CN104352521B - 制备小牛脾提取物的方法及在抗肿瘤和免疫调节中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备小牛脾提取物的方法及在抗肿瘤和免疫调节中的应用。所述小牛脾提取物的制备工艺为包括匀浆液的制备，利用复合酶的协同作用对匀浆液酶解、5'‑磷酸二酯酶酶解和膜过滤，以及无菌过滤和灌装。本发明改进了小牛脾提取物的生产工艺，使提取物中多肽提取率提升到原工艺的2‑4倍，核糖提取率提升到原工艺的1‑3倍。其抗肿瘤活性和提高免疫力活力分别提升了30%和60%，并且该提取物制剂在体内外均可以抑制肿瘤的生长并且可以逆转放化疗引起的免疫抑制现象，该提取物还可以双向调节人体的免疫力，维持免疫系统的正常工作。因此，小牛脾提取物可用于制备抗肿瘤活性和免疫调节作用的药物或者与化疗药物联用组成组合制剂。

Description

制备小牛脾提取物的方法及在抗肿瘤和免疫调节中的应用
技术领域：
本发明公开一种制备小牛脾提取物的方法，同时还公开了小牛脾提取物在抗肿瘤和免疫调节中的应用，属于生物制药技术领域。
技术背景：
小牛脾提取物是小牛脾提取物注射液的主要原料。目前，国内生产小牛脾提取物的制备方法是物理提取法。如中国发明专利(CN201010257796.0)所公开的方法：取乳牛的脾脏，用0.9％氯化钠溶液清洗，加入1～5倍量的生理盐水进行匀浆1～5次，胶体磨粒度为2～8μm；将匀浆液-10℃～-30℃深冻，达到完全冻结后，取出放入20℃～50℃以下水浴中解冻，完全融化后继续-10℃～-30℃条件下深冻，如此反复进行三次；将冻融后的药液60℃～100℃保温30～40分钟，速降温至10℃～20℃；将上述溶液离心，离心速度为3000～4000转/分，温度0～10℃以下，离心15～30分钟，收集上清液；分别用100000～50000道尔顿、10000～9000道尔顿、8000～5000道尔顿的膜超滤；0.20μm滤芯无菌过滤分装，即得提取物。但采用上述方法得到的提取物多肽和核糖含量较低，不能有效利用生物资源间接增加生产成本。而利用胰蛋白酶、菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的协同作用以及使用5'-磷酸二酯酶可以降低提取物中多肽分子量并显著增加多肽和核糖成分的含量。
5'-磷酸二酯酶它是一类可将核酸定向水解为5'-核苷酸的酶制剂,现多用于从细菌中提取核酸类物质以及分子生物学研究领域，本发明首次将5'-磷酸二酯酶应用于生物医药领域即从动物组织中同时提取多肽及核糖。
目前已经有研究表明小牛脾提取物无论是与化药联用或者单独使用在临床上都表现出抗肿瘤活性，但是其单独给药的抗肿瘤活性并不高，故小牛脾提取物至今多作为肿瘤放化疗的辅助治疗剂。
小牛脾提取物对小鼠的不同免疫状态的免疫调节方面鲜有研究。经过本发明研究内容证实，小牛脾提取物能显著增加正常小鼠腹腔巨噬细胞NO及TNF-α释放，小鼠脾脏T细胞和B细胞增殖能力比原工艺提高了60％。此外，小牛脾提取物在用环磷酰胺建立的小鼠免疫抑制模型中的治疗效果证明小牛脾提取物能够使低下的免疫功能恢复到正常水平，也能够改善免疫刺激状态，维持机体的自稳，显示出具有双向免疫调节作用。
发明内容：
本发明提供一种小牛脾提取物，使提取物中多肽提取率提升到原工艺的2～4倍，核糖提取率提升到原工艺的1～3倍。其抗肿瘤活性和提高免疫力活力分别提升了30％和60％，并且该提取物制剂在体内外均可以抑制肿瘤的生长并且可以逆转放化疗引起的免疫抑制现象。
本发明一种小牛脾提取物，是通过以下方法制备的：
