CN115215947B - 一种提取分离葡萄籽多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提取葡萄籽多糖的方法，该方法包括步骤：先将葡萄籽粉末、硫酸铵溶液和低共熔溶剂混合后，提取，离心，收集下相，透析后得到葡萄籽多糖；收集上相，先加入聚醚胺D‑230溶液或氢氧化钠溶液，充分混匀后离心，除去上相，收集下相；向得到的下相溶液中加入盐酸溶液，混合后离心，收集上相，得到回收的低共熔溶剂；所述低共熔溶剂由氢键供体和氢键受体混合制成，所述氢键供体为月桂酸、苄索氯铵中的一种，所述氢键受体为辛酸、壬酸、癸酸中的一种。本发明通过特定的低共熔溶剂与硫酸铵溶液作为溶剂构建多相体系，可快速提取葡萄籽多糖，且提取率高；并通过特定的方式分离低共熔溶剂和杂质，可实现低共熔溶剂的循环使用。
Description
技术领域
本发明涉及葡萄籽多糖提取领域，更具体地，涉及一种提取分离葡萄籽多糖的方法。
背景技术
多糖是一类普遍存在于生物体的活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫增强、降血糖、降血脂等生物学功能，临床上被用于治疗多种疾病。多糖的抗氧化性与其抗肿瘤、抗炎、降血糖、降血脂等功能密切相关，因此对其抗氧化性的研究有助于阐明多糖多种生物功能的作用机理。氧化应激是导致细胞结构及功能损伤的重要原因，越来越多的研究证实许多植物提取物具有很强的抗氧化活性，可对抗细胞氧化应激。
研究表明，葡萄籽含有多种成分，如不饱和脂肪酸、多糖、原花青素等。葡萄籽多糖(Grape seed polysaccharide,GSP)是葡萄籽中重要的生物活性成分，经研究表明，其具有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、降血压和抗氧化等功能。
目前提取多糖的方法主要有热水提取、碱提取和酶辅助提取。热水提取法因其安全、成本低而成为目前最常用的多糖提取方法。但该方法提取率低，杂质含量高，提取时间长；此外，需要在较高温度下提取，但高温会破坏多糖的结构，影响多糖活性。碱提取法提取效率高，但大规模使用后产生的碱性废液易对环境造成污染。酶辅助提取效率高，条件温和，但成本高。因此，有必要开发一种绿色、高效的提取方法。
低共熔溶剂(Deep eutectic solvents,DESs)是一类低共熔混合物，通常由氢键受体(如氯化胆碱)和氢键供体(如尿素)组成。氢键受体和氢键供体之间的氢键相互作用是形成DESs的最重要因素。DESs 具有无挥发性、制备简单、成本低、提取效率高等优点。有相关报道将低共熔溶剂替代传统的有机溶剂用于植物多糖提取，如熊苏慧等使用氯化胆碱和1,3-丁二醇等制备的低共熔溶剂用于千斤拔多糖提取。
但是，葡萄籽中油脂含量高达12～15wt.％，现有方法中提取葡萄籽多糖，还需要去除其中油脂，如专利CN 201611185409.0公开了通过物理助剂和葡萄籽粗粉进行超微研磨获得微切助粉，然后用石油醚去除微切助粉中油脂，再超声辅助乙醇提取后经蒸馏等得到葡萄籽提取物(即葡萄籽多糖)，但该方法流程复杂，且提取率低。
发明内容
基于此，本发明提供了一种提取葡萄籽多糖的方法，通过特定的低共熔溶剂与硫酸铵作为溶剂构建多相体系，可快速提取葡萄籽多糖，且提取率高；并通过特定的方式分离低共熔溶剂和杂质，可实现低共熔溶剂的循环使用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种提取分离葡萄籽多糖的方法，包括以下步骤：
步骤S1、将葡萄籽粉末、硫酸铵溶液和低共熔溶剂混合后，进行提取，离心，形成三相，收集下相，透析后得到葡萄籽多糖；
步骤S2、将所述三相中的上相和中相分离后，收集上相，得到上相溶液；在所述上相溶液中加入聚醚胺D-230溶液或氢氧化钠溶液，充分混匀后离心，生成两相，除去上相，收集下相，得到下相溶液；
步骤S3、向步骤S2中得到的所述下相溶液中加入盐酸溶液，混合后离心，再收集上相，得到再生的低共熔溶剂；
