CN110585232A - 猴头菇多糖在制备预防和治疗结肠癌产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了猴头菇多糖在制备预防和/或治疗结肠癌产品中的应用。实验证明,猴头菇多糖可以有效抑制人结肠癌细胞HCT‑116、DLD1、HT‑29细胞的生长;可以显著抑制HCT‑116细胞的克隆集落形成能力;可以促进人结肠癌HCT‑116细胞发生凋亡;可以诱导HCT‑116在S期发生阻滞,进而预防和治疗结肠癌,因此猴头菇多糖具有成为预防和/或治疗结肠癌作用的功能食品或药品的潜力。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及猴头菇多糖在制备预防和/或治疗结肠癌产品中的应用。
背景技术
结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一。近年来,其发病率呈上升且年轻化趋势,是威胁人类生命健康的全球性疾病。虽然目前结肠癌的治疗已经取得了很大的进展,但是抗癌化学药物在治疗癌症的同时,也会对人体本身产生很大的毒性和副作用,导致很多患者在治疗后复发或转移。因此,从天然产物中寻找疗效高、毒性低的预防和/或治疗结肠癌的功能食品或药品等产品尤为重要。
猴头菇(Hericium erinaceus),又称猴头菌,属于担子菌门Basidiomycota,伞菌纲Agaricomycetes,是我国一种著名的食药兼用菌。其子实体被应用于消化系统疾病的治疗已经有2 000多年的历史。但关于该子实体多糖用于预防和/或治疗结肠癌没有研究和报道。
发明内容
本发明的目的是提供猴头菇多糖的新用途。
本发明所提供的猴头菇多糖的新用途是其在制备如下1)-5)的产品中的应用:
1)预防和/或治疗结肠癌的产品;
2)抑制人结肠癌细胞生长的产品;
3)抑制人结肠癌细胞克隆集落形成能力的产品;
4)促进人结肠癌细胞发生凋亡的产品;
5)诱导人结肠癌细胞在S期发生阻滞的产品;
所述产品具体可为功能食品或药品;
所述应用2)中,所述人结肠癌细胞具体可为人结肠癌细胞HCT-116、DLD1、HT-29细胞中的至少一种;
所述应用3)中,所述人结肠癌细胞具体可为人结肠癌细胞HCT-116;
所述应用4)中,所述人结肠癌细胞具体可为人结肠癌细胞HCT-116;
所述应用5)中,所述人结肠癌细胞具体可为人结肠癌细胞HCT-116。
上述应用中,所述猴头菇多糖通过包括如下步骤的方法制备得到:
1)将猴头菇粉用水浸提,离心,收集上清液,将所得上清液减压蒸发浓缩至粘稠状;
2)向步骤1)中浓缩后的浸提液中加入乙酸锌水溶液和亚铁氰化钾水溶液,搅拌,静置,离心,收集上清液,将所得上清液减压蒸发浓缩至粘稠状,得到浓缩液;
3)将步骤2)得到的浓缩液透析,向透析后的液体中加入无水乙醇,搅拌,静置过夜,离心,收集沉淀;
4)用水将步骤3)所得沉淀溶解,冷冻干燥,得到猴头菇多糖粉末,即可。
上述方法步骤1)中,所述猴头菇粉通过将新鲜的猴头菇干燥制得,所述干燥的温度可为50℃,时间可为4h;
所述猴头菇粉过100目筛;
所述浸提用水具体可为蒸馏水;
所述浸提用水与猴头菇粉的配比可为30-40ml:1g;
所述浸提的温度可为80℃,时间可为4h,
所述离心的条件为:6000rpm离心20分钟;
所述浸提可进行多次,具体可为3次;
上述方法步骤2)中,所述乙酸锌水溶液的质量百分浓度可为21.9%;所述亚铁氰化钾水溶液的质量百分浓度可为10.6%;
所述乙酸锌水溶液、亚铁氰化钾水溶液与浓缩后的浸提液的体积比可为0.9:0.9:10;
所述静置的温度可为室温,时间可为30min;
所述离心的条件可为6000rpm离心20min;
上述方法步骤3)中,所述透析用透析袋的截留分子量为3500Da,
在所述透析过程中,每6小时换水一次,直至透析液电导率不变;
所述透析后的液体与无水乙醇的体积比可为1︰4;
所述搅拌的时间可为5分钟;
所述静置过夜的温度可为4℃;
所述离心的条件可为5000rpm离心15-20分钟;
上述方法步骤4)中,溶解用水具体可为蒸馏水,
所述溶解还包括65℃下搅拌助溶直至液体表观均匀的操作;
所得猴头菇多糖粉末置于4℃中保存备用。
本发明的再一个目的是提供一种预防和/或治疗结肠癌的产品、抑制人结肠癌细胞生长的产品、抑制人结肠癌细胞克隆集落形成能力的产品、促进人结肠癌细胞发生凋亡的产品或诱导人结肠癌细胞在S期发生阻滞的产品。
本发明所提供的预防和/或治疗结肠癌的产品、抑制人结肠癌细胞生长的产品、抑制人结肠癌细胞克隆集落形成能力的产品、促进人结肠癌细胞发生凋亡的产品或诱导人结肠癌细胞在S期发生阻滞的产品,其活性成分为猴头菇多糖或者通过上述方法制备的猴头菇多糖。
