CN108904519A - 猴头菌多糖在制备治疗结肠炎的药物中的用途及包含其的药物组合物 - Google Patents

猴头菌多糖在制备治疗结肠炎的药物中的用途及包含其的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了猴头菌多糖在制备治疗结肠炎的药物中的用途。具体地，所述结肠炎为溃疡性结肠炎等。其可以单独或与其他组分共同使用，安全有效。本发明还公开了一种治疗结肠炎的药物组合物，其包括如下重量份的组分：水苏糖50～80份、猴头菌多糖20～40份。

Description

猴头菌多糖在制备治疗结肠炎的药物中的用途及包含其的药 物组合物
技术领域
本发明涉及一种猴头菌多糖的新用途，具体涉及其在制备治疗结肠炎的药物中的用途及包含其的药物组合物。
背景技术
结肠炎(colitis)是指各种原因引起的结肠炎症性病变。可由细菌、真菌、病毒、寄生虫、原虫等生物引起，亦可由变态反应及理化因子引起，根据病因不同，可分为特异性炎性病变和非特异性炎性病变，前者指感染性结肠炎、缺血性结肠炎和伪膜性结肠炎等，后者包括溃疡性结肠炎及结肠Crohn病。主要临床表现腹泻、腹痛、黏液便及脓血便、里急后重、甚则大便秘结、数日内不能通大便；常伴有消瘦乏力等，多反复发作。我国溃疡性结肠炎的发病率呈逐渐上升趋势，病程冗长，且有并发结肠癌的危险，因此受到人们越来越多的重视。
溃疡性结肠炎的病因尚未完全明确，目前认为，本病的发生是由免疫因素、遗传因素、环境因素和感染因素共同作用的结果。根据患者病情给予个体化、综合化的治疗。原则上应尽早控制疾病的症状，促进缓解，维持治疗，防止复发，防治并发症和掌握手术治疗的时机。但是目前的治疗药物，通常对肝肾具有一定的副作用。
猴头菇多糖是从优质猴头菇子实体中提取的有效活性成分，猴头菇的主要成分是多糖类和猴头菌素，经热水提取的猴头菇多糖对小白鼠肉瘤180和艾氏腹水癌有明显的抑制作用，同时具有助消化、利五脏的功能，能提高人体免疫能力。
水苏糖(Stachyose)是自然存在的一种四糖，属于棉子糖属半乳糖苷类非还原性功能性低聚糖，由一分子葡萄糖、一分子果糖、两分子半乳糖构成，结构式为果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖，分子式为C24H42O2，分子量为666.59。由于分子中葡萄糖基和2个半乳糖之间以-D-半乳糖苷键连接，而人体内缺乏α-D-半乳糖苷酶，所以水苏糖不能被人体消化吸收，在人体内只有肠道中的双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等少数有益菌具有分解水苏糖的酶系统，因此水苏糖可作为这些有益菌的特异性促生因子。正是水苏糖的这些特性，决定了它具有的一些特定保健功能：(1)作为益生元增殖肠道内双歧杆菌等有益菌群，不仅能调节肠道微环境，缓解便秘等症状，还可增加氨基酸和维生素B1、B2、尼克酸、叶酸等的合成，降低血液中胆固醇水平，防治高血压。美国公布的动物实验和人群实验结果证明：服用水苏糖与对照组相比较，可使钙吸收率增加26～28％，进而增进骨密度和改善骨结构。(2)水苏糖的低热值，难消化的特性可将其作为甜味剂加入糖尿病、肥胖症等患者的食物中。(3)水苏糖不被引起龋齿的链球菌等口腔微生物所利用，不会引起龋齿，适于制作儿童食品。此外，水苏糖的一些保水等特性可以广泛应用于医药、化妆品、饲料等诸多领域。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明旨在探索抗生素以外的可能治疗结肠炎的药物，或提供新的药物配合抗生素对结肠炎进行治疗。
本发明所要解决的技术问题之一是提供猴头菌多糖在制备治疗结肠炎的药物中的用途。
所述猴头菌多糖可以直接购买或使用常规方法制备得到，优选为水提醇沉的方法制备得到。
具体地，所述结肠炎为溃疡性结肠炎等。
本发明所要解决的技术问题之二是提供了一种治疗结肠炎的药物组合物，其包括如下重量份的组分：水苏糖50～80份、猴头菌多糖20～40份。
优选地，所述药物组合物还包括：香菇多糖10～30份；进一步优选地，所述药物组合物还包括：小檗碱10～30份、海藻素10～30份。
优选地，所述水苏糖的制备方法包括如下步骤：
(1)水提：按料液比1:5～1:15(g/mL)向草石蚕中加入去离子水，浸泡1～4h，在30～60℃条件下提取1～2h，离心收集上清液；
(2)酶解：向步骤(1)所得上清液中添加酶，草石蚕和酶的质量比为100:1～50:1；于35～40℃酶解2～4小时；然后将酶解液于90～100℃水浴处理5～10分钟，终止酶反应，得到酶解液；
