.3实验分组
10.1.3.1小鼠适应性培养一周后,造模小鼠(随机选取75只)按照80mg/kg/d剂量腹腔注射环磷酰胺,对照组给予相同体积的生理盐水。
10.1.3.2注射3天后,按照不同组给予药物/生理盐水,各组均自由进食进水。
10.1.3.3随机分成6组如下:
A:正常组:生理盐水200ul/d,连续灌胃28天,每天灌胃一次;
B:模型组:生理盐水200ul/d,连续灌胃28天,每天灌胃一次;
C:药物1组:剂量250mg/kg/d,连续灌胃28天,每天灌胃一次;
D:药物2组:剂量250mg/kg/d,连续灌胃28天,每天灌胃一次;
E:药物3组:剂量250mg/kg/d,连续灌胃28天,每天灌胃一次;
F:药物4组:剂量250mg/kg/d,连续灌胃28天,每天灌胃一次;
10.1.3.4末次给药24h后,各个小鼠称重,各个随机选取3只小鼠用于小鼠巨噬细胞吞噬实验;3只用于脾淋巴细胞转化实验;3只用于NK细胞活力检测,3只小鼠摘取眼球取血清于后续检测,同时,此3只小鼠颈脱臼处死,取脾脏和胸腺称重;3只用于检测血清溶血素测定(给药前五天每天腹腔注射2%SRBC0.2ml,连续五天)。
10.2小鼠体重增长变化
分别于实验注射环磷酰胺前(图中负d3)、1d(图中d1)、4d(图中d4)、9d(图中d9)、14d(图中d14)、21d(图中d21)和28d(图中d28)对小鼠进行称重,观察小鼠的体重变化和精神状态。
实验结果显示,造模小鼠注射环磷酰胺后,均出现不同程度的体重下降、活动减少的情况,停止注射后体重开始上升,状态开始好转。结果见图8。
10.3小鼠免疫器官指数测定
小鼠免疫器官指数测定结果显示于图9。**表示和正常组相比,具有显著性差异;^^表示和模型组相比,具有显著性差异。
10.3.1和正常组相比,模型组、药物1~4组对脾指数影响无差异,提示对脾脏影响有限;
10.3.2和模型组相比,药物1~4组均能一定程度的改善由环磷酰胺造成的小鼠胸腺损伤,其中药物2~4组具有显著性差异。
10.4小鼠巨噬细胞吞噬指数测定
10.4.1照片见图10A~图10E(400x)
图10A是正常组的结果,图10B是模型组的结果,图10C是药物1组的结果,图10D是药物2组的结果,图10E是药物3组的结果,图10F是药物4组的结果。
10.4.2实验结果
实验结果见图11A~11B。**表示和正常组相比,具有显著性差异;^^表示和模型组相比,具有显著性差异。
10.4.3实验结论
10.4.3.1药物1~4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的巨噬细胞吞噬指数下降问题,提示药物1~4有恢复小鼠巨噬细胞活力的作用,其中药物1、3~4组具有显著性差异;
10.4.3.2药物1~4组均一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的巨噬细胞吞噬率下降问题,提示药物1~4有恢复小鼠巨噬细胞活力的作用,其中药物1、3~4组具有显著性差异。
10.5、小鼠脾淋巴细胞转化实验
10.5.1实验结果
实验结果见图12A~12B。**表示和正常组比较有显著性差异;^^表示和模型组比较有显著性差异。
10.5.2实验结论
10.5.2.1药物1~4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的T淋巴细胞增值率下降问题,提示药物1~4有恢复小鼠T淋巴细胞活力的作用,药物1~4组均具有显著性差异;
10.5.2.2药物1~4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的B淋巴细胞增值率下降问题,提示药物1~4有恢复小鼠B淋巴细胞活力的作用,药物1~4组均具有显著性差异。
10.6NK细胞活力测定
10.6.1实验结果
实验结果见图13。**表示和正常组比较有显著性差异;^^表示和模型组比较有显著性差异。
10.6.2实验结论
