CN108567798B - 喙尾琵琶甲有效部位及其制备方法和一种免疫调节剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种喙尾琵琶甲有效部位的制备方法。本发明采用多种萃取剂对喙尾琵琶甲粉末进行萃取，得到的喙尾琵琶甲有效部位具有优异的免疫调节功能，并经实验证实其可应用于制备免疫调节剂，具有潜在的社会效益和经济效益。此外，本发明从药用昆虫喙尾琵琶甲中提取分离制备得到的喙尾琵琶甲有效部位，其原料来源方便易得、制备步骤简便、利于产业化。

Description

喙尾琵琶甲有效部位及其制备方法和一种免疫调节剂

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种喙尾琵琶甲有效部位及其制备方法和一种免疫调节剂。

背景技术

喙尾琵琶甲(Blaps rynchopetera Fairmaire)俗称臭壳子、小黑虫、臭屁虫、高脚虫、高脚臭虫、打屁虫、臭虫等，成虫能分泌具有药用价值的防御液(即臭屁)。喙尾琵琶甲是云南彝族长期广泛使用的昆虫药物(彝族药名音译为“寒斋”)，用于热证发烧、饮食积滞、小儿疳积、夜惊、乳癖、乳痰、疮痒肿毒、湿疹、皮肤瘙痒等。据调查，彝族民间医生在治疗肿瘤、心血管等疑难病症的处方中，80％以上都含有该昆虫药。该昆虫除了药用外，云南大部分地区还作为食用佳肴，可在农贸市场和药材市场购买到。因此，喙尾琵琶甲是一种极具开发和利用价值的民族民间药用昆虫。

与其民间应用不相匹配的是，目前对喙尾琵琶甲的药学和临床应用方面的研究报道非常少。除本专利发明人前期对其粗提物的抗肿瘤、抗菌、抗氧化作用进行了初步研究，尚未见其它关于喙尾琵琶甲提取物及其用途的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种喙尾琵琶甲有效部位及其制备方法和一种免疫调节剂，本发明提供的喙尾琵琶甲有效部位具有优异的免疫调节功能。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种喙尾琵琶甲有效部位的制备方法，包括以下步骤：

(1)将喙尾琵琶甲依次进行干燥和粉碎，得到喙尾琵琶甲粉末；

(2)采用体积分数为[90％,100％)的乙醇溶液或无水乙醇对所述步骤(1)中喙尾琵琶甲粉末进行第一提取，得到第一提取液和第一滤渣；

采用体积分数为80～90％的乙醇溶液对所述第一滤渣进行第二提取，得到第二提取液和第二滤渣；

采用体积分数为70～80％的乙醇溶液对所述第二滤渣进行第三提取，得到第三提取液和第三滤渣；

将所述第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，得到乙醇提取液；

(3)将所述步骤(2)中乙醇提取液进行减压浓缩，得到总提取物浓缩液；

(4)采用低极性有机萃取剂对所述步骤(3)中总提取物浓缩液进行萃取脱脂处理，得到脱脂母液；所述低极性有机萃取剂包括石油醚、环己烷或重蒸汽油；

(5)采用乙酸乙酯对所述步骤(4)中脱脂母液进行萃取，得到乙酸乙酯萃取液；

(6)减压浓缩去除所述步骤(5)中乙酸乙酯萃取液中的溶剂，得到喙尾琵琶甲有效部位。

优选地，所述步骤(2)中第一提取、第二提取和第三提取的料液比独立地为1：(3～5)。

优选地，所述步骤(3)中减压浓缩在45～55℃条件下进行，所述减压浓缩是使所得浓缩液的体积为所述乙醇提取液体积的8～12％。

优选地，所述步骤(4)中萃取脱脂处理重复进行三次，每次萃取脱脂处理的料液比独立为1：(0.8～1.2)。

优选地，所述步骤(5)中萃取重复进行三次，每次萃取的料液比独立为1：(0.8～1.2)。

优选地，所述步骤(6)中减压浓缩在50～55℃条件下进行。

本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的喙尾琵琶甲有效部位。

本发明提供了一种免疫调节剂，包括辅料和上述技术方案所述喙尾琵琶甲有效部位。

优选地，所述喙尾琵琶甲有效部位在免疫调节剂中的质量含量为0.01～99.9％。

优选地，所述辅料包括食用辅料或药用辅料。

本发明提供了一种喙尾琵琶甲有效部位的制备方法。本发明采用多种萃取剂对喙尾琵琶甲粉末进行萃取，得到的喙尾琵琶甲有效部位具有优异的免疫调节功能，并经实验证实其可应用于制备免疫调节剂，具有潜在的社会效益和经济效益。此外，本发明从药用昆虫喙尾琵琶甲中提取分离制备得到的喙尾琵琶甲有效部位，其原料来源方便易得、制备步骤简便、利于产业化。