(3)澄清：向步骤(2)所得上清液中加入上清液质量1～2％的活性炭粉末，在60～80℃，保持30～60min，过滤，离心得到上清液；
(4)浓缩、干燥：将步骤(3)所得上清液进行浓缩，然后干燥，得到的粉末即水苏糖。
其中，步骤(2)所述酶为果胶酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶中的一种或多种。
进一步优选地，所述水苏糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)水提：按料液比1:5～1:15(g/mL)向草石蚕中加入去离子水，浸泡1～4h，在30～60℃条件下提取1～2h，离心收集上清液；
(2)酶解：向步骤(1)所得上清液中添加酶，草石蚕和酶的质量比为100:1～50:1；于35～40℃酶解2～4小时；然后将酶解液于90～100℃水浴处理5～10分钟，终止酶反应，得到酶解液；
(3)酸解：向步骤(2)所得酶解液中加入酸，调节上清液的pH至1～2，在20～30℃条件下静置4～6h，得到酸解液；
(4)中和：加入生石灰，调节pH值至6.0～7.0，离心得上清液；
(5)澄清：向步骤(4)所得上清液中加入上清液质量1～2％的活性炭粉末，在60～80℃，保持30～60min，过滤，离心得到上清液；
(6)浓缩、干燥：将步骤(5)所得上清液进行浓缩，然后干燥，得到的粉末即水苏糖。
其中，
步骤(2)所述酶为果胶酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶中的一种或多种，优选为果胶酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶质量比(2～3):(3～5):1的混合酶。
步骤(3)所述酸为柠檬酸和/或L-酒石酸，优选为柠檬酸和L-酒石酸摩尔比3:1-4:1的混合物。
步骤(6)所述干燥可以为冷冻干燥、喷雾干燥、烘干箱干燥等。
各步骤中所述离心为3000～4000rpm离心。
本发明所述药物组合物可以由各组分直接混合均匀得到。
本发明所要解决的技术问题之三是提供了上述药物组合物在制备治疗结肠炎的药物中的用途。具体地，所述结肠炎为溃疡性结肠炎等。
所述制备治疗结肠炎的药物剂型可以为片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、冲剂、口服液制剂等。所述剂型可以按照本领域的常规技术制备得到。
本发明中，
水苏糖，CAS号：54261-98-2；
香菇多糖，CAS号：37339-90-5；
海藻素，CAS号：69235-69-4；
小檗碱，CAS号：2086-83-1。
本发明发现了猴头菌多糖的新用途，且可以单独或与其他天然提取成分共同用于制备治疗疗结肠炎的药物。其也可以与抗生素药物连用，降低毒副作用及耐药性，安全有效，减少病患痛苦。
本发明还提供了一种水苏糖的优化的制备方法，其可以显著提高水苏糖的收率。
附图说明
图1为结肠炎模型实验后正常对照组病理切片；
图2为结肠炎模型实验后溶剂对照组病理切片；
图3为结肠炎模型实验后阳性药对照组病理切片；
图4为结肠炎模型实验后受试药组(实施例8)病理切片；
图5为结肠炎模型实验后受试药组(实施例12)病理切片；
图6为小鼠结肠长度测量照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例中胰蛋白酶，食品级，购于上海江莱生物科技有限公司，酶活力6万/g。
实施例中果胶酶，食品级，购于上海江莱生物科技有限公司，酶活力10万/g。
实施例中无花果蛋白酶，食品级，购于上海江莱生物科技有限公司，酶活力10万/g。
实施例中的猴头菌多糖，参照中国专利ZL201210103089.5中实施例1的方法制备。
实施例1水苏糖的制备
水苏糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)水提：按料液比1:10g/mL向草石蚕中加入去离子水，浸泡1h，在60℃条件下提取2h，离心收集上清液；
(2)酶解：向步骤(1)所得上清液中添加酶，草石蚕和酶的质量比为50:1；于37℃酶解3小时；然后将酶解液于100℃水浴处理5～10分钟，终止酶反应，得到酶解液；
(3)澄清：向步骤(2)所得上清液中加入上清液质量1％的活性炭粉末，在60℃，保持30min，过滤，离心得到上清液；
(4)浓缩、干燥：将步骤(3)所得上清液进行浓缩至上清液体积的1/10，然后干燥，得到的粉末即水苏糖。
其中，
步骤(2)所述酶为果胶酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶质量比2:5:1的混合酶。