1)取乳牛的脾脏500g，用0.9％氯化钠溶液清洗并浸泡12小时以去除血水并漂洗；
2)按照小牛脾重量加入1～1.2倍量的生理盐水进行匀浆1～5次，胶体磨粒度为2～8μm；
3)按照物料重量的0.7～2.0％加入组合蛋白酶,其中胰蛋白酶，菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的质量比为2～2.5：1.5～2.5：0.5～2，搅拌均匀并将匀浆液取出放入50℃以下水浴中升温至30℃～40℃保温30分钟；
4)按照物料重量的0.2～0.5％加入5’-磷酸二酯酶，搅拌均匀并将匀浆液放入90℃以下水浴中升温至60℃～70℃保温120分钟；
5)保温结束后迅速降温至10℃～20℃；
6)将上述溶液离心，离心速度为3000～4000转/分，温度0～5℃以下，离心10～20分钟，收集上清液；
7)分别用100000～50000道尔顿、10000～9000道尔顿、8000～5000道尔顿的膜超滤；
8)0.20μm滤芯无菌过滤分装，即得提取物；
其中所述的组合蛋白酶为胰蛋白酶、菠萝蛋白酶和胃蛋白酶混合物，所述组合蛋白酶的质量比为：胰蛋白酶2～2.5份，菠萝蛋白酶1.5～2.5份，胃蛋白酶0.5～2份。
本发明所述的小牛脾提取物可在制备调节机体免疫功能的药物中的用途。
本发明改进现有的小牛脾提取物的提取工艺及参数，利用组合蛋白酶的协同作用与5'-磷酸二酯酶联合作用不仅大大提高产品中多肽和核糖的提取率还使所得提取物的抗肿瘤活性和免疫调节功能显著增强；制备的小牛脾提取物中含21～35重量份多肽、1～2重量份核糖，显著提升原材料的利用度、增加产品收率、提高产品的质量标准。
发明的有益效果在于：利用组合蛋白酶的协同作用和5'-磷酸二酯酶酶解法处理小牛脾提取物中间品，能够增加小牛脾提取物中多肽和核糖的收率，其中多肽含量较原工艺提升了216.5～378.6％，核糖浓度提升了96.6～296.9％，提高原材料的利用率即增加产品收率，降低生产成本；提取物的抗肿瘤活性较原工艺提高了30％；提高该小牛脾提取物的免疫调节活力，尤其是在提高免疫力方面，采用组合蛋白酶协同酶解法比物理法得到提取物其提高免疫力的活力提高了60％；提高药品的质量标准。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。其中对照例1和对照例2再现专利CN201010257796.0的制备方法。
实施例1：
取乳牛的脾脏(出生24小时以内)500g，用0.9％氯化钠溶液清洗并浸泡12小时以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1倍量的生理盐水进行匀浆1次，胶体磨粒度为2～8μm；加入组合蛋白酶加入胰蛋白酶3.57g，菠萝蛋白酶3.57g，胃蛋白酶2.86g份，搅拌均匀并将匀浆液取出放入50℃以下水浴中升温至30℃保温30分钟；加入1g的5'-磷酸二酯酶，搅拌均匀并将匀浆液放入90℃以下水浴中升温至60℃保温120分钟；保温结束后迅速降温至10℃；将上述溶液离心，离心速度为3000～4000转/分，温度0～5℃以下，离心20分钟，收集上清液；分别用100000～50000道尔顿、10000～9000道尔顿、8000～5000道尔顿的膜超滤；0.20μm滤芯无菌过滤分装，即得提取物。
实施例2：
