CN113307890A - 一种羊肚菌多糖及其低共熔溶剂提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种羊肚菌多糖及其低共熔溶剂提取方法。所示提取方法包括如下步骤：S1、将羊肚菌粉碎，采用低共熔溶剂进行超声提取，去除蛋白后进行透析，得到提取液；S2、所述提取液经醇沉后收集沉淀，经冷冻干燥即得到羊肚菌多糖；低共熔溶剂中，氢键受体为氯化胆碱，氢键供体为草酸。经本发明验证，羊肚菌多糖对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力均随浓度的增加而增强，本发明提取的多糖在高浓度下具有较好的抗氧化能力。经本发明实验验证，本发明方法提取的羊肚菌多糖对α‑葡萄糖苷酶和α‑淀粉酶均具有明显的抑制作用，且对α‑葡萄糖苷酶的抑制效果优于对α‑淀粉酶的抑制效果，具有降血糖活性。

Description

一种羊肚菌多糖及其低共熔溶剂提取方法
技术领域
本发明涉及一种羊肚菌多糖及其低共熔溶剂提取方法，属于多糖制备技术领域。
背景技术
传统多糖的提取方式多是热水抽提，以水为介质，存在费时、生产能耗高、活性组分易损失、得率低等缺陷。
低共熔溶剂(DES)作为一类新型绿色介质，由氢键受体和氢键供体按照一定比例混合构成，二者通过氢键相互结合，能够提供或接受外部电子或质子形成氢键，使得它们可以溶解多种物质。此外，低共熔溶剂不仅具有离子液体的良好性质，如热稳定性优异，与水和有机溶剂混溶，对各种有机化合物具有优异的溶解性和萃取性，而且原料易得，成本较低，制备简单，无污染。
梯棱羊肚菌(Morchella importuna)是一种名贵的大型药食用真菌，富含蛋白质、多糖、甾醇等多种生物活性物质，特别是羊肚菌多糖具有抗肿瘤、提高机体免疫力、降血脂、抗氧化、抗疲劳等功效，且无毒副作用。尽管羊肚菌多糖具有很好的生理活性，但其提取效率一直较低，制约了对羊肚菌多糖构效关系的研究及深度开发和利用。因此有必要提供一种提取效率高的羊肚菌多糖的提取方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用氯化胆碱和草酸制作的低共熔溶剂提取羊肚菌多糖的方法，该方法提取率高，成本低，能耗低，绿色环保，操作简单，制备的多糖总糖含量高，蛋白质等杂质少，糖醛酸含量高，是一种优良的提取方法
本发明所提供的羊肚菌多糖的提取方法，包括如下步骤：
S1、将羊肚菌粉碎，采用低共熔溶剂进行超声提取，去除蛋白后进行透析，得到提取液；
S2、所述提取液经醇沉后收集沉淀，经冷冻干燥即得到羊肚菌多糖。
步骤S1中，所述羊肚菌粉碎后过100目筛；
步骤S1中，所述低共熔溶剂中，氢键受体为氯化胆碱，氢键供体为草酸；所述低共熔溶剂的体积含水量为80～90％，优选90％；
本发明方法采用的氯化胆碱/草酸低共熔溶剂作为一种环境友好型的离子液体类似物，具有性质稳定、选择性强、价格低廉等优点。
所述低共熔溶剂中，所述氯化胆碱与所述草酸的摩尔比2～2.5：1，优选2：1。
步骤S1中，所述超声提取的温度为50～70℃，优选60℃，时间为20～40min，优选30min；
所述超声提取可在600W的条件下进行。
步骤S1中，所述羊肚菌与所述低共熔溶剂的料液比为1g：20～40mL，优选1g：30mL。
步骤S1中，采用亚铁氰化钾-乙酸锌法去除蛋白。
步骤S2中，采用乙醇进行醇沉；
具体可在真空条件下于-80℃的条件下进行冷冻干燥。
上述方法提取得到的羊肚菌多糖也属于本发明的保护范围。
本发明采用新型的绿色低共熔溶剂作为萃取剂，羊肚菌多糖提取率比传统的热水抽提法高4.5倍，多糖含量提高了26.18％，糖醛酸含量高了7.28％。相关研究表明，糖醛酸的含量与其抗氧化能力有关，经本发明验证，羊肚菌多糖对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力均随浓度的增加而增强，本发明提取的多糖在高浓度下具有较好的抗氧化能力。经本发明实验验证，本发明方法提取的羊肚菌多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均具有明显的抑制作用，且对α-葡萄糖苷酶的抑制效果优于对α-淀粉酶的抑制效果，具有降血糖活性。
附图说明
图1为不同类型DES提取率的比较。
图2为氯化胆碱-草酸体系中不同含水量对多糖提取率的影响。
图3为不同摩尔比的氯化胆碱-草酸体系对提取率的影响。