步骤(4)所述干燥可以为冷冻干燥、喷雾干燥、烘干箱干燥等。
各步骤中所述离心为3500rpm离心。
实施例2水苏糖的制备
水苏糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)水提：按料液比1:10g/mL向草石蚕中加入去离子水，浸泡1h，在60℃条件下提取2h，离心收集上清液；
(2)酶解：向步骤(1)所得上清液中添加酶，草石蚕和酶的质量比为50:1；于37℃酶解3小时；然后将酶解液于100℃水浴处理5～10分钟，终止酶反应，得到酶解液；
(3)酸解：向步骤(2)所得酶解液中加入酸，调节上清液的pH至2，在25℃条件下静置4h，得到酸解液；
(4)中和：加入生石灰，调节pH值至7.0，离心得上清液；
(5)澄清：向步骤(4)所得上清液中加入上清液质量1％的活性炭粉末，在60℃，保持30min，过滤，离心得到上清液；
(6)浓缩、干燥：将步骤(5)所得上清液进行浓缩至上清液体积的1/10，然后干燥，得到的粉末即水苏糖。
其中，
步骤(2)所述酶为果胶酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶质量比2:5:1的混合酶。
步骤(3)所述酸为柠檬酸和L-酒石酸摩尔比4:1的混合物。
各步骤中所述离心为3500rpm离心。
实施例3水苏糖的制备
按照实施例2的方法制备水苏糖，区别在于：步骤(2)所述酶为果胶酶。
实施例4水苏糖的制备
按照实施例2的方法制备水苏糖，区别在于：步骤(2)所述酶为胰蛋白酶。
实施例5水苏糖的制备
按照实施例2的方法制备水苏糖，区别在于：步骤(2)所述酶为无花果蛋白酶。
实施例6水苏糖的制备
按照实施例2的方法制备水苏糖，区别在于：步骤(3)所述酸为柠檬酸。
实施例7水苏糖的制备
按照实施例2的方法制备水苏糖，区别在于：步骤(3)所述酸为L-酒石酸。
测试例1
采用XBridge Amide色谱柱测试实施例1-7得到的产品中水苏糖含量。梯度洗脱流动相：乙腈(A)，水(B)，分别添加0.2％(v/v)的三乙胺，梯度洗脱(A:B)：70:30→45:55→70:30→70:30，相应的加入流动相的时间点为0min→16min→16.01min→20min，流速为1kL/min，柱温为35℃，蒸发光散射检测器漂移管温度为95℃，载气流速为2.5L/min。标准品为购于sigma公司的水苏糖。
测试结果见下表：
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6 实施例7
水苏糖含量 79.6％ 92.3％ 87.4％ 83.5％ 84.0％ 90.8％ 85.2％
实施例8～12药物组合物的制备
按照下表中的质量百分比称取各组分，混合均匀，制备药物组合物，表格中的水苏糖使用实施例2制备的产品：
水苏糖 猴头菌多糖 香菇多糖 小檗碱 海藻素
实施例8 80％ 20％
实施例9 70％ 30％
实施例10 50％ 30％ 20％
实施例11 50％ 30％ 10％ 10％
实施例12 50％ 20％ 10％ 10％ 10％
测试例2
实验动物：清洁级SD大鼠(雌性)，6-8周龄，体重170±10g。由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。常温环境饲养(温度22±2℃，湿度40～50％)，12小时明/暗交替。动物自由摄食、饮水。适应性喂养1周后S D大鼠随机分为8组：正常对照组、溶剂对照组(生理盐水)、受试药组(实施例8-12组)和阳性药对照组(SASP)。每组15只。
造模：除了正常对照组以外均进行造模，造模前1天禁食不禁水24h。造模当天(Day0)测定动物的基础体重后进行造模。造模步骤如下：使用1％戊巴比妥钠溶液作为麻醉剂，以剂量为0.3mL/100g(体重)对大鼠进行腹腔注射；在1mL注射器内吸入TNBS-50％乙醇溶液，随后连接1.2mm直径导管和注射器；将导管经肛口缓慢插入大鼠肠腔内，在约8cm处到达结肠部位，丙三醇可作为润滑剂；缓慢向结肠内注射TNBS溶液，剂量为80mg/kg；将导管缓缓从结肠内抽出，保持大鼠头部垂直朝下60s，确保造模剂完全留在结肠内，充分深入大鼠肠腔。正常对照组大鼠仅使用50％乙醇溶液进行灌肠，其他步骤同各造模组。将大鼠放回笼中。
给药方案：溶剂对照组灌胃给予生理盐水；受试药组灌胃给予实施例8-12的药物组合物40mg/kg)；SASP组灌胃给予SASP(柳氮磺吡啶肠溶片)180mg/kg；灌胃给药前用生理盐水制备成溶液，每组每天的灌胃给药量为1mL/100g体重，每日给药1次；从造模当天开始给药，连续给药7天。SASP组动物的给药剂量通过实验动物与人的用药量进行换算，均相当于临床上治疗人类溃疡性结肠炎的用药剂量。