具体实施方式

本发明提供了一种喙尾琵琶甲有效部位的制备方法，包括以下步骤：

(1)将喙尾琵琶甲依次进行干燥和粉碎，得到喙尾琵琶甲粉末；

(2)采用体积分数为[90％,100％)的乙醇溶液或无水乙醇对所述步骤(1)中喙尾琵琶甲粉末进行第一提取，得到第一提取液和第一滤渣；

采用体积分数为80～90％的乙醇溶液对所述第一滤渣进行第二提取，得到第二提取液和第二滤渣；

采用体积分数为70～80％的乙醇溶液对所述第二滤渣进行第三提取，得到第三提取液和第三滤渣；

将所述第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，得到乙醇提取液；

(3)将所述步骤(2)中乙醇提取液进行减压浓缩，得到总提取物浓缩液；

(4)采用低极性有机萃取剂对所述步骤(3)中总提取物浓缩液进行萃取脱脂处理，得到脱脂母液；所述低极性有机萃取剂包括石油醚、环己烷或重蒸汽油；

(5)采用乙酸乙酯对所述步骤(4)中脱脂母液进行萃取，得到乙酸乙酯萃取液；

(6)减压浓缩去除所述步骤(5)中乙酸乙酯萃取液中的溶剂，得到喙尾琵琶甲有效部位。

本发明将喙尾琵琶甲依次进行干燥和粉碎，得到喙尾琵琶甲粉末。在本发明中，所述喙尾琵琶甲优选为喙尾琵琶甲成虫。本发明优选是将鲜活的喙尾琵琶甲成虫置于带盖容器中，加入少量乙醇密闭处死，待乙醇挥尽后，将喙尾琵琶甲虫体依次进行干燥和粉碎，得到喙尾琵琶甲粉末。在本发明中，所述干燥的温度优选为45～55℃，更优选为50℃；本发明对于所述干燥的时间没有特殊的限定，将所述喙尾琵琶甲虫体干燥至恒重即可。在本发明中，所述粉碎优选是将干燥后的喙尾琵琶甲粉碎至能够通过20目筛即可。

得到喙尾琵琶甲粉末后，本发明采用体积分数为[90％,100％)的乙醇溶液或无水乙醇对所述喙尾琵琶甲粉末进行第一提取，得到第一提取液和第一滤渣；采用体积分数为80～90％的乙醇溶液对所述第一滤渣进行第二提取，得到第二提取液和第二滤渣；采用体积分数为70～80％的乙醇溶液对所述第二滤渣进行第三提取，得到第三提取液和第三滤渣；将所述第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，得到乙醇提取液。在本发明中，所述第一提取、第二提取和第三提取的料液比独立地优选为1：(3～5)，更优选为1：4。

在本发明中，所述第一提取、第二提取和第三提取优选是通过浸泡实现，具体的，是将述喙尾琵琶甲粉末浸泡在体积分数为[90％,100％)的乙醇溶液或无水乙醇中进行第一提取，将所述第一滤渣浸泡在体积分数为80～90％的乙醇溶液中进行第二提取，将所述第二滤渣浸泡在体积分数为70～80％的乙醇溶液中进行第三提取。在本发明中，所述第一提取的时间优选为40～50h，所述第二提取的时间优选为20～25h，所述第三提取的时间优选为20～25h。在本发明中，所述第一提取、第二提取和第三提取的温度独立地优选为15～40℃，更优选为20～30℃；在本发明的实施例中，所述第一提取、第二提取和第三提取具体是在室温下进行，即不需要额外的加热或降温。

本发明对于每次提取后所得体系中提取液和滤渣分离的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离的技术方案即可；本发明优选将提取后所得体系依次进行纱布过滤和滤纸过滤，实现提取液和滤渣的分离。本发明对于所述纱布过滤所采用的纱布没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的纱布即可。在本发明中，所述滤纸过滤所采用的滤纸优选为孔径为20～25μm的定性滤纸；所述滤纸过滤优选为常压过滤或负压过滤。

本发明采用不同浓度的溶剂进行萃取，是为了获得喙尾琵琶甲虫体中的不同极性组分，并提高提取率(溶剂中增加水的比例，可提高极性组分的提取率)。

得到乙醇提取液后，本发明优选将所述乙醇提取液进行减压浓缩，得到总提取物浓缩液。在本发明中，为了最大限度的保留喙尾琵琶甲虫体中有效成分，同时保证减压浓缩效率，所述减压浓缩优选在45～55℃条件下进行；所述减压浓缩优选是使所得浓缩液的体积为所述乙醇提取液体积的8～12％，更优选为10％。

本发明通过减压浓缩去除所述乙醇提取液中大部分乙醇，以便于将所得总提取物浓缩液进行后续萃取。

得到总提取物浓缩液后，本发明采用低极性有机萃取剂对所述总提取物浓缩液进行萃取脱脂处理，得到脱脂母液；所述低极性有机萃取剂包括石油醚、环己烷或重蒸汽油。在本发明中，所述萃取脱脂处理优选重复进行三次，每次萃取脱脂处理的料液比独立地优选为1：(0.8～1.2)，更优选为1：1。

