CN115160450A - 鳞杯伞多糖的快速制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鳞杯伞多糖的快速制备方法及其应用。利用超声辅助低共熔溶剂提取鳞杯伞子实体多糖，多糖得率显著高于传统的水提法。流变学特性研究表明制得的D‑CSFP溶液具有典型的假塑性非牛顿流体的剪切稀化特性，可作为一种新型的水胶体应用于食品等行业。抗氧化和抗炎活性结果表明D‑CSFP能够缓解RAW264.7细胞的氧化损伤和炎症损伤，可作为一种具有生物活性的功能食品应用到食品加工产业。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及鳞杯伞多糖的快速制备方法及其应用。
背景技术
台蘑属于山西省特色食用菌，通常指的是生长在五台山的优质食用菌，其主要种类有台蘑小香蕈、黑水皮香蕈、银盘蘑菇、虎皮香蕈、秋露白等(郭东东，雷佳钰，彭志杰，等.鳞杯伞子实体多糖提取工艺优化及其结构与理化性质[J].食用菌学报，2021，28(4):39-47)；其中，黑水皮香蕈学名鳞杯伞Clitocybe squamulosa(Pers.)P.Kumm.隶属担子菌门Basidiomycota，伞菌纲Agaricomycetes，伞菌目Agaricales，未定科(左宁柯，徐丽婧，常明昌，等.鳞杯伞α-半乳糖苷酶的提取纯化及酶学性质研究[J].菌物学报，2022，1-15.)。鳞杯伞子实体营养极为丰富，且富含多糖和蛋白质等多种活性成分，具有降低胆固醇，提高免疫力等多种生物活性(郭东东，雷佳钰，刘荣柱，等.体外模拟鳞杯伞子实体碱溶性多糖的消化与酵解特性[J].菌物学报，2022，41(1):78-87.)。已有实验研究表明，水提鳞杯伞多糖具有良好的流变学特性；鳞杯伞子实体碱溶性多糖具有良好的消化酵解特性[郭东东，雷佳钰，彭志杰，等.鳞杯伞子实体多糖提取工艺优化及其结构与理化性质[J].食用菌学报，2021，28(4):39-47；郭东东，雷佳钰，刘荣柱，等.体外模拟鳞杯伞子实体碱溶性多糖的消化与酵解特性[J].菌物学报，2022，41(1):78-87.]。
近年来，对多糖提取方法的研究受到国内外学者广泛关注。热水提取作为传统的鳞杯伞多糖提取方法虽然简单易行，但提取时间长、溶剂量大、提取温度高，阻碍了其广泛的商业应用，而酸提和碱提可能会对多糖的结构造成破坏，影响多糖的大规模提取[CAICY,WANG YN,YU W,et al.Temperature-responsive deep eutectic solvents as greenand recyclable media for the efficient extraction ofpolysaccharides fromGanoderma lucidum[J],Journal ofcleanerproduction,2020,274；WUYJ,WEI ZX,ZHANGFM,et al.Structure,bioactivities and applications of the polysaccharides fromTremella fuciformis mushroom:A review[J].International Journal of BiologicalMacromolecules,2019,121:1005–1010]。在生物活性物质的提取过程中，绿色提取已经成为了主流。
低共熔溶剂(deep eutectic solvents，DESs)是一种新型的萃取溶剂，其具有价格低廉、制备方便、可降解、无毒害和绿色环保等多种优点[ZENG J,DOUYQ,YANN,etal.Optimizing Ultrasound-Assisted Deep Eutectic Solvent Extraction ofBioactive Compounds from Chinese WildRice[J].Molecules,2019,24(15)。DESs通常由氢键受体和氢键供体组成，由这些组分组成的共晶混合物的熔点低于各组分的熔点[ZENGJ,DOU YQ,YAN N,et al.Optimizing Ultrasound-Assisted Deep Eutectic SolventExtraction of Bioactive Compounds from Chinese Wild Rice[J].Molecules,2019,24(15)；TAN T,ZHANG ML,WAN YQ,et al.Utilization ofdeep eutectic solvents asnovel mobile phase additives for improving the separation ofbioactivequaternary alkaloids[J].Talanta,2016,149:85-90]。