动物情况记录：整个实验周期，每日给药前检查实验动物1次，给药后第7天，进行大便隐血实验：采用邻联甲苯胺法，用隐血(OB)试剂盒检测，用棉签挑取少量大鼠大便于白瓷板上，先滴加邻联甲苯胺，再滴加过氧化氢，根据显色时间和显色程度进行隐血等级评分。隐血等级评分标准如下：
记录各组大鼠评分的只数，实验结果如下表：
给药后第7天测试大鼠结肠组织中SOD含量、MDA含量、NO含量，分别使用SOD试剂盒、MDA试剂盒和NO试剂盒测试，每组大鼠取平均值，测试结果见下表：
实验结束后，解剖大鼠，观察大鼠结肠病理切片，正常对照组病理切片见图1，溶剂对照组病理切片见图2，阳性药对照组病理切片见图3，受试药组(实施例8)病理切片见图4，受试药组(实施例12)病理切片见图5。
取各组小鼠的结肠，测量结肠长度，并取平均值，结果见下表：
组别 结肠长度(cm)
正常对照组 6.7±0.9
溶剂对照组 3.8±1.5
阳性药对照组 5.6±1.7
受试药组(实施例8) 5.4±1.3
受试药组(实施例12) 6.1±1.1
并取各组小鼠中结肠长度最接近平均值的小鼠结肠拍照，照片见图6。

Claims (10)

1.猴头菌多糖在制备治疗结肠炎的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述结肠炎为溃疡性结肠炎。
3.一种治疗结肠炎的药物组合物，其特征在于，包括如下重量份的组分：水苏糖50～80份、猴头菌多糖20～40份。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括：香菇多糖10～30份。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括：小檗碱10～30份、海藻素10～30份。
6.根据权利要求3-5中任意一项所述的药物组合物，其特征在于：所述水苏糖的制备方法包括如下步骤：
(1)水提：按料液比1:5～1:15(g/mL)向草石蚕中加入去离子水，浸泡1～4h，在30～60℃条件下提取1～2h，离心收集上清液；
(2)酶解：向步骤(1)所得上清液中添加酶，草石蚕和酶的质量比为100:1～50:1；于35～40℃酶解2～4小时；然后将酶解液于90～100℃水浴处理5～10分钟，终止酶反应，得到酶解液；
(3)澄清：向步骤(2)所得上清液中加入上清液质量1～2％的活性炭粉末，在60～80℃，保持30～60min，过滤，离心得到上清液；
(4)浓缩、干燥：将步骤(3)所得上清液进行浓缩，然后干燥，得到的粉末即水苏糖。
7.根据权利要求3-5中任意一项所述的药物组合物，其特征在于：所述水苏糖的制备方法包括如下步骤：
(1)水提：按料液比1:5～1:15(g/mL)向草石蚕中加入去离子水，浸泡1～4h，在30～60℃条件下提取1～2h，离心收集上清液；
(2)酶解：向步骤(1)所得上清液中添加酶，草石蚕和酶的质量比为100:1～50:1；于35～40℃酶解2～4小时；然后将酶解液于90～100℃水浴处理5～10分钟，终止酶反应，得到酶解液；
(3)酸解：向步骤(2)所得酶解液中加入酸，调节上清液的pH至1-2，在20～30℃条件下静置4～6h，得到酸解液；
(4)中和：加入生石灰，调节pH值至6.0～7.0，离心得上清液；
(5)澄清：向步骤(4)所得上清液中加入上清液质量1～2％的活性炭粉末，在60～80℃，保持30～60min，过滤，离心得到上清液；
(6)浓缩、干燥：将步骤(5)所得上清液进行浓缩，然后干燥，得到的粉末即水苏糖。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于：
步骤(2)所述酶为果胶酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶中的一种或多种；
步骤(3)所述酸为柠檬酸和/或L-酒石酸。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：
步骤(2)所述酶为果胶酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶质量比(2～3):(3～5):1的混合酶；
步骤(3)所述酸为柠檬酸和L-酒石酸摩尔比3:1-4:1的混合物。
10.权利要求3-5中任一项所述药物组合物在制备治疗结肠炎的药物中的用途，所述结肠炎为溃疡性结肠炎。
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