图4为提取时间对多糖提取率的影响。
图5为提取温度对多糖提取率的影响。
图6为料液比对多糖提取率的影响。
图7为各种因素对多糖提取率相互作用的响应面图和等高线图。
图8为羊肚菌多糖对DPPH自由基的清除率。
图9为羊肚菌多糖对ABTS自由基的清除率。
图10为羊肚菌多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
图11为羊肚菌多糖对α-淀粉酶的抑制率。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中各指标的测定方法如下：
羊肚菌多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法测量多糖含量。吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1mL标准葡萄糖溶液(0.1mg/mL)于试管中，用蒸馏水分别添加至2mL，取400μL标准葡萄糖溶液，加入200μL苯酚溶液(5％)和1mL硫酸后摇匀，在室温下静止10min，37℃反应20min，在490nm处测吸光值。以蒸馏水作为空白，平行测定3次，取平均值。以多糖浓度x为横坐标，吸光值y为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程：y＝12.621x+0.011R2＝0.999。准确吸取0.1mg/mL的羊肚菌多糖溶液400μL，按照上述方法进行显色反应后测定反应液的吸光度，将其代入上述回归方程，计算样品中多糖的含量。
羊肚菌多糖中还原糖含量的测定：分别量取葡萄糖溶液对照品0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml，以蒸馏水补充至2ml后摇匀，取0.5mL对照品加入1.5ml已经配制好的DNS溶液，摇匀后，经沸水浴5min后取出，之后用流动冷水速冷至室温后加4mL蒸馏水；以空白管为对照，540nm检测吸光度。以葡萄糖质量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线y＝1.6551x-0.1308R2＝0.9996。准确吸取4mg/mL的羊肚菌多糖溶液0.5mL，按照上述方法进行显色反应后测定反应液的吸光度，将其代入上述回归方程，计算样品中还原糖的含量。
羊肚菌多糖中蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝法测定蛋白质标准曲线。取0.1mg/mL牛血清蛋白标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，以蒸馏水补足至1mL，加入考马斯亮蓝溶液5mL，摇匀后静置5min，于595nm处测定反应液的吸光度。以蒸馏水作为空白，平行测定3次，取平均值。以牛血清蛋白浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，对其进行线性回归后得到回归方程y＝0.0079x+0.059R2＝0.9991。准确吸取4mg/mL的羊肚菌多糖溶液1mL，按照上述方法进行显色反应后测定反应液的吸光度，将其代入上述回归方程，计算样品中蛋白质的含量。
羊肚菌多糖中糖醛酸含量的测定：采用咔唑-硫酸法测定半乳糖醛酸标准曲线。分别精密吸取半乳糖醛酸(99μg/mL)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL溶液置于10mL于具塞试管中，各管加水至0.5mL，分别在冰水浴中加入四硼酸钠－硫酸溶液3mL，用漩涡混合器混匀，于沸水浴中加热5min，取出后立即冷却至室温，加0.1％咔唑溶液0.1mL，摇匀，煮沸5min，冷却至室温后在530nm处测定其吸光度。以浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，对其进行线性回归后得到回归方程y＝5.1306x-0.0195，R2＝0.9997。准确吸取0.25mg/mL的羊肚菌多糖溶液500μL，按照上述方法进行显色反应后测定反应液的吸光度，将其代入上述回归方程，计算样品中糖醛酸的含量。