本发明对于每次萃取脱脂处理后所得体系中脂溶性低极性萃取液和脱脂母液分离的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的液液分离的技术方案即可；本发明优选是在分液漏斗中进行所述萃取脱脂处理，进而实现所述脂溶性低极性萃取液和脱脂母液的分离。

本发明采用低极性有机萃取剂对所述总提取物浓缩液进行萃取脱脂处理，能够去除所述总提取物浓缩液中脂溶性低极性组分。

得到脱脂母液后，本发明采用乙酸乙酯对所述脱脂母液进行萃取，得到乙酸乙酯萃取液。在本发明中，所述萃取优选重复进行三次，每次萃取的料液比独立地优选为1：(0.8～1.2)，更优选为1：1。本发明优选将三次萃取后所得乙酸乙酯萃取液合并，然后进行后续减压浓缩处理。

本发明对于每次萃取后所得体系中乙酸乙酯萃取液和萃取母液分离的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的液液分离的技术方案即可；本发明优选是在分液漏斗中进行所述萃取，进而实现所述乙酸乙酯萃取液和萃取母液的分离。

本发明采用乙酸乙酯对低极性有机萃取剂萃取后所得萃取母液进行萃取，能够得到中等极性、富含有效成分的乙酸乙酯萃取液。

得到乙酸乙酯萃取液后，本发明通过减压浓缩去除所述乙酸乙酯萃取液中的溶剂，得到喙尾琵琶甲有效部位。在本发明中，为了最大限度的保留喙尾琵琶甲虫体中有效成分，同时保证减压浓缩效率，所述减压浓缩优选在50～55℃条件下进行。

本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的喙尾琵琶甲有效部位，本发明提供的喙尾琵琶甲有效部位富含多酚类化合物，具有优异的免疫调节功能。

本发明提供了一种免疫调节剂，包括辅料和上述技术方案所述喙尾琵琶甲有效部位。在本发明中，所述喙尾琵琶甲有效部位在所述免疫调节剂中的质量含量优选为0.01～99.9％，更优选为1～80％，进一步优选为10～60％，更进一步优选为20～40％。在本发明中，所述辅料优选包括食用辅料或药用辅料。本发明对于所述食用辅料或药用辅料的种类没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的食用辅料或药用辅料即可，具体如淀粉、硬脂酸镁、微晶纤维素、聚乙烯醇或聚乙二醇。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)将鲜活的喙尾琵琶甲成虫置于带盖容器中，加入少量乙醇密闭处死，待乙醇挥尽后，将喙尾琵琶甲虫体在45℃条件下进行干燥后粉碎，过20目筛，得到筛下部分喙尾琵琶甲粉末；

(2)准确称取1kg喙尾琵琶甲粉末与5kg体积分数为95％的乙醇溶液混合，室温下浸泡48h后，依次用纱布和孔径为20～25μm定性滤纸过滤，得到第一提取液和第一滤渣；将所述第一滤渣与4kg体积分数为85％的乙醇溶液混合，室温下浸泡24h后，依次用纱布和孔径为20～25μm定性滤纸过滤，得到第二提取液和第二滤渣；将所述第二滤渣与4kg体积分数为75％的乙醇溶液混合，室温下浸泡24h后，依次用纱布和孔径为20～25μm定性滤纸过滤，得到第三提取液和第三滤渣；将所述第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，得到乙醇提取液；

(3)在50℃条件下，将所述乙醇提取液减压浓缩至体积为1L，得到总提取物浓缩液；

(4)将所述总提取物浓缩液转移至2.5L分液漏斗中，加入1倍体积的石油醚进行萃取脱脂处理，静置分层，弃去脂溶性低极性萃取液，向剩余物中继续加入1倍体积的石油醚进行萃取脱脂处理，共进行萃取脱脂处理三次，弃去脂溶性低极性萃取液，得到脱脂母液；

(5)向所述脱脂母液中加入1倍体积的乙酸乙酯进行萃取，静置分层，分出乙酸乙酯萃取液，向剩余物中继续加入1倍体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取三次，合并所得乙酸乙酯萃取液；

(6)在50℃条件下，将所述乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得到喙尾琵琶甲有效部位63.2g，得率为6.3％。

实施例2

(1)将鲜活的喙尾琵琶甲成虫置于带盖容器中，加入少量乙醇密闭处死，待乙醇挥尽后，将喙尾琵琶甲虫体在45℃条件下进行干燥后粉碎，过20目筛，得到筛下部分喙尾琵琶甲粉末；