取乳牛的脾脏(出生24小时以内)500g，用0.9％氯化钠溶液清洗并浸泡12小时以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1.2倍量的生理盐水进行匀浆5次，胶体磨粒度为2～8μm；加入胰蛋白酶1.75g份，菠萝蛋白酶1.31g份，胃蛋白酶0.44g份，搅拌均匀并将匀浆液取出放入50℃以下水浴中升温至40℃保温30分钟；加入2.5g的5'-磷酸二酯酶，搅拌均匀并将匀浆液放入90℃以下水浴中升温至70℃保温120分钟；保温结束后迅速降温至20℃；将上述溶液离心，离心速度为3000～4000转/分，温度0～5℃以下，离心10分钟，收集上清液；分别用100000～50000道尔顿、10000～9000道尔顿、8000～5000道尔顿的膜超滤；0.20μm滤芯无菌过滤分装，即得提取物。
实施例3：
取乳牛的脾脏(出生24小时以内)500g，用0.9％氯化钠溶液清洗并浸泡12小时以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1～1.2倍量的生理盐水进行匀浆3次，胶体磨粒度为2～8μm；加入胰蛋白酶2g份，菠萝蛋白酶1.5g，胃蛋白酶2g份，搅拌均匀并将匀浆液取出放入50℃以下水浴中升温至40℃保温30分钟；加入1.9g的5'-磷酸二酯酶，搅拌均匀并将匀浆液放入90℃以下水浴中升温至65℃保温120分钟；保温结束后迅速降温至15℃；将上述溶液离心，离心速度为3000～4000转/分，温度0～5℃以下，离心20分钟，收集上清液；分别用100000～50000道尔顿、10000～9000道尔顿、8000～5000道尔顿的膜超滤；0.20μm滤芯无菌过滤分装，即得提取物。
对照例1：
取乳牛的脾脏(出生24小时以内)500g，除去结缔组织和脂肪，用0.9％氯化钠溶液清洗，加入3倍量的生理盐水进行匀浆，一般进行3次，胶体磨粒度为4μm；将匀浆液放入冰库-20℃深冻，达到完全冻结后，取出放入30℃以下水浴中解冻，完全融化后继续放入冰库，如此反复进行三次；将冻融后的药液70℃保温35分钟，速降温至15℃；将上述溶液离心，离心速度为3500转/分，温度5℃以下，离心20分钟，收集上清液；分别用80000道尔顿、10000道尔顿、7000道尔顿的膜超滤；0.20μm滤芯无菌过滤分装，即得注射液。
对照例2：
取乳牛的脾脏(出生24小时以内)500g，除去结缔组织和脂肪，用0.9％氯化钠溶液清洗，加入4倍量的生理盐水进行匀浆，一般进行5次，胶体磨粒度为3μm；将匀浆液放入冰库-30℃深冻，达到完全冻结后，取出放入40℃以下水浴中解冻，完全融化后继续放入冰库，如此反复进行三次；将冻融后的药液80℃保温40分钟，速降温至20℃；将上述溶液离心，离心速度为3000转/分，温度4℃以下，离心30分钟，收集上清液；分别用60000道尔顿、9000道尔顿、6000道尔顿的膜超滤；0.20μm滤芯无菌过滤分装，即得提取物。
以上实施例得到的提取物中各成分含量由表1体现。
表1不同解法各种提取方法的提取结果
说明：胰蛋白酶组、菠萝蛋白酶组、胃蛋白组和5'-磷酸二酯酶组中的加酶量均为工艺参数中的最大量。
结论：本发明工艺利用组合蛋白酶的协同作用与5'-磷酸二酯酶联合使用，大大提高了核酸、多肽各有效成分的浓度，其中多肽浓度提升了216.5～378.6％，核糖浓度提升了96.6～296.9％。该结果说明组合蛋白酶中的胰蛋白酶、菠萝蛋白酶和胃蛋白酶三者协同作用可以显著提高提取物中多肽浓度，再加上5'-磷酸二酯酶可以显著提高提取物中核糖浓度。
下述实验用于进一步说明本发明小牛脾提取物的药理活性：
1.小牛脾提取物抗肿瘤活性的研究
为了进一步证明本发明小牛脾提取物(以下简称：小牛脾提取物)具有治疗肿瘤的作用，以下结合对小牛脾提取物进行系统的药效实验进行详细说明。
本发明实验中将选取一个典型肿瘤模型：肝癌细胞进行体外及体内的小牛脾提取物活性。