羊肚菌多糖中总酚含量的测定：取0.1mg/mL的没食子酸溶液，然后配成0、20、100、150、200、300、400、500、600μg/mL的没食子酸标准液。取200μL标准液加入试管中，再依次加入800μL蒸馏水、200uL福林酚试剂，充分混合后避光保存6min，再加入2mL 7％Na2CO3溶液和1.6ml蒸馏水，在避光条件下放置90min后于760nm波长处测定吸光度。以多酚质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y＝1.8608x-0.0475，R2＝0.999。准确吸取2mg/mL的羊肚菌多糖溶液200μL，按照上述方法进行显色反应后测定反应液的吸光度，将其代入上述回归方程，计算样品中多酚的含量。
实施例1、羊肚菌多糖的提取
1)新鲜羊肚菌在50℃烘至恒重，粉碎后过100目筛，称1g羊肚菌粉末置于锥形瓶中，加入DES(料液比1:30)，放置在超声清洗仪中进行超声辅助提取，其中，超声温度为60℃，超声萃取的时间为30min；用亚铁氰化钾-乙酸锌法除蛋白后用截留分子量3500Da的透析袋透析48h。加入4倍体积的无水乙醇在4℃下放置12h，后离心(6000×g，15min)收集沉淀，冷冻干燥后得到粗多糖(MIP-UD)。
实施例2、
以与实施例1相同的过程，将氯化胆碱与草酸(2:1)、柠檬酸(2:1)、甘油(1:4)、1，4-丁二醇(1:4)、乙酰胺(1:2)、尿素(1:2)分别制成DES，含水量(质量)均为30％。提取结果如图1所示。
如图1所示，提取率的变化很大程度上取决于DES的组成，其中，采用氯化胆碱与草酸组成的DES多糖提取率最高。
实施例3、
以与实施例1相同的过程，将氯化胆碱与草酸低共熔溶剂(2:1)，分别配置10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的含水量。此外，本实施例还采用了水作为萃取剂作为对照组，提取结果如图2所示。
如图2所示，DES含水量在90％时多糖提取率最高。考虑到含水量低，粘度高，会对提纯造成困难且造成资源浪费：含水量高，可以节省成本提高提取率，因此采用DES含水量80％或90％最适宜。
实施例4、
以与实施例1相同的过程，但采用氯化胆碱-草酸体系进行，其中，氯化胆碱和草酸的摩尔比分别为1.5:1、2:1、2.5:1、3:1和3.5:1。DES中添加30wt％的水，在超声功率600W中提取羊肚菌多糖，其中固定提取温度为60℃、提取时间为40min、料液比为20:1，提取结果如图3所示。
如图3所示，考虑到节约成本，氯化胆碱与草酸摩尔比在3:1、3.5:1时，醇沉过程中有大量结晶出现，因此采用DES摩尔比2:1最合适。
实施例5、
以与实施例1相同的过程，但采用不同反应条件进行，其中，DES中添加30wt％的水，在超声功率600W中提取羊肚菌多糖，其中固定提取温度为60℃、料液比为20:1，提取时间分别为10、20、30、40、50min，提取结果如图4所示。
如图4所示，多糖提取率随超声时间的增长呈先增后减的趋势，超声时间30min时多糖的提取率最高。因此选用超声时间30min最合适。
实施例6、
以与实施例1相同的过程，但采用不同反应条件进行，其中，DES中添加30wt％的水，在超声功率600W中提取羊肚菌多糖，其中固定提取时间40min、料液比20:1，提取温度分别为40、50、60、70、80℃，提取结果如图5所示。
如图5所示，多糖提取率随超声温度的增长呈先增后减的趋势，温度为60℃时多糖的提取率最高。因此选用提取温度为60℃最合适。
实施例7、
以与实施例1相同的过程，但采用不同反应条件进行，其中，DES中添加30wt％的水，在超声功率600W中提取羊肚菌多糖，其中固定提取时间为40min、提取温度为60℃，料液比(mL/g)分别为：10:1、20:1、30:1、40:1、50:1的条件下，提取结果如图6所示。
如图6所示，当料液比为1：30(g/mL)时，多糖提取率最大，高黏度的DES会阻碍超声波的作用，使提取率降低。因而，从提取率及成本等方面考虑，料液比以1：30(g/mL)为宜。
实施例8、
根据单因素试验的结果，确定了提取时间(A)、提取温度(B)、料液比(C)为独立变量，以多糖的提取率为响应值(Y)，利用Box-Behnken的中心组合试验设计原理进行实验设计，优化提取工艺，设计3因素3水平试验，共17组试验点，做出响应面图，建模并分析各因素对响应值的影响，如表1和表2所示。
表1Box-Behnken试验设计
Figure BDA0003100601880000051