(2)准确称取1kg喙尾琵琶甲粉末与5kg体积分数为90％的乙醇溶液混合，室温下浸泡48h后，依次用纱布和孔径为20～25μm定性滤纸过滤，得到第一提取液和第一滤渣；将所述第一滤渣与4kg体积分数为80％的乙醇溶液混合，室温下浸泡24h后，依次用纱布和孔径为20～25μm定性滤纸过滤，得到第二提取液和第二滤渣；将所述第二滤渣与4kg体积分数为70％的乙醇溶液混合，室温下浸泡24h后，依次用纱布和孔径为20～25μm定性滤纸过滤，得到第三提取液和第三滤渣；将所述第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，得到乙醇提取液；

(3)在52℃条件下，将所述乙醇提取液减压浓缩至体积为1L，得到总提取物浓缩液；

(4)将所述总提取物浓缩液转移至2.5L分液漏斗中，加入1倍体积的石油醚进行萃取脱脂处理，静置分层，弃去脂溶性低极性萃取液，向剩余物中继续加入1倍体积的石油醚进行萃取脱脂处理，共进行萃取脱脂处理三次，弃去脂溶性低极性萃取液，得到脱脂母液；

(5)向所述脱脂母液中加入1倍体积的乙酸乙酯进行萃取，静置分层，分出乙酸乙酯萃取液，向剩余物中继续加入1倍体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取三次，合并所得乙酸乙酯萃取液；

(6)在52℃条件下，将所述乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得到喙尾琵琶甲有效部位66.8g，得率为6.7％。

实施例3

(1)将鲜活的喙尾琵琶甲成虫置于带盖容器中，加入少量乙醇密闭处死，待乙醇挥尽后，将喙尾琵琶甲虫体在45℃条件下进行干燥后粉碎，过20目筛，得到筛下部分喙尾琵琶甲粉末；

(2)准确称取5kg喙尾琵琶甲粉末与20kg体积分数为95％的乙醇溶液混合，室温下浸泡48h后，依次用纱布和孔径为20～25μm定性滤纸过滤，得到第一提取液和第一滤渣；将所述第一滤渣与15kg体积分数为85％的乙醇溶液混合，室温下浸泡24h后，依次用纱布和孔径为20～25μm定性滤纸过滤，得到第二提取液和第二滤渣；将所述第二滤渣与15kg体积分数为75％的乙醇溶液混合，室温下浸泡24h后，依次用纱布和孔径为20～25μm定性滤纸过滤，得到第三提取液和第三滤渣；将所述第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，得到乙醇提取液；

(3)在55℃条件下，将所述乙醇提取液减压浓缩至体积为3L，得到总提取物浓缩液；

(4)将所述总提取物浓缩液转移至10L分液漏斗中，加入1倍体积的石油醚进行萃取脱脂处理，静置分层，弃去脂溶性低极性萃取液，向剩余物中继续加入1倍体积的石油醚进行萃取脱脂处理，共进行萃取脱脂处理三次，弃去脂溶性低极性萃取液，得到脱脂母液；

(5)向所述脱脂母液中加入1倍体积的乙酸乙酯进行萃取，静置分层，分出乙酸乙酯萃取液，向剩余物中继续加入1倍体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取三次，合并所得乙酸乙酯萃取液；

(6)在55℃条件下，将所述乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得到喙尾琵琶甲有效部位316g，得率为6.3％。

实施例4

实施例1制备的喙尾琵琶甲有效部位中富含多酚类化合物，对所述喙尾琵琶甲有效部位中组分及其含量进行分析，具体如下：

1、喙尾琵琶甲有效部位中主要多酚类化合物

通过系统的分离鉴定，从所述喙尾琵琶甲有效部位共获得50多个单体化合物，其中含有邻二酚羟基或对二酚羟基的多酚类化合物共30多个，主要化合物结构如下：

2、喙尾琵琶甲总提取物及喙尾琵琶甲有效部位中多酚含量测定

以没食子酸(gallic acid)作为对照品，采用Folin-Phenol比色法分别对喙尾琵琶甲总提取物(实施例1中所述乙醇提取液经减压浓缩后所得提取物)和喙尾琵琶甲有效部位中的多酚类物质含量进行测定。

(1)喙尾琵琶甲总提取物样品溶液的配制

精密称取喙尾琵琶甲总提取物样品250.0mg，用无水乙醇定容于25mL量瓶中，得喙尾琵琶甲总提取物样品溶液。

(2)喙尾琵琶甲有效部位样品溶液的配制

精密称取喙尾琵琶甲有效部位样品25.0mg，用无水乙醇定容于25mL量瓶中，得喙尾琵琶甲有效部位样品溶液。

(3)对照品溶液的配制

精密称取对照品没食子酸6.0mg，用无水乙醇定容于25mL量瓶中，得对照品溶液。

(4)吸光度值测定

精密移取所配制的喙尾琵琶甲总提取物样品溶液、喙尾琵琶甲有效部位样品溶液、对照品溶液及无水乙醇各1mL，准确加入5.0mL 10％的Folin-phenol试剂，反应5min，准确加入质量浓度为7.5％的Na₂CO₃溶液4mL，摇匀；室温放置1h，以无水乙醇加Folin-phenol试剂作空白对照，于765nm波长下测定吸光度值(A)。