1.1小牛脾提取物对癌症细胞存活率的影响
1.1.1利用MTT实验考察小牛脾提取物对肝癌细胞PLC/PRF/5存活率的影响。
1.1.1.1细胞培养
PLC/PRF/5、MCF-7和GH3细胞培养在含体积分数为10％胎牛血清和1％双抗的1640培养基中,培养条件为体积分数为5％CO2,37℃、饱和湿度,2天换液1次,4d传代1次。取对数生长期细胞0.5×105/ml,接种于96孔板,进行实验。显微镜下观察加药后细胞生长情况。于24小时后将培养瓶中的细胞经消化、洗涤、离心,制成单细胞悬液,做细胞凋亡及周期分布检测。实验至少重复两次。实验分组:空白对照组、对照例1组、阳性对照组、提取物(实施例1)的高、中、低剂量组，其中对照例1组药物浓度为5mg/ml阳性对照药环磷酰胺终浓度为4mmol/L,提取物(实施例1)的高、中、低剂量组药物中浓度分别为2mg/ml、5mg/ml和12.5mg/ml。
1.1.1.2MTT法测定细胞活力
取上述培养96孔板,每孔中加入终浓度为5mg/ml的MTT 100μl,培育4小时。吸出培养液,加入等量(100μl)二甲基亚砜振荡10分钟,使其充分溶解,然后在分光光度计下于570nm处测定吸光度A值。按照如下公式计算细胞生长抑制率:
抑制率(％)＝(空白对照组A值－用药组A值)/空白对照组A值×100％。
表2 MTT法检测细胞生长抑制率结果 (％，x±s)
阳性对照组比较:*表示P<0.05。
根据表1可知，小牛脾提取物能够抑制肝癌细胞PLC/PRF/5的增长，而中、高剂量能够明显抑制癌细胞的生长并且其抑制效果基本达到环磷酰胺的水平。同时,证明了小牛脾提取物对肿瘤细胞生长的抑制作用有剂量依赖性。值得注意的是，小牛脾提取物高剂量组较对照例1的抗癌细胞活力的效果增加了30％。
1.1.2Hochest33258染色观察癌细胞的形态学变化
PLC/PRF/5细胞培养方法和分组与1.2.1一致,将细胞铺在6孔板中培养,然后将细胞培养板放置在C02孵箱中进行培养。培养24小时后更换新鲜的细胞培养液,然后再加入生理盐水(阴性对照)、对照例1、环磷酰胺、小牛脾提取物的高、中、低剂量进行处理。继续培养48小时弃掉六孔板中的细胞培养液,用PBS洗两遍,加入4％多聚甲醛放置在4℃中对细胞进行固定,十五分钟后弃掉固定液用PBS将细胞洗两遍,加1mL浓度为5mg/mL的Hoechst 33258染液,在常温下放置10分钟,弃掉染液用PBS洗两次,置于倒置荧光显微镜观察处理后的PLC/PRF/5细胞发生的形态变化并拍照。
实验结果显示，阴性对照组的细胞在形态上没有发生比较明显的变化,细胞还是呈现出正常的圆形或者椭圆形状态,与阴性对照组相比小牛脾提取物高、中、低三个加药组和阳性对照的细胞在形态上都发生了比较明显的变化,有的呈现出不规则的细胞形态,有的细胞发生了明显的皱缩,甚至有的细胞还形成一些絮状的凋亡小体和细胞碎片,还出现了一部分的死细胞。最为明显的是小牛脾提取物高剂量组和阳性对照组作用后细胞形态发生的变化。这说明小牛脾提取物能够使PLC/PRF/5肿瘤细胞的形态发生变化,甚至使肿瘤细胞凋亡。
1.2流式细胞术检测PLC/PRF/5细胞的凋亡情况
取1.1给药消化后的细胞，根据Aimexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒上的说明进行实验操作,利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