表2响应面试验结果
Figure BDA0003100601880000061
利用Design-Expert10.07软件，对表2中的数据进行多元回归模型拟合，获得羊肚菌多糖提取率(Y)对应编码自变量的二次多项式回归方程：Y＝5.84+0.19A+0.37B+0.14C0.23AB+0.005976AC-0.097BC-0.60A2-0.76B2-0.24C2。
表3响应面二次模型方差分析
Figure BDA0003100601880000062
Figure BDA0003100601880000071
注：**为差异极显著(p<0.01)；*为差异显著(p<0.05)
由表3可知：一次项A、B差异极显著(P＜0.01)；二次项AB差异极显著(P＜0.01)；A2、B2、C2影响极显著(P＜0.01)；失拟项不显著(P＞0.05)。模型R2＝0.9854，R2 adj＝0.9665，说明该方程与实际情况拟合良好，可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。根据F值可知各因素对多糖提取率影响程度大小顺序为：提取温度＞超声时间＞料液比。
如图7所示，提取温度和超声时间的交互作用对羊肚菌多糖的提取率影响极显著，图d等高线近似圆形，说明超声时间和料液比的交互作用对羊肚菌多糖的提取率影响不显著。提取时间和料液比的交互作用对羊肚菌多糖的提取率有影响，但是影响不显著。
模型验证：利用Design-Expert软件，提取过程中自变量和响应变量的最优条件为：提取时间31.2min、提取温度62.1℃、料液比1:32.5(g/mL)，最大预测提取率为5.91％。在此最佳提取条件下，进行了三次验证实验，MIP-UD提取率为(5.93±0.07)％。该值与预测的MIP-UD提取率相当一致，表明回归模型对于预测MIP-UD提取率是准确和适当的。
对比例1、
以与实施例1相同的过程，采用传统的热水抽提的方法来提取多糖。将1g烘干后羊肚菌子实体粉末加入30mL蒸馏水中，在80℃下抽提2h。先用亚铁氰化钾-乙酸锌法除去蛋白质(样品：亚铁氰化钾：乙酸锌的体积比为10:1:1)，离心所得上清液用3500Da透析袋在蒸馏水中透析48h。然后加入4倍体积的无水乙醇，在4℃下沉淀12h，离心取沉淀(6000×g，15min)。最后沉淀用蒸馏水复溶并冷冻干燥得到水提的粗多糖(MIP-W)。
对比例2、
新鲜羊肚菌在50℃烘至恒重，粉碎后过100目筛，称1g羊肚菌粉末置于锥形瓶中，加入DES(料液比1:30)，萃取时间为30min；用亚铁氰化钾-乙酸锌法除蛋白后用截留分子量3500Da的透析袋透析48h。加入4倍体积的无水乙醇在4℃下放置12h，后离心(6000×g，15min)收集沉淀，冷冻干燥后得到粗多糖(MIP-D)。
羊肚菌多糖提取率的计算
Figure BDA0003100601880000081
公式中：C是多糖浓度(mg/mL)，D是稀释倍数，V是多糖溶解后的溶液体积(mL)，M是样品的质量(g)。
对比例1、对比例2和实施例1的提取效果如表4所示。
表4不同提取方法中羊肚菌多糖的得率和化学组成
Figure BDA0003100601880000082
由表4可知，采用DES结合超声波提取多糖的提取率(5.93％)比热水提取率(1.33％)高4.5倍，多糖含量高26.18％，糖醛酸含量高7.28％；与对比例2(未超声辅助仅DES提取的方法)相比，提取率(2.57％)高2.3倍，多糖含量高60.97％，糖醛酸含量高18.15％。
相关研究表明，糖醛酸的含量与其抗氧化能力有关，下面测定羊肚菌多糖的抗氧化性和降血糖活性。
一、体外抗氧化性的测定
1、DPPH自由基清除率测定
将Vc与多糖溶液分别配置成浓度为0.25、0.5、1、2、4mg/mL的待测溶液，取1mL待测溶液加入1mL 0.1mmoL/L DPPH溶液，混匀后在室温下避光保存30min，然后再517nm处测吸光值，每组试验重复3次。按以下公式计算DPPH自由基清除率：
Figure BDA0003100601880000091
公式中，A0是对照组的吸光值(蒸馏水代替样品溶液)，A1是待测溶液和DPPH混合物的吸光值，A2是待测溶液和甲醇混合后的吸光值(DPPH溶解在甲醇中)。
2、ABTS自由基清除率测定
使用酶标仪严格按照ABTS自由基清除能力检测试剂盒测定羊肚菌多糖对ABTS自由基的清除能力。