步骤S1中，所述低共熔溶剂由氢键供体和氢键受体混合制成，所述氢键供体为月桂酸、苄索氯铵中的一种，所述氢键受体为辛酸、壬酸、癸酸中的一种。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述氢键供体和氢键受体的摩尔比为1～3:1。
在一些实施方式中，步骤S1中，提取时间为2～16min。
在一些实施方式中，步骤S1中，提取温度为20～70℃。
在一些实施方式中，所述硫酸铵浓度为5～40wt.％。
在一些实施方式中，步骤S1中，液固比为10mL:1g～35mL:1g。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述低共熔溶剂和所述硫酸铵溶液的体积比为0.5～2.5:1。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述聚醚胺D-230溶液的质量分数为5～10％。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述聚醚胺D-230溶液和所述上相溶液的体积比为1：1～5：1。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述氢氧化钠溶液的浓度为 1mol/L。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述上相溶液和所述氢氧化钠溶液的体积比为1：5。
在一些实施方式中，步骤S3中，所述盐酸的浓度为10～12mol/L。加入盐酸的作用在于中和所述下相溶液中的碱，加入量以完全中和碱为准。
相较于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明通过将特定的低共熔溶剂和硫酸铵溶液混合构建多相体系用于提取葡萄籽多糖，可快速并高效地提取葡萄籽多糖，减少了分离油脂的步骤，简化了提取步骤，而且提取率高。
此外，本发明的方法还包括了回收低共熔溶剂的步骤，可以使低共熔溶剂在多次循环后仍保持优异的提取效果，有利于实现溶剂的循环使用，不仅减少了原料消耗，降低了生产成本，而且减少了对环境污染，绿色环保。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
下述实施例中，所用葡萄籽购买于中国新疆维吾尔自治区。
如图1所示，本发明提供了一种提取葡萄籽多糖的方法，包括以下步骤：
步骤S1、将葡萄籽粉末、硫酸铵溶液和低共熔溶剂混合后，进行提取，离心，形成三相，收集下相，透析后得到葡萄籽多糖；
步骤S2、将步骤S1中所述三相的上相和中相分离后，收集上相，然后加入聚醚胺D-230溶液或氢氧化钠溶液，充分混匀后离心，生成两相，除去上相，收集下相，得到下相溶液；
步骤S3、向步骤S2中得到的下相溶液中加入盐酸溶液，混合后离心，再收集上相，得到回收的低共熔溶剂。
实施例1-5
实施例1-5采用上述步骤S1的方式提取葡萄籽多糖，具体为：将葡萄籽粉末、硫酸铵溶液和低共熔溶剂充分混合后，离心，形成三相，收集下相，经透析得到葡萄籽多糖；其中，所述提取时间为10min，提取温度为50℃，硫酸铵溶液浓度为30wt.％，液固比为20mL:1g；每个实施例使用的低共熔溶剂组分和配比如下表1所示；实施例1-5对葡萄籽多糖的提取率如下表1所示。
表1具体低共熔溶剂种类及提取效果
上述实施例中，低共熔溶剂的制备方法为：将氢键供体和氢键受体按摩尔比混合后，在70～100℃的温度下进行搅拌，得到均一溶液，即得低共熔溶剂。
实施例6-13
实施例6-13的提取方法和实施例1的提取方法相同，区别在于，提取时间不同，具体如下表2所示。
表2不同提取时间及提取效果
| 实施例 | 提取时间(min) | 多糖提取率(mg/g) |
| 6 | 2 | 79.52 |
| 7 | 4 | 79.65 |
| 8 | 6 | 81.01 |
| 9 | 8 | 82.13 |