实验结果显示，不同浓度的小牛脾提取物处理PLC/PRF/5肿瘤细胞48小时后细胞凋亡的情况。可以看出,当浓度为高剂量小牛脾提取物作用于肿瘤细胞48小时后,与阴性对照组相比,阴性对照组有95.88％的细胞处于正常状态,有1.30％的细胞处于早期凋亡阶段,而高、中、低剂量这三个药物组分别有15.17％，23.46％和36.62％的细胞进入早期凋亡状态,与对照组相比药物组诱导细胞凋亡的现象很明显。小牛脾提取物诱导肿瘤细胞凋亡的能力接近于阳性药物环磷酰胺所引起的40.12％的早期凋亡率。可以看出小牛脾提取物能够诱导肿瘤细胞凋亡。
2.小牛脾提取物对正常小鼠的免疫调节作用
2.1动物处理
6周龄BALB/c小鼠，雌雄各半，将48只小鼠按体重随机分为5组，雄性，分组饲养。5组分别为空白对照组、对照例1组、小牛脾提取物(实施实例1)低剂量给药组、中剂量给药组和高剂量给药组。各实验组给药方式：(1)空白对照组：连续14日尾静脉注射，生理盐水；(2)对照例1组：连续14日尾静脉注射(3)低剂量给药组：连续14日尾静脉注射，1.3ml/Kg的小牛脾提取物；(4)中剂量给药组：连续14日尾静脉注射，3.25ml/Kg的小牛脾提取物；(5)高剂量给药组：连续14天尾静脉注射，6.5ml/Kg的小牛脾提取物。
2.2BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞NO及TNF-α释放测定
BALB/c小鼠用乙醚麻醉后，向腹腔注入5ml无菌PBS，按摩腹部2分钟后抽出腹腔洗液，3000转/分离心10分钟，用RPMI-1640(含10％FBS，50M 2-巯基乙醇，100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素)培养2小时后，PBS洗去未贴壁细胞，小心收集贴壁细胞。小牛脾提取物处理腹腔巨噬细胞后，测定NO及TNF-α释放。
2.3BALB/c小鼠脾脏T细胞和B细胞增殖能力的测定方法
BALB/c小鼠取血后处死,于无菌环境中取出脾脏，置于4℃EBSS中，用5ml注射器尾捻磨成细胞悬液，并用吸管吹打数次，过40μm筛网。1200转/分离心10分钟，用RPMI-1640(含5％FBS，50μM 2-巯基乙醇，100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素)制成单细胞悬液。稳定后的小鼠脾脏细胞每孔加入小牛脾提取物,对照组给予空白培养液，细胞培养箱中孵育72小时后，MTT法测细胞存活率。
2.4统计学处理所用的数据均用表示，统计学分析用t检验。
2.5结果
2.5.1巨噬细胞NO及TNF-α的释放
TNF-α是炎症反应过程中最早和初级内源性介质，NO是一种生物信使分子，其生成依赖于诱导型一氧化氮合酶，在抵抗入侵的细菌、真菌等微生物及在炎症反应中起着十分重要的作用。由表1可知，TNF-α水平，与对照组相比差异显著(P＜0.05)，而且NO含量也随着给药剂量增加而有上升趋势。该结果证明，小牛脾提取物能够增加机体内NO和TNF-α的释放从而提高机体的免疫水平。
表3小牛脾提取物对巨噬细胞NO及TNF-α释放的影响
*与空白对照组相比，P<0.05。
由表2可知，相对于对照例1，小牛脾提取物处理小鼠后其巨噬细胞释放的NO以及TNF-α浓度显著增加，与MTT结果一致的是随着给药剂量的增加其释放量也增加。
2.5.2T细胞和B细胞增值能力测定结果
T细胞和B细胞增值能力可作为机体体液免疫和细胞免疫水平的初步评价指标。
表4小牛脾提取物对T细胞和B细胞增值能力的影响
*与空白对照组相比，P<0.01。
由表3可知，小牛脾提取物能够提升正常小鼠的T细胞和B细胞的增殖能力。其中，高剂量组和中剂量组的作用更加明显。其中，高剂量组将机体体液免疫水平提高了60％。说明在适当的范围内增加注射剂量能够显著地提升机体的体液免疫和细胞免疫水平。