(5)多酚含量测定

采用国家标准GB/T8313-2008中的Folin-phenol法，精密量取所配制的喙尾琵琶甲总提取物样品溶液及喙尾琵琶甲有效部位样品溶液，按照步骤(4)的操作，根据下式计算多酚含量(％)。

式中：A为吸光度；b为标准方程截距；V为样品溶液体积；d为稀释倍数；K为方程斜率；m为样品质量。

喙尾琵琶甲总提取物和喙尾琵琶甲有效部位中的多酚含量测定结果见表1，由表1可知，喙尾琵琶甲有效部位中的多酚含量达40.2％。

表1喙尾琵琶甲虫体总提取物及乙酸乙酯有效部位多酚含量(％，n＝3)

实施例5喙尾琵琶甲有效部位对巨噬细胞吞噬能力的影响

1、实验原理：

免疫是机体识别和排除抗原性异物、以维护自身生理平衡和稳定的一种保护性反应，包括非特异性免疫和特异性免疫。巨噬细胞是造血系统中最具可塑性的细胞，广泛存在于所有组织中，表现出巨大的功能多样性，在发育、动态平衡、组织修复和免疫等方面都有作用，巨噬细胞已经成为许多人类疾病的重要治疗靶点。在免疫系统中，巨噬细胞是免疫效应细胞，具有免疫防御、免疫监视、免疫调节等多种功能，在机体的非特异免疫系统中，巨噬细胞发挥着重要的作用，是评价免疫调节活性常用的实验细胞。脂多糖(LPS)是一种细菌内毒素和重要群特异性抗原，能刺激巨噬细胞，增加吞噬活性。

2、实验仪器与试剂：

Gen5型酶标分析仪，基因有限公司；

5510型CO₂培养箱，美国NUAIRE公司；

CKX41型倒置显微镜，奥林巴斯有限公司；

SW-CJ-2FD双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司。

RPMI-1640，GIBCO公司，批号：1786043；

MTT，Solarbio公司，250mg，批号：No.303H0352；

胎牛血清Gibco公司，批号：1618862；

二甲基亚砜(DMSO)，Solarbio公司，100mL，批号：D5879；

脂多糖，sigma公司，10mg，批号：026M4021V；

黄芪多糖注射液，河南复兴动物药业有限公司，批号：20140615

注射用环磷酰胺，江苏盛迪医药有限公司，批号：16070425

PBS，Solarbio公司，100mL，批号：11310221；

中性红，Solarbio公司，100mL，批号：925B047；

Hepes，Solarbio公司，100g，批号：804D0411；

其他化学试剂均为分析纯试剂。

3、实验动物：

SPF级昆明种雌性小鼠，体重18～22g，由湖南景莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXX(湘)K2016-0002，用于小鼠腹腔巨噬细胞提取及药物对正常、免疫低下小鼠影响免疫功能影响试验；健康绵羊；健康豚鼠。

4、实验方法：

本实验采用小鼠腹腔巨噬细胞：颈椎脱臼处死昆明小鼠，放入体积分数为75％的酒精中浸泡3min，腹腔注入4mL无菌PBS缓冲液(含10％胎牛血清)和2mL空气，轻揉腹部3min，无菌条件下打开腹腔，吸取腹腔液于离心管中，1200rpm离心5min，弃上清液收集巨噬细胞，PBS缓冲液洗涤细胞两次，用含10％胎牛血清的1640培养液调整细胞密度至2×10⁶个·mL^-1，以每孔100μL接种于96孔板，置于5％CO₂、37℃条件下培养，3h后用PBS洗去未贴壁细胞，即得纯化的腹腔巨噬细胞。

以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)为阳性对照，分别通过单独测试药物刺激及测试药物联合LPS刺激，考察巨噬细胞的吞噬能力，以评价喙尾琵琶甲有效部位的免疫活性。其中，所述测试药物包括喙尾琵琶甲刺激性防御液(防御液组)、喙尾琵琶甲水提物(水提部位组)、实施例1制备得到的喙尾琵琶甲总提取物(总提取物组)和有效部位(有效部位组)；所述喙尾琵琶甲刺激性防御液是以收集容器刺激喙尾琵琶甲成虫活体的尾部，使其尾部腺体释放防御液于收集容器中；喙尾琵琶甲水提物是将喙尾琵琶甲虫体以少量乙醇处死后，以3～5倍体积的水浸泡提取2～3次，过滤，提取液减压浓缩至约总体积的1/10，冷冻干燥，即得。

将所述纯化的腹腔巨噬细胞以2×10⁶个/mL的密度接种于96孔培养板，分别设置细胞对照组(只加细胞和培养基)、LPS模型组(LPS终浓度为10μg/mL)、测试药物组(每组药物浓度分别为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL和31.25μg/mL)以及LPS+测试药物处理组(加入与测试药物组相同浓度的10μL药物孵育4h后，加入终浓度为10μg/mL的LPS)，每个浓度设置3个复孔。