所述产品可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织;或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候,在上述产品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
以所述猴头菇多糖为活性成分制备的预防和/或治疗结肠癌的产品、抑制人结肠癌细胞生长的产品、抑制人结肠癌细胞克隆集落形成能力的产品、促进人结肠癌细胞发生凋亡的产品或诱导人结肠癌细胞在S期发生阻滞的产品可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明通过细胞实验证明:猴头菇多糖可以有效抑制人结肠癌细胞HCT-116、DLD1、HT-29细胞的生长;可以显著抑制HCT-116细胞的克隆集落形成能力;可以促进人结肠癌HCT-116细胞发生凋亡;可以诱导HCT-116在-期发生阻滞;因此猴头菇多糖可在制备具有预防和/或治疗结肠癌作用的功能食品或药品中应用。
附图说明
图1为猴头菇多糖抑制人结肠癌HCT-116、DLD1、HT-29细胞存活率的实验图。
图2为猴头菇多糖抑制人结肠癌HCT-116细胞的克隆集落形成实验图。
图3为猴头菇多糖促进人结肠癌HCT-116细胞凋亡实验图。
图4为猴头菇多糖阻滞HCT-116细胞周期实验图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明,但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法;下述实施例中所用的试剂、生物材料等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下实施例中使用的猴头菇多糖,通过如下方法制备得到:
第一步:取过50℃干燥4h的猴头粉(过100目筛),加蒸馏水80℃浸提4h,6000rpm离心20分钟,弃去沉淀,浸提3次,合并上清液并减压蒸发浓缩至粘稠状。
第二步:向第一步中浓缩后的液体中加入质量百分浓度为21.9%的乙酸锌和质量百分浓度为10.6%的亚铁氰化钾,充分搅拌,室温下静置30分钟,然后6000rpm离心20min取上清液,减压蒸发浓缩至粘稠状;所述的乙酸锌、亚铁氰化钾和浸提液体积比为0.9︰0.9︰10;
第三步:将第二步减压蒸发得到的浓缩液透析(透析袋截留量为3500Da),每6小时换水一次,直至透析液电导率不变;向透析后的液体中加入无水乙醇,涡旋30分钟后4℃静置过夜,然后5000rpm离心15-20分钟,收集沉淀;所述的提取液和无水乙醇体积比为1︰4;
第四步:用少量蒸馏水将第三步所得到的沉淀物溶解,65℃下搅拌助溶,直至液体表观均匀,用冷冻干燥机对其进行冻干,得到干燥絮状的多糖粉末,置于4℃中保存。
实施例1、猴头菇多糖对人结肠癌细胞存活率的影响
采用MTT法研究了猴头菇多糖对HCT-116、DLD1、HT-29细胞活力的抑制作用。取对数生长期的人结肠癌细胞HCT-116、DLD1、HT-29,0.2%胰酶消化,以6000个/100μL的细胞密度接种于96孔板中,在37℃,5%CO2的培养箱中孵育24h。
细胞贴壁后,更换新鲜培养基,分别加入不同浓度的猴头菇多糖,每个浓度设5个复孔,同时设置空白对照组,在相同条件下继续孵育48h。吸掉旧培养基,PBS清洗2次,每孔加100μL的新鲜培养基,再加入20μL的MTT,继续孵育4h,吸掉孔中培养基,加入DMSO150μL,震荡10min,充分溶解结晶,并在570nm处测每孔的吸光度值。细胞存活率%=A实验组/A对照组X100%。
结果表明:与对照组相比,猴头菇多糖可以有效抑制结肠癌HCT-116、DLD1、HT-29细胞的增殖。猴头菇多糖对结肠癌HCT-116细胞的抑制作用尤为显著。
实施例2、猴头菇多糖对人结肠癌细胞HCT-116细胞细胞克隆的影响。
通过细胞克隆集落形成实验,进一步验证猴头菇多糖对HCT-116细胞的增殖能力的影响。
选取对数生长期的HCT-116细胞,用0.2%胰酶消化,按1000个/每孔的细胞密度接种于6孔细胞培养板里,37℃,5%CO2的培养箱中培养24h;细胞贴壁后,换新鲜培养基,分别加入不同浓度的猴头菇多糖,每个浓度设3个复孔,在相同条件下继续孵育6天。弃掉每孔的培养基,PBS清洗3次,室温条件下用免疫染色固定液固定细胞1h,0.1%结晶紫染色30min并在体视显微镜下观察HCT-116细胞克隆形成情况。