药物1~4组均能一定程度的恢复小鼠因环磷酰胺导致的NK细胞活力下降问题,提示药物1~4有恢复小鼠NK细胞活力的作用,药物1~4组与模型组均具有显著性差异。
10.7、小鼠血清溶血素测定
10.7.1实验结果
实验结果见图14。**表示和正常组比较有显著性差异;^^表示和模型组比较有显著性差异。
10.7.2实验分析
10.7.2.1和正常组相比,模型组的HC50低于正常组,且显著性差异,提示模型组的小鼠抗体生成能力低于正常组;
10.7.2.2和正常组相比,各个药物组的HC50逐渐升高,但无差异。
10.7.2.3和模型组相比,正常组的HC50高于模型组,且显著性差异,提示模型组造模成功;
10.7.2.4和模型组相比,各个药物组的HC50逐渐升高,且具有显著性差异,提示药物1~4组不同程度的有修复/提高小鼠免疫力的作用。
从上述结果可知,黄鳝多糖,鲶鱼多糖,黄颡鱼多糖,长吻鮠多糖,消化黄鳝多糖,消化鲶鱼多糖,消化黄颡鱼多糖,消化长吻鮠多糖均具有极好的增强免疫功能的效果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖在制备调节免疫功能或治疗免疫相关疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述鱼类为无磷或微小鳞片的且分泌体表多糖的鱼类。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述鱼类体表多糖为黄鳝多糖、鲶鱼多糖、黄鲿鱼多糖、长吻黄鲿鱼多糖或鳗鱼多糖;所述鱼类体表消化多糖为黄鳝消化多糖、鲶鱼消化多糖、黄鲿鱼消化多糖、长吻黄鲿鱼消化多糖或鳗鱼消化多糖。
4.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述鱼类体表多糖的制备方法包括以下步骤:
用高温水处理鱼体,收集鱼类体表层黏液;
往鱼类体表层黏液加入酶,进行酶解,得到酶解液;
使酶解液静置沉淀;
过滤,将滤液进行浓缩,得到浓缩液;
向浓缩液加入醇,得到沉淀物;
对沉淀物进行干燥,得到鱼类体表多糖。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,包括如下(a)~(e)的至少一项:
(a)所述高温水的温度为70℃~90℃;
(b)所述鱼体与高温水的重量体积比为1:1~2;
(c)所述酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的至少一种;
(d)所述酶解的温度为50℃~70℃;
(e)所述醇为乙醇;所述乙醇与浓缩液混合后的乙醇的浓度大于70%。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述鱼类体表消化多糖的制备方法包括以下步骤:
将鱼类体表多糖与体外模拟胃液混合进行消化,得到胃液消化后的鱼类体表多糖溶液;
将消化后的鱼类体表多糖溶液加入体外模拟的肠消化液,得到胃肠液消化后的鱼类体表多糖溶液;
将胃肠液消化后的鱼类体表多糖溶液与离体肠道菌液混合,依次经过厌氧培养,灭菌、过滤,得到滤液;再将滤液进行干燥,得到鱼类体表消化多糖。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述疾病为肿瘤、癌症或病毒相关的疾病。
8.一种调节免疫功能或治疗免疫相关疾病的药物,其特征在于,所述药物包括鱼类体表多糖或鱼类体表消化多糖及任选至少一种药学上可接受的赋形剂。
9.鱼类体表多糖及鱼类体表消化多糖在制备调节免疫功能的保健食品中的应用。
10.一种增强免疫力的保健食品,其特征在于,包括鱼类体表多糖或鱼类体表消化多糖。
11.根据权利要求10所述的保健食品,其特征在于,所述鱼类体表多糖为黄鳝多糖、鲶鱼多糖、黄鲿鱼多糖、长吻黄鲿鱼多糖或鳗鱼多糖;鱼类体表消化多糖为黄鳝消化多糖、鲶鱼消化多糖、黄鲿鱼消化多糖、长吻黄鲿鱼消化多糖或鳗鱼消化多糖。
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