将各组细胞于37℃、5％CO₂条件下在培养箱孵育24h，弃上清，加入0.1％的中性红溶液200μL，孵育3h；弃上清，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每孔加入200μL细胞溶解液(含50％乙醇、1％乙酸和49％水)，4℃静置过夜，于520nm波长下测定OD值，OD值越大，说明细胞吞噬能力越强。

5、实验结果：

表2结果显示，小鼠腹腔巨噬细胞在脂多糖LPS刺激下，吞噬作用明显增强；喙尾琵琶甲有效部位的31.25μg/mL、62.50μg/mL、125.00μg/mL和250.00μg/mL四个剂量组均显示增强巨噬细胞吞噬能力的趋势，而喙尾琵琶甲总提取物、水提部位和刺激性防御液对吞噬细胞的吞噬能力基本无影响。

表2单独测试药物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响(OD值)

注：^*P<0.05，与空白细胞组比较。

表3结果显示，当测试药物联合LPS共同刺激吞噬细胞时，仅喙尾琵琶甲有效部位125μg/mL及以上剂量组显示具有增强吞噬能力的趋势；喙尾琵琶甲总提取物、水提部位及刺激性防御液的所有剂量组联合LPS刺激，不能增强吞噬能力，相反对LPS的刺激增强作用具有一定抑制活性。

表3测试药物联合LPS刺激对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力影响(OD值)

注：^*P<0.05，与空白细胞组比较。

6、实验结论：

在喙尾琵琶甲有效部位的刺激下，巨噬细胞出现了吞噬作用增强，提示腹腔巨噬细胞在喙尾琵琶甲有效部位的刺激下活化，固有免疫功能增强，间接说明所述喙尾琵琶甲有效部位具有增强免疫作用；与LPS联合刺激，喙尾琵琶甲有效部位能在一定程度上进一步增加LPS预刺激后的巨噬细胞吞噬能力。

实施例6喙尾琵琶甲有效部位对正常小鼠免疫功能的影响

1、实验仪器与试剂：同实施例5。

2、实验动物：同实施例5。

3、实验方法：

都氏试剂配制：碳酸氢钠1g，氰化钾0.05g，高铁氰化钾0.2g，蒸馏水1000mL，现用现配。

阿氏液配制：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.42g，蒸馏水100mL，加热溶解后调pH值至6.1，经过69KPa、15min高温灭菌，4℃保存留用。

绵羊红细胞(SRBC)悬液制备：在无菌条件下，从健康绵羊外颈静脉取血，置于内盛有玻璃珠的灭菌的锥形瓶中，摇动30min以除去纤维蛋白，加入2倍体积的阿氏液，置于4℃冰箱中保存备用。临用时取上述保存的绵羊红细胞，用生理盐水(NS)洗涤3次，2000r/min离心5min，弃上清液，按洗涤后红细胞与生理盐水的体积比为3:5，向洗涤后红细胞中加入生理盐水进行稀释(红细胞浓度每毫升20亿个)。

豚鼠血清制备：10只豚鼠，心脏取血后混合，3000r/min离心10min，分离血清，于EP管中，-80℃冰箱保存，使用时用10倍体积的生理盐水稀释。

以环磷酰胺(Cytoxan，CTX)为阴性对照，黄芪多糖(Astragalus Polysacharin，APS)为阳性对照，考察测试药物对正常实验小鼠免疫相关脏器指数、血清溶血素生成水平及外周血免疫细胞水平的影响；其中，测试药物是指实施例1制备得到的喙尾琵琶甲有效部位(EAF)。

将小鼠随机分成6组，即空白对照组(NS组)、环磷酰胺组(CTX组)、黄芪多糖组(APS组)、EAF低、中、高剂量组。平均每组6只，雄雌各半。将EAF配制成高、中、低(分别为400mg/kg体重、200mg/kg体重和100mg/kg体重)三个剂量浓度；空白对照组给予生理盐水，环磷酰胺组于第7d开始腹腔注射80mg/kg环磷酰胺(之前同样给予生理盐水)，黄芪多糖组以0.16mL/10g灌胃给药，测试药物组分别以0.2mL/10g灌胃给药，连续给药10d。除NS组外，其余各组于给药第3d、第5d、第7d，腹腔注射20％绵羊红细胞悬液0.2mL进行免疫。