目前，关于DESs提取活性多糖的研究越来越多，Wu等[WU DT,FENG KL,HUANG L,et al.Deep Eutectic Solvent-AssistedExtraction,Partially Structural Characterization,and Bioactivities ofAcidicPolysaccharides from Lotus Leaves[J].Foods,2021,10(10).]使用以氯化胆碱和乙二醇组成的DESs提取荷叶多糖，提取率可达5.38％，显著高于传统水提方式(3.22％)。Zhang等[ZHANG WD,CHENG SB,ZHAI XN,et al.Green and Efficient ExtractionofPolysaccharides From Poriacocos FAWolfby Deep Eutectic Solvent[J].NaturalProduct Communications,2020,15(2).]通过使用氯化胆碱和草酸合成的DESs提取茯苓多糖，获得的多糖浸提率比热水浸提率高8.6倍。Zhang等[ZHANG LJ,WANG MS.Optimizationof deep eutectic solvent-based ultrasound-assisted extraction ofpolysaccharides from Dioscorea opposita Thunb[J].International Journal ofBiological Macromolecules,2017,95:675-681]使用超声辅助DESs提取的山药多糖的提取率比传统水提法的提取率高52.05％。总之，使用DESs提取多糖已开始逐渐被广泛应用，绿色高效提取开始成为多糖提取的一种重要方式。然而以DESs作为提取溶剂来提取鳞杯伞多糖的研究尚未报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种鳞杯伞多糖的快速制备方法。
本发明所提供的鳞杯伞多糖的快速制备方法，包括如下步骤：
1)将鳞杯伞子实体干燥、粉碎后过筛；
2)将氯化胆碱(氢键受体)与多元醇、酸和酰胺(氢键供体)中的至少一种在80℃水浴中按一定摩尔比混合，搅拌直至完全溶解，在室温下形成无色透明的液体，即低共熔溶剂；
3)将所得鳞杯伞子实体粉末与所述低共熔溶剂混合，超声浸提，将所得浸提液离心取上清液，去除所得上清液中的蛋白质，离心，取上清液，蒸馏水透析(截留分子量3500Da)，然后醇沉，离心，收集沉淀，适量蒸馏水溶解沉淀，冻干，即得DESs提取的鳞杯伞多糖(D-CSFP)。
上述方法步骤1)中，所述过筛为过100目筛；
上述方法步骤2)中，所述多元醇具体可为1,4-丁二醇、乙二醇、丙三醇中的一种或几种的混合物；
所述酸具体可为乳酸、草酸二水、柠檬酸中的一种或几种的混合物；
所述酰胺具体可为乙酰胺、尿素中的一种或两种的混合物；
其中，氯化胆碱与多元醇、酸和酰胺中的至少一种的摩尔比可为2:1-8；优选将摩尔比2:1的氯化胆碱与草酸二水混合；
所述低共熔溶剂的含水量为30％-70％(v/v)，优选60％(v/v)；
上述方法步骤3)中，料液比(g/mL)可为1:10-30，即，每克鳞杯伞子实体粉末中加入10-30mL的低共熔溶剂，优选1:20-25，更优选1:24；
所述超声浸提的温度可为60-80℃，优选70-75℃，更优选75℃；时间可为30-50min，优选40min；
通过亚铁氰化钾-乙酸锌法去除上清液中的蛋白质；
所述醇沉的操作为向所得上清液中加入无水乙醇，4℃静置过夜，即可，其中，上清液与无水乙醇的体积比可为1:4；
所述离心的条件均为：6500r/min离心15min。
由上述方法制备得到的DESs提取的鳞杯伞多糖(D-CSFP)也属于本发明的保护范围。
所述DESs提取的鳞杯伞多糖(D-CSFP)含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、盐酸氨基葡萄糖、木糖，摩尔比依次为6.53:2.04:1.23:0.1:0.09；