| 10 | 10 | 83.80 |
| 11 | 12 | 81.28 |
| 12 | 14 | 80.99 |
| 13 | 16 | 80.97 |
实施例14-19
实施例14-19的提取方法和实施例10的相同，区别在于，提取温度不同，具体提取温度和提取效果如下表3所示。
表3不同提取温度和提取效果
| 实施例 | 提取温度(℃) | 多糖提取率(mg/g) |
| 14 | 20 | 82.82 |
| 15 | 30 | 85.32 |
| 16 | 40 | 83.96 |
| 17 | 50 | 83.50 |
| 18 | 60 | 83.49 |
| 19 | 70 | 83.10 |
实施例20-27的提取方法和实施例15的相同，区别在于，硫酸铵溶液的浓度不同，具体如下表4。
表4不同硫酸铵溶液的浓度和提取效果
| 实施例 | 硫酸铵浓度(wt％) | 多糖提取率(mg/g) |
| 20 | 5 | 79.28 |
| 21 | 10 | 80.93 |
| 22 | 15 | 84.55 |
| 23 | 20 | 86.91 |
| 24 | 25 | 89.88 |
| 25 | 30 | 85.44 |
| 26 | 35 | 81.05 |
| 27 | 40 | 77.40 |
实施例28-33
实施例28-33的提取方法和实施例24的相同，区别在于，液固比不同，具体液固比和提取效果如下表5所示。
表5不同液固比和提取效果
| 实施例 | 液固比(mL：g) | 多糖提取率(mg/g) |
| 28 | 10:1 | 83.93 |
| 29 | 15:1 | 84.43 |
| 30 | 20:1 | 88.66 |
| 31 | 25:1 | 91.38 |
| 32 | 30:1 | 94.54 |
| 33 | 35:1 | 90.10 |
实施例34-38
实施例34-38的提取方法和实施例32的相同，区别在于，低共熔溶剂和硫酸铵溶液的体积比不同，具体体积比和提取效果如下表6所示。
表6不同上下相体积比和提取效果
综上所述，本发明中，对葡萄籽进行多糖提取的最优方案为：
将葡萄籽粉末、低共熔溶剂和硫酸铵溶液充分混合后，离心，形成三相，收集下相；其中，所述提取时间为10min，提取温度为30℃，硫酸铵溶液的浓度为25wt％，液固比为30mL:1g，低共熔溶剂和硫酸铵溶液的体积比为1:1；低共熔溶剂通过以下方法制备：将月桂酸和辛酸按摩尔比为1:1混合后，在70～90℃的温度下搅拌均匀，得到均一溶液(即低共熔溶剂)。
对比例1
以叔丁醇为溶剂进行葡萄籽多糖提取，方法为：将葡萄籽粉末、硫酸铵溶液和叔丁醇充分混合后，离心，形成三相，收集下相，透析后得到葡萄籽多糖；其中，所述提取时间为10min，提取温度为50℃，硫酸铵溶液浓度为30wt.％，液固比为20mL:1g，上下相的体积比为1:1。
测定本发明实施例35和对比例1得到的葡萄籽多糖的分子量和单糖组成，具体方法为：采用高效液相色谱RID和TSKqel GMPWXL水凝胶柱联用测定葡萄籽多糖的分子量；采用终极3000高效液相色谱系统与Xtimat柱联用分析葡萄籽多糖的主要单糖组成，测试结果分别如表6和表7所示。
表7葡萄籽多糖的分子量分布
表8葡萄籽多糖的主要单糖组成
验证回收得到的低共熔溶剂的循环稳定性，具体如下：
采用实施例35的方法提取葡萄籽多糖，将上相和中相分离后，收集上相，得到第一上相溶液；将得到的第一上相溶液按实施例35的方法经25次循环提取葡萄籽多糖后，收集上相，得到第二上相溶液(即得到回收的含杂质的低共熔溶剂)；
按照本发明的方法中步骤S2和S3的方法回收低共熔溶剂，具体如下：
按第二上相溶液：聚醚胺D-230溶液的体积比为1：5向第二上相溶液中加浓度为10wt.％的聚醚胺D-230溶液，充分混匀后离心，去除上相，收集下相，得到下相溶液，再向下相溶液中滴加浓度为12mol/L 的盐酸溶液，直至下相溶液中的碱完全被中和，然后离心，收集上相，即得到再生的低共熔溶剂，将再生的低共熔溶剂与硫酸铵溶液混合后再次对葡萄籽粉末进行多糖提取，循环使用时的提取方法和实施例35 的相同，再生的低共熔溶剂对葡萄籽多糖的提取效果如下表9所示。