外周血免疫细胞水平测定：末次给药后1h，小鼠摘眼球取血，取20μL全血于预稀释液中，用动物血细胞分析仪以预稀释模式测定外周血细胞计数。

溶血素含量测定：于末次给药后1h，小鼠摘眼球取血，2000r/min离心10min，取血清，56℃恒温30min灭活血清中补体，对血清溶血素效价进行滴定，滴定试验结果溶血素效价为1：500；取血清稀释相应溶血素效价倍数(即500倍)，置于EP管内，再加入0.5mL的5％的绵羊红细胞及稀释的豚鼠血清1.0mL，空白对照管内采用生理盐水取代小鼠血清。将所有试管于37℃水浴锅中恒温10min，取出放入冰浴中终止反应。2000r/min离心10min，取上清液1.0mL和都氏试剂3.0mL于管内；同时取绵羊红细胞悬液0.25mL和都氏试剂3.75mL于另一支试管内充分摇匀，放置10min，于540nm波长下，以对照管做空白，分别测定吸光度值，计算半数溶血值。

半数溶血值：HC₅₀＝(样品吸光度值/红细胞半数溶血时吸光度值)×稀释倍数

脏器指数的测定：小鼠取血后处死，取出小鼠脾脏和胸腺，去除脂肪和筋膜组织，称取重量，计算免疫器官脏器指数。其中，脏器指数＝脏器质量(mg)/小鼠体重(g)。

4、实验结果：

根据表4结果可知，与NS组比较，CTX组的肝脏、脾脏和胸腺指数均呈降低趋势；与CTX组比较，各药物组的脾脏指数均有一定程度增加，且黄芪多糖组和EAF低剂量组具有统计学差异(P<0.01)，所有药物组胸腺指数均呈增加趋势。根据实验结果，CTX显示出一定的免疫抑制作用、APS则显示出免疫促进作用，EAF则能调节免疫功能使小鼠的免疫脏器指数接近正常值。

表4测试药物对正常小鼠免疫器官脏器指数的影响(n＝6)

注：与NS组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与CTX组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与APS组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

表5显示，与正常组比较，CTX组半数溶血值(HC₅₀)显著降低(P<0.01)，APS组HC₅₀显著升高(P<0.01)，而EAF高、中、低剂量组溶血素生成水平均有升高趋势。根据实验各组的HC₅₀值可知，CTX对正常小鼠具有免疫抑制作用、APS则显示出免疫促进作用，EAF则能调节免疫功能，EAF中、高剂量组能使小鼠的血清溶血素生成水平接近正常值范围(与NS组比，P>0.05)。

表5测试药物对正常小鼠血清溶血素生成水平的影响(n＝6)

注：与NS组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与CTX组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与APS组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

表6结果显示，与NS组比较，CTX组的小鼠外周血中白血细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞水平均有不同程度降低；APS组能显著增加正常小鼠外周血白细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞水平；EAF各剂量组的白细胞、淋巴细胞和单核细胞水平均呈升高趋势，对粒细胞水平基本无影响。根据实验结果，CTX显示出一定的免疫抑制作用、APS则显示出免疫促进作用，EAF则能调节免疫功能使小鼠外周血免疫细胞计数接近正常值。

表6测试药物对正常小鼠外周血免疫细胞的影响(n＝6；1×10⁹/L)

注：与NS组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与CTX组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与APS组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

实施例7喙尾琵琶甲有效部位对免疫低下小鼠免疫功能的影响

1、实验仪器与试剂：同实施例5。

2、实验动物：同实施例5。

3、实验方法：

都氏试剂配制：同实施例6。

阿氏液配制：同实施例6。

绵羊红细胞(SRBC)悬液制备：同实施例6。

豚鼠血清制备：同实施例6。

以环磷酰胺(Cytoxan，CTX)为免疫低下诱导剂，黄芪多糖(AstragalusPolysacharin，APS)为阳性对照。将小鼠随机分成6组，即正常对照组(NS组)、空白对照组(CTX组)、阴性对照组(APS组)、EAF低、中、高剂量组。平均每组6只，雄雌各半。将EAF配制成高、中、低(分别为400mg/kg体重、200mg/kg体重和100mg/kg体重)三个剂量浓度；正常对照组和空白对照组给予生理盐水。除正常对照组外，其他各组于给药第7d开始通过腹腔注射80mg/kg环磷酰胺0.1mL，连续注射3d，造成小鼠免疫低下，考察测试药物对实验小鼠免疫相关脏器指数，血清溶血素生成水平及外周血免疫细胞水平的影响；其中，测试药物是指实施例1制备得到的喙尾琵琶甲有效部位(EAF)；给药方式与以绵羊红细胞进行免疫同实施例6。

外周血免疫细胞水平测定：同实施例6。

溶血素含量测定：同实施例6。

半数溶血值：同实施例6。

脏器指数的测定：同实施例6。

4、实验结果：

根据表7结果可知，与正常对照组(NS组)比较，CTX组的脾脏指数和胸腺指数均显著降低(P<0.01)；与CTX组比较，各药物治疗组脾脏指数和胸腺指数均呈升高趋势，其中脾脏指数升高显著(P<0.01)，并超过NS组(P<0.01)。根据实验结果，CTX能有效复制免疫低下小鼠模型，而APS和测试药物喙尾琵琶甲有效部位皆显示出对免疫低下小鼠明显的免疫促进作用。