所述D-CSFP的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)分别为35312Da、24494Da，多分散系数(Mw/Mn)为1.44。
流变学特性研究表明制得的D-CSFP溶液具有典型的假塑性非牛顿流体的剪切稀化特性。
所述DESs提取的鳞杯伞多糖(D-CSFP)作为水胶体在食品行业中的应用也属于本发明的保护范围。
所述DESs提取的鳞杯伞多糖(D-CSFP)在制备具有抗氧化和抗炎功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
所述应用中，所述产品可为药品、功能食品。
本发明结合单因素试验和响应面分析方法对超声辅助低共熔溶剂提取鳞杯伞子实体多糖进行了优化，其多糖得率(6.52％)显著高于传统的水提法(4.07％)，且提取时间(40min)显著低于水提法(3.6h)[郭东东，雷佳钰，彭志杰，等.鳞杯伞子实体多糖提取工艺优化及其结构与理化性质[J].食用菌学报，2021，28(4):39-47]。超声辅助DESs提取鳞杯伞子实体多糖的得率高于水提法。
本发明对得到的D-CSFP进行了结构鉴定，其放大后可观察到多糖分子表面有细小的波纹，而水提鳞杯伞多糖分子表面平展光滑；D-CSFP的分子量及单糖组成与水提鳞杯伞多糖也存在差异。综上推测D-CSFP可能为一种新的鳞杯伞多糖，可用于后续研究使用。流变学特性研究表明D-CSFP溶液具有典型的假塑性非牛顿流体的剪切稀化特性，可作为一种新型的水胶体应用于食品等行业。浓度、温度、pH值和盐离子浓度对其流变性能的影响可为其加工应用提供参考。抗氧化和抗炎活性结果表明D-CSFP能够缓解RAW264.7细胞的氧化损伤和炎症损伤，可作为一种具有生物活性的功能食品应用到食品加工产业。
附图说明
图1为不同实验因素对D-CSFP提取率的影响，(A)DES的类型；(B)DES-5两种组成的摩尔比(氯化胆碱/草酸二水)，(C)低共熔溶剂的含水量(v/v)；(D)料液比(g/mL)；(E)提取温度(℃)；(F)提取时间(min)。注：数据为平均值±标准偏差(n＝3)；不同小写字母表示在P＜0.05水平上差异显著。
图2为三因素三水平交互作用对D-CSFP提取率影响的响应面图。
图3为最优提取工艺条件下制备得到的D-CSFP的扫描电镜图。
图4为最优提取工艺条件下制备得到的D-CSFP红外光谱。
图5为最优提取工艺条件下制备得到的D-CSFP的HPGPC色谱图。
图6为混合标准品(A)和D-CSFP(B)的单糖组成液相色谱图，1：岩藻糖；2：盐酸氨基半乳糖；3：鼠李糖；4：阿拉伯糖；5：盐酸氨基葡萄糖；6：半乳糖；7：葡萄糖；8：N-乙酰-D氨基葡萄糖；9：木糖；10：甘露糖；11：果糖；12：核糖；13：半乳糖醛酸；14：古罗糖醛酸；15：葡萄糖醛酸；16：甘露糖醛酸。
图7为质量浓度(A)、温度(B)、pH(C)、Na+浓度(D)、Ca2+浓度(E)、和质量浓度动态(F)处理的D-CSFP流变特性图。
图8为D-CSFP对RAW264.7细胞生长活力的影响(A)、H2O2诱导RAW264.7细胞氧化损伤模型的建立(B)、D-CSFP对H2O2诱导RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用(C)。
图9为LPS诱导RAW 264.7细胞炎症模型的建立(A)、D-CSFP对LPS诱导RAW264.7细胞NO水平变化的影响(B)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
1材料与方法
1.1供试材料
1.1.1材料和试剂
鳞杯伞购于山西农业大学食用菌中心；苯酚、乙酸锌、亚铁氰化钾(天津凯通化学试剂厂)；1,4丁二醇、丙三醇、乙二醇、乙酰胺、尿素(天津市致远化学试剂有限公司)；乳酸，柠檬酸(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；草酸二水(生工生物工程(上海)股份有限公司)；氯化胆碱(上海阿拉丁生化科技有限公司)；无水乙醇、葡萄糖(天津市致远化学试剂有限公司)；浓硫酸(成都市科隆化学品有限公司)；噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、PBS缓冲液(北京Solarbio公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；H2O2(Sigma-Aldrich公司)；脂多糖(LPS)(美国Sigma公司)；NO检测试剂盒(碧云天生物技术)。