3.小牛脾提取物对免疫低下小鼠的免疫调节作用
BALB/c小鼠共分为5组，分别为空白对照组、模型组、小牛脾提取物(实施例1)低、中、高剂量组，每组20只小鼠。(1)空白对照组，给予生理盐水，每日1次。(2)模型组，第1-3日给予环磷酰胺注射液(CY)50mg/kg，第4-14日给予生理盐水，每日1次。(3)小牛脾注提取物组，第1-3日给予环磷酰胺注射液50mg/kg，第4-14日给予低、中、高剂量小牛脾提取物，每日1次，尾静脉注射。结果共监测14天。
3.1.试验方法
3.1.1白细胞计数
各组小鼠尾静脉血用于动物血液分析仪进行白细胞计数。
3.1.2胸腺和脾脏指数测定
末次给药后次日,用电子天平精确称取小鼠体重,眼球取血后处死,取胸腺和脾脏称重,并计算胸腺和脾脏指数。按如下公式计算:胸腺指数或脾脏指数＝胸腺或脾脏质量(mg)/体重(g)。
3.2统计学处理所用的数据均用表示，统计学分析用t检验。
3.3结果
3.3.1白细胞计数结果
白细胞，或称白血球，白血球作为免疫系统的一部分帮助身体抵抗传染病以及外来的东西，是血液中一种重要的血细胞。
表5小牛脾提取物对白细胞数量的影响
*与环磷酰胺组相比，P<0.05。
CY注射4天后在对照组的外周血白细胞8.63×109/L，而其他四组的白细胞分别减少67％，66％，72％，69％和71％。白细胞数在14天后高剂量组返回到正常水平(与CY组比，P<0.05)。这些结果表明，小牛脾提取物可以缓解免疫抑制小鼠外周血白细胞数的衰减现象。
3.3.2胸腺和脾脏指数测定结果
表6各组胸腺指数和脾脏指数
*与环磷酰胺组相比，P<0.10；**与环磷酰胺组相比，P<0.05；***与环磷酰胺组相比，P<0.01。
胸腺指数和脾脏指数是反映机体免疫功能的最基本最常规的指标。由表6可知，从免疫器官指数方面来看，小牛脾提取物对免疫力正常小鼠的胸腺、脾脏指数有一定的提高作用，并且这种作用随着给药剂量的增加而增加。因此，初步证明小牛脾提取物在一定程度上能够提高小鼠的免疫状态，维持免疫功能于平稳状态。

Claims (1)

1.一种小牛脾提取物，是通过以下方法制备的：
1）取乳牛的脾脏500g，用0.9％氯化钠溶液清洗并浸泡12小时以去除血水并漂洗；
2）按照小牛脾重量加入1～1.2倍量的生理盐水进行匀浆1～5次，胶体磨粒度为2～8μm；
3）按照物料重量的0.7～2.0%加入组合蛋白酶,其中胰蛋白酶，菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的质量比为2～2.5：1.5～2.5：0.5～2，搅拌均匀并将匀浆液取出放入50℃以下水浴中升温至30℃～40℃保温30分钟；
4）按照物料重量的0.2～0.5%加入5’-磷酸二酯酶，搅拌均匀并将匀浆液放入90℃以下水浴中升温至60℃～70℃保温120分钟；
5）保温结束后迅速降温至10℃～20℃ ；
6）将上述溶液离心，离心速度为3000-4000转/分，温度 0～5℃以下，离心10～20分钟，收集上清液；
7）分别用100000～50000道尔顿、10000～9000道尔顿、8000～5000道尔顿的膜超滤；
8）0.20μm滤芯无菌过滤分装，即得提取物；
其中所述的组合蛋白酶为胰蛋白酶、菠萝蛋白酶和胃蛋白酶混合物，所述组合蛋白酶的质量比为：胰蛋白酶2～2.5份，菠萝蛋白酶1.5～2.5份，胃蛋白酶0.5～2份。
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