表7测试药物对免疫低下小鼠脏器指数的影响(n＝6)

注：与NS组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与CTX组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与APS组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

根据表8结果，与NS组(正常小鼠)比较，CTX组半数溶血值(HC₅₀)显著降低(P<0.01)；与CTX组比较，所有药物治疗组HC₅₀均显著增加(P<0.01)，其中EAF高、中、低剂量组与APS组差异显著(P<0.01)，并基本达到正常组水平。实验结果显示，CTX能有效诱导小鼠免疫低下、抑制溶血素生成，而APS和喙尾琵琶甲有效部位皆显示出对CTX所致免疫低下小鼠显著的免疫促进作用。

表8测试药物对免疫低下小鼠溶血素生成水平的影响(n＝6)

注：与NS组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与CTX组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与APS组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

根据表9结果可知，与正常对照组(NS组)比较，CTX组的小鼠外周血白细胞、淋巴细胞水平显著降低(P<0.01)；与CTX组比较，所有药物治疗组外周血四种免疫细胞均显著升(P<0.01)，其中白细胞、单核细胞和粒细胞水平升高并超过正常值(P<0.01)。实验结果显示，CTX能有效诱导小鼠免疫低下、降低部分外周免疫细胞水平，而APS和喙尾琵琶甲有效部位皆显示出提高免疫低下小鼠外周免疫细胞水平的功效，说明其具有显著的免疫促进作用。

表9测试药物对免疫低下小鼠外周血免疫细胞的影响(n＝6；1×10⁹/L)

注：与NS组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与CTX组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与APS组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

综上，实施例5中巨噬细胞吞噬能力试验显示，喙尾琵琶甲有效部位具有免疫增强的活性，对机体的非特异性免疫具有增强作用。

实施例6和7进一步从细胞免疫和体液免疫两方面，考察了喙尾琵琶甲有效部位(EAF)对正常及免疫低下小鼠免疫功能的影响。正常小鼠给予EAF后，小鼠脾脏指数有升高趋势，胸腺指数与正常组无差异，对溶血素生成水平无影响，对外周血中白细胞、淋巴细胞、单核细胞及粒细胞等免疫细胞水平均有一定升高趋势；环磷酰胺致免疫低下小鼠给予EAF后，脾脏指数显著升高、胸腺指数也呈升高趋势，溶血素生成水平显著升高并达到正常水平，外周血免疫细胞水平显著增加。以上实验结果提示，EFA对正常小鼠的免疫功能无明显影响，但能显著改善环磷酰胺所造成的免疫低下状态，升高免疫细胞水平，增强体液免疫功能。喙尾琵琶甲有效部位具有调节免疫功能的作用，值得进一步开发成为免疫调节剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.喙尾琵琶甲有效部位的制备方法，包括以下步骤：

(1)将喙尾琵琶甲依次进行干燥和粉碎，得到喙尾琵琶甲粉末；

(2)采用体积分数为[90％,100％)的乙醇溶液或无水乙醇对所述步骤(1)中喙尾琵琶甲粉末进行第一提取，得到第一提取液和第一滤渣；

采用体积分数为80～90％的乙醇溶液对所述第一滤渣进行第二提取，得到第二提取液和第二滤渣；

采用体积分数为70～80％的乙醇溶液对所述第二滤渣进行第三提取，得到第三提取液和第三滤渣；

将所述第一提取液、第二提取液和第三提取液合并，得到乙醇提取液；

(3)将所述步骤(2)中乙醇提取液进行减压浓缩，得到总提取物浓缩液；

(4)采用低极性有机萃取剂对所述步骤(3)中总提取物浓缩液进行萃取脱脂处理，得到脱脂母液；所述低极性有机萃取剂为石油醚；

(5)采用乙酸乙酯对所述步骤(4)中脱脂母液进行萃取，得到乙酸乙酯萃取液；

(6)减压浓缩去除所述步骤(5)中乙酸乙酯萃取液中的溶剂，得到喙尾琵琶甲有效部位。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中第一提取、第二提取和第三提取的料液比独立地为1：(3～5)。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中减压浓缩在45～55℃条件下进行，所述减压浓缩是使所得浓缩液的体积为所述乙醇提取液体积的8～12％。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中萃取脱脂处理重复进行三次，每次萃取脱脂处理的料液比独立为1：(0.8～1.2)。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中萃取重复进行三次，每次萃取的料液比独立为1：(0.8～1.2)。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中减压浓缩在50～55℃条件下进行。

7.权利要求1～6任一项所述制备方法制备得到的喙尾琵琶甲有效部位。

8.一种免疫调节剂，包括辅料和权利要求7所述喙尾琵琶甲有效部位。

9.根据权利要求8所述的免疫调节剂，其特征在于，所述喙尾琵琶甲有效部位在免疫调节剂中的质量含量为0.01～99.9％。

10.根据权利要求8或9所述的免疫调节剂，其特征在于，所述辅料包括食用辅料或药用辅料。