1.1.2仪器与设备
GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；WFM-10超微粉碎震荡磨(江阴市祥达机械制造有限公司)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SQP电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；CHB-202Thermo Cell恒温金属浴(杭州博日科技有限公司)；Alpha 2-4LSC basic冻干机(德国Marin Christ公司)；UV9100A紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)；HeraeusMultifuge X1R高速冷冻离心机(赛默飞世尔中国科技有限公司)；TENSOR 27傅里叶变换红外光谱仪(北京布鲁克科技有限公司)；KAS-2000F真空溅射涂布机(美国Gatan公司)；ICS5000离子色谱仪、BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)(德国Thermo公司)；多角度激光光散射凝胶渗透色谱系统、DionexTMCarboPacTMPA20液相色谱柱(美国Wyatt公司)；MCR 102旋转流变仪(奥地利Anton-Paar公司)。
1.2方法
1.2.1材料预处理
利用超微粉碎震荡磨将烘箱干燥后的鳞杯伞子实体充分粉碎后过100目筛。
1.2.2 DESs试剂的制备
将所需试剂按照氢键供体与氢键受体以合适的摩尔比称量，然后放入烧杯内，封口，于80℃水浴加热、搅拌直至形成均一稳定的液体，即为低共熔溶剂。不同低共熔溶剂的名称及摩尔比见表1。
表1低共熔溶剂类型及摩尔比
1.2.3鳞杯伞多糖的提取
称量预处理的鳞杯伞粉末，将其与DESs按照一定的料液比进行混合，搅拌均匀，然后在一定的条件下放入超声波清洗器(40kHz,200W，昆山市超声仪器有限公司)进行鳞杯伞多糖的提取，提取结束以后将浸提液于6500r/min离心15min，然后取上清液用亚铁氰化钾-乙酸锌法去除蛋白质[侯笑笑，林凡，常明昌，等.超声波及脱蛋白处理对猴头菌子实体多糖提取效果的影响[J].菌物学报，2019，38(6):895-906]，6500r/min离心15min，取上清液，蒸馏水透析(截留分子量3500Da)，然后与无水乙醇按1:4(v/v)进行醇沉，4℃静置过夜，6500r/min离心15min，收集沉淀，适量蒸馏水溶解沉淀，冻干，得到DESs提取的鳞杯伞多糖(D-CSFP)，蒸馏水溶解获得的D-CSFP，采用苯酚-硫酸法[王琳炜，欧阳臻，张碧娟，等.霍山铁皮石斛多糖的脱蛋白工艺及结构分析[J].食品科学，2017，38(12):164-170]测定其提取率。
式中：C为计算得到的多糖浓度，mg/mL；V为定容的体积，mL；M为鳞杯伞子实体的质量，g。
1.2.4单因素试验
按照1.2.3中低共熔溶剂法提取鳞杯伞多糖的方法，以多糖提取率为测定指标，采用控制变量法，分别设置不同的低共熔溶剂组分、不同摩尔比(氯化胆碱/草酸二水)(2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1)、不同含水量(10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)、不同料液比(1:10、1:20、1:30、1:40、1:50，g/mL)、不同浸提温度(40、50、60、70、80，℃)、不同浸提时间(20、30、40、50、60，min)考察D-CSFP提取率，每个处理重复3次。
图1为不同实验因素对D-CSFP提取率的影响。
如图1A(含水量30％、料液比1：30(g/mL)、提取温度70℃，提取时间40min)所示，DES-5对D-CSFP的提取效果最好，多糖提取率为4.46％。这可能是因为DES-5和D-CSFP具有更强的氢键结合能力和静电相互作用。根据实验结果，选择DES-5进行后续实验。