表9低共熔溶剂的循环稳定性测试结果
| 循环次数 | 多糖提取率(mg/g) |
| 1 | 97.89 |
| 5 | 97.41 |
| 10 | 94.24 |
| 15 | 90.02 |
| 20 | 88.18 |
| 25 | 84.21 |
| 再生的低共熔溶剂 | 97.55 |
需要说明的是，本发明中，为说明对回收的低共熔溶剂的处理方法循环使用的效果，对经25次循环使用后的低共熔溶剂进行处理后再生，并不代表仅能用于经多次循环后回收的低共熔溶剂，事实上，可以根据实际情况对回收的低共熔溶剂进行处理去除杂质以实现其再生。
测定通过本发明的方法得到的葡萄籽多糖对DPPH自由基的抗氧化活性，具体如下：
利用北京索莱宝科技有限公司的DPPH自由基清除能力检测试剂盒分析葡萄籽多糖对DPPH自由基的清除活性。测定抗氧化活性的原理是：DPPH自由基有单电子，其醇溶液呈紫色，在515nm处有强吸收，当抗氧化剂存在时，DPPH自由基被清除，其溶液变浅，515nm的吸光度下降，在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比，因此可通过吸光度下降的程度来反映样本清除DPPH自由基的能力。将本申请得到的葡萄籽多糖(GSP-D)、叔丁醇提取得到的葡萄籽多糖(GSP-T)和维C分别配制不同浓度溶液进行DPPH自由基抗氧化活性测试，测试结果如下表10所示。
表10不同葡萄籽多糖的抗氧化活性
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种提取分离葡萄籽多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、将葡萄籽粉末、硫酸铵溶液和低共熔溶剂混合后，进行提取，离心，形成三相，收集下相，透析后得到葡萄籽多糖；
步骤S2、将所述三相中的上相和中相分离后，收集上相，得到上相溶液；在所述上相溶液中加入聚醚胺D-230溶液或氢氧化钠溶液，充分混匀后离心，生成两相，除去上相，收集下相，得到下相溶液；
步骤S3、向步骤S2中得到的所述下相溶液中加入盐酸溶液，混合后离心，再收集上相，得到再生的低共熔溶剂；
所述低共熔溶剂由氢键供体和氢键受体混合制成，所述氢键供体为月桂酸、苄索氯铵中的一种，所述氢键受体为辛酸、壬酸、癸酸中的一种；
步骤S1中，所述氢键供体和氢键受体的摩尔比为1~3:1。
2.根据权利要求1所述的提取分离葡萄籽多糖的方法，其特征在于，步骤S1中，提取时间为2~16min。
3.根据权利要求1所述的提取分离葡萄籽多糖的方法，其特征在于，步骤S1中，提取温度为20~70℃。
4.根据权利要求1所述的提取分离葡萄籽多糖的方法，其特征在于，步骤S1中，所述硫酸铵溶液浓度为5~40wt.%。
5.根据权利要求1所述的提取分离葡萄籽多糖的方法，其特征在于，步骤S1中，液固比为10mL:1g~35mL:1g。
6.根据权利要求1所述的提取分离葡萄籽多糖的方法，其特征在于，步骤S1中，所述低共熔溶剂和所述硫酸铵溶液的体积比为0.5~2.5:1。
7.根据权利要求1所述的提取分离葡萄籽多糖的方法，其特征在于，步骤S2中，所述聚醚胺D-230溶液的质量分数为5~10%；和/或，所述聚醚胺D-230溶液和所述上相溶液的体积比为1：1~5：1。
8.根据权利要求 1所述的提取分离葡萄籽多糖的方法，其特征在于，步骤S2中，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L；和/或，所述上相溶液和所述氢氧化钠溶液的体积比为1：5。
9.根据权利要求1所述的提取分离葡萄籽多糖的方法，其特征在于，步骤S3中，所述盐酸的浓度为10~12mol/L。
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