由图8和图9可知，羊肚菌多糖对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力均随浓度的增加而增强，DES提取的多糖在高浓度下具有较好的抗氧化能力。
二、降血糖活性的测定
1、体外α-淀粉酶抑制效果的测定
将200μL不同浓度(分别为0.1、0.25、0.5、1、2mg/mL)的样品与100μL的α-淀粉酶溶液(5U/mL，溶于0.1M、pH 6.8的磷酸盐缓冲液中)混合，在37℃下反应10min，然后向混合物中加入100μL的可溶性淀粉(0.5％，w/v)，在37℃反应10min。随后，加入1.6mL的DNS在沸水浴中反应5min。最后，在540nm处测量吸光值。阿卡波糖作阳性对照。α-淀粉酶抑制活性公式如下：
Figure BDA0003100601880000092
式中，AS是样品、淀粉溶液、α-淀粉酶和DNS试剂的混合物的吸光值；Asc是样品、淀粉溶液、磷酸盐缓冲液(代替α-淀粉酶)和DNS试剂混合物的吸光值；Ab是磷酸盐缓冲液(代替样品)、淀粉溶液、α-淀粉酶和DNS试剂的混合物的吸光值，Abc是磷酸盐缓冲液(代替样品和α-淀粉酶)、淀粉溶液、DNS试剂的混合物的吸光值。
2、体外α-葡萄糖苷酶抑制效果的测定
将200微升不同浓度(分别为0.1、0.25、0.5、1、2mg/mL)的样品分别与100微升α-葡萄糖苷酶溶液(0.5U/mL，溶于0.1M、pH 6.8的磷酸盐缓冲液中)混合，在37℃下反应10min，然后向混合物中加入200微升的PNPG(5mmoL/L，溶于0.1M，pH 6.8磷酸盐缓冲液中)，在37℃下反应10min，最后在405nm处测吸光值，阿卡波糖标准作阳性对照。α-葡萄糖苷酶抑制活性公式如下：
Figure BDA0003100601880000093
式中，AS是样品、α-葡萄糖苷酶和PNPG试剂的混合物的吸光值；Asc是样品、磷酸盐缓冲液(代替α-葡萄糖苷酶)和PNPG试剂混合物的吸光值；Ab是磷酸盐缓冲液(代替样品)、α-葡萄糖苷酶和PNPG试剂的混合物的吸光值，Abc是磷酸盐缓冲液(代替样品和α-葡萄糖苷酶)和PNPG试剂的混合物的吸光值。
由图10可知，DES法提取的多糖和热水提取的多糖对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制作用，显著性分析表明DES提取的多糖抑制作用较强。
由图11可知，两种多糖对α-淀粉酶有明显的抑制作用，IC50表明DES提取的多糖抑制效果较好。从图10、图11对比来看，羊肚菌多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制效果优于对α-淀粉酶的抑制效果。

Claims (9)

1.一种羊肚菌多糖的提取方法，包括如下步骤：
S1、将羊肚菌粉碎，采用低共熔溶剂进行超声提取，去除蛋白后进行透析，得到提取液；
S2、所述提取液经醇沉后收集沉淀，经冷冻干燥即得到羊肚菌多糖。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤S1中，所述低共熔溶剂中，氢键受体为氯化胆碱，氢键供体为草酸。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于：所述低共熔溶剂的体积含水量为80～90％。
4.根据权利要求2或3所述的提取方法，其特征在于：所述低共熔溶剂中，所述氯化胆碱与所述草酸的摩尔比2～2.5：1。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的提取方法，其特征在于：步骤S1中，所述超声提取的温度为50～70℃，时间为20～40min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的提取方法，其特征在于：步骤S1中，所述羊肚菌与所述低共熔溶剂的料液比为1g：20～40mL。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的提取方法，其特征在于：步骤S2中，采用乙醇进行醇沉。
8.权利要求1-7中任一项所述方法制备的羊肚菌多糖。
9.权利要求8所述羊肚菌多糖在制备抗氧化性产品和/或降血糖产品中的应用。
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