结果表明:猴头菇多糖对HCT-116细胞的克隆集落形成有明显抑制作用,显示了该多糖对HCT-116细胞增殖的长期抑制效果。随着猴头菇多糖浓度的增加,对HCT-116细胞的克隆集落形成的抑制作用愈发明显。
实施例3、细胞凋亡检测
分别用0、0.3、0.6mg/ml猴头菇多糖处理HCT-116细胞48h,采用Annexin V/PI双染法检测猴头菇多糖对细胞凋亡的影响。
结果显示0.3,0.6mg/ml猴头菇多糖处理后,HCT-116细胞的凋亡率分别为16.03±1.32%和29.75±0.96%,证实猴头菇多糖可诱导结肠癌HCT-116细胞发生凋亡(如图3A,3B,3C所示,图3A,3B,3C为流式细胞仪检测0,0.3,0.6mg/ml猴头菇多糖对人结肠癌HCT-116细胞诱导的细胞凋亡图;图3D表示猴头菇多糖对细胞凋亡率的影响)。
实施例4、细胞周期检测
分别用0、0.3、0.6mg/ml猴头菇多糖处理HCT-116细胞48h,70%预冷乙醇固定后,采用流式细胞仪检测猴头菇多糖对细胞周期的影响。
结果显示:猴头菇多糖可将HCT-116细胞阻滞在S期(如图4A,B,C所示,图4A,B,C表示流式细胞仪检测猴头菇多糖0,0.3,0.6mg/ml对人结肠癌HCT-116细胞的周期图,图4D表示各周期细胞所占比例)。
Claims (8)
1.猴头菇多糖在制备如下1)-5)的产品中的应用:
1)预防和/或治疗结肠癌的产品;
2)抑制人结肠癌细胞生长的产品;
3)抑制人结肠癌细胞克隆集落形成能力的产品;
4)促进人结肠癌细胞发生凋亡的产品;
5)诱导人结肠癌细胞在S期发生阻滞的产品。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:2)中,所述人结肠癌细胞为人结肠癌细胞HCT-116、DLD1、HT-29细胞中的至少一种;
3)中,所述人结肠癌细胞为人结肠癌细胞HCT-116;
4)中,所述人结肠癌细胞为人结肠癌细胞HCT-116;
5)中,所述人结肠癌细胞为人结肠癌细胞HCT-116。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述应用中,所述猴头菇多糖通过包括如下步骤的方法制备得到:
1)将猴头菇粉用水浸提,离心,收集上清液,将所得上清液减压蒸发浓缩至粘稠状;
2)向步骤1)中浓缩后的浸提液中加入乙酸锌水溶液和亚铁氰化钾水溶液,搅拌,静置,离心,收集上清液,将所得上清液减压蒸发浓缩至粘稠状,得到浓缩液;
3)将步骤2)得到的浓缩液透析,向透析后的液体中加入无水乙醇,搅拌,静置过夜,离心,收集沉淀;
4)用水将步骤3)所得沉淀溶解,冷冻干燥,得到猴头菇多糖粉末,即可。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:步骤1)中,所述浸提用水与猴头菇粉的配比为30-40ml:1g;
所述浸提的温度为80℃,时间为4h。
5.根据权利要求3或4所述的应用,其特征在于:步骤2)中,所述乙酸锌水溶液的质量百分浓度为21.9%;所述亚铁氰化钾水溶液的质量百分浓度为10.6%;
所述乙酸锌水溶液、亚铁氰化钾水溶液与浓缩后的浸提液的体积比为0.9:0.9:10;
所述静置的温度为室温,时间为30min;
所述离心的条件为6000rpm离心20min。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的应用,其特征在于:步骤3)中,所述透析用透析袋的截留分子量为3500Da;
所述透析后的液体与无水乙醇的体积比为1︰4;
所述搅拌的时间为5分钟;
所述静置过夜的温度为4℃;
所述离心的条件为5000rpm离心15-20分钟。
7.一种预防和/或治疗结肠癌的产品、抑制人结肠癌细胞生长的产品、抑制人结肠癌细胞克隆集落形成能力的产品、促进人结肠癌细胞发生凋亡的产品或诱导人结肠癌细胞在S期发生阻滞的产品,其活性成分为猴头菇多糖。
8.一种猴头菇多糖,所述猴头菇多糖通过包括如下步骤的方法制备得到:
1)将猴头菇粉用水浸提,离心,收集上清液,将所得上清液减压蒸发浓缩至粘稠状;
2)向步骤1)中浓缩后的浸提液中加入乙酸锌水溶液和亚铁氰化钾水溶液,搅拌,静置,离心,收集上清液,将所得上清液减压蒸发浓缩至粘稠状,得到浓缩液;
3)将步骤2)得到的浓缩液透析,向透析后的液体中加入无水乙醇,搅拌,静置过夜,离心,收集沉淀;
4)用水将步骤3)所得沉淀溶解,冷冻干燥,得到猴头菇多糖粉末,即可。
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