随着氯化胆碱与草酸二水(DES-5)摩尔比的增加，多糖提取率呈下降趋势。这可能是因为增加DES-5中氯化胆碱的比例会减弱其与草酸二水的相互作用。在DES-5摩尔比为2:1时，提取率最高，可达(4.47±0.15)％(图1B，含水量30％、料液比1：30(g/mL)、提取温度70℃，提取时间40min)；DES-5含水量低于60％时，随着含水量的增加提取率也逐渐增大，较低的含水量导致DES-5不能很好地渗透到子实体粉末中，降低了D-CSFP的提取率，而含水量大于60％会导致DES-5极性增加，减弱其与D-CSFP的相互作用，从而使多糖提取率降低(图1C，其中采用氯化胆碱与草酸二水2:1的混合物为低共熔溶剂，料液比1：30(g/mL)、提取温度70℃，提取时间40min)；多糖的提取率随料液比的增大，呈现先上升后下降的趋势，料液比为1:20(g/mL)时，提取率最大(图1D，其中采用氯化胆碱与草酸二水2:1的混合物为低共熔溶剂，含水量30％、提取温度70℃，提取时间40min)；提取温度为70℃时，D-CSFP的提取率最高，在高于70℃时，多糖的提取率开始降低，这可能是由于多糖的热降解(图1E，其中采用氯化胆碱与草酸二水2:1的混合物为低共熔溶剂，含水量30％、料液比1：30(g/mL)、提取时间40min)；提取时间为40min时，D-CSFP的提取率最高，随后多糖提取率降低，这主要是因为多糖在高温和较长的提取时间下水解所致(图1F，其中采用氯化胆碱与草酸二水2:1的混合物为低共熔溶剂，含水量30％、料液比1：30(g/mL)、提取温度70℃)
1.2.5响应面试验
在单因素试验的基础上，使用Design-Expert 10.0.7.0软件进行Box-Behnken试验，采用三因素三水平(A提取时间、B提取温度、C料液比)进行响应面试验设计，考察多糖提取率的变化，因素水平设计见表2。
表2响应面试验设计因素与水平
1.2.6 D-CSFP多糖得率及含量的测定
测定最优提取工艺下D-CSFP多糖得率，计算公式如下：
式中：m为鳞杯伞多糖的质量，g；M为鳞杯伞子实体粉末的质量，g。
采用苯酚-硫酸法[王琳炜，欧阳臻，张碧娟，等.霍山铁皮石斛多糖的脱蛋白工艺及结构分析[J].食品科学，2017，38(12):164-170]测定最优提取工艺下D-CSFP多糖含量，计算公式如下：
式中：C1为计算得到的多糖浓度，mg/mL；C2为鳞杯伞多糖的浓度，mg/mL。
在单因素试验的基础上，选用DES-5(氯化胆碱/草酸二水的摩尔比为2:1，含水量为60％)进行响应面试验。根据Box-Behnken Design方法的设计原理，以D-CSFP提取率为响应值，选取单因素最适水平为中心，运用Design Expert 10.0.7.0软件设计响应面优化试验方案，并通过实验获得17组相应的结果(表3)。
表3响应面设计及结果
由表4可得拟合回归方程为Y＝5.07-0.16A+0.99B+0.26C+0.062AB+0.29AC+0.15BC-0.22A2-1.11B2-0.41C2。模型差异极显著(P<0.0001)，失拟项不显著(P＝0.2520>0.05)，表示模型拟合度较好；模型R2＝0.9936，表明模型与试验拟合度较好；模型的校正系数R2 Adj＝0.9854，表明98.54％的响应值变化可以被该模型解释，可用该模型对D-CSFP提取率进行分析和预测。C.V.％＝2.81％<10％，表明试验可信度和精确度高。对该模型各项系数进行分析，一次项A、B、C对D-CSFP提取率Y值的影响极显著(P<0.01)，二次项A2、B2、C2对Y值影响极显著(P<0.01)，交互项AC(P<0.01)、BC(P<0.05)分别表示提取时间与料液比交互作用极显著，提取温度与料液比交互作用显著。
表4回归方程的方差分析表
注：*P<0.05为显著差异；**P<0.01为极显著差异
通过软件Design Expert 10.0.7.0得到的响应面曲面图可以反映不同因素之间交互作用对D-CSFP提取率的影响，曲面的坡度越大，因素间的交互作用就越显著[郝金斌，傅明通，王玲玲，等.奶油栓孔菌菌丝体多糖的提取工艺优化、结构表征及抗氧化活性[J].菌物学报，2021，40(9):2461-2479]。由图2可知，提取时间和料液比交互项响应面图的倾斜程度最高，其次为提取温度和料液比的交互项，这与表4的方差分析结果一致。
利用Design Expert 10.0.7.0软件，筛选出最佳的提取时间39.67min，提取温度74.74℃，料液比1:23.98(g/mL)，预测提取率最高可达5.36％，为了方便实际操作，将提取工艺参数修改为40min、75℃、料液比1:24(g/mL)，此时的D-CSFP提取率为(5.31±0.09)％，接近预测值，表明该模型可靠，可准确预测实验结果。
经检测，最优提取工艺(40min、75℃、料液比1:24(g/mL)下D-CSFP的多糖得率为(6.52±0.29)％，高于传统水提法得到的鳞杯伞多糖(4.07±0.05)％，最优提取工艺下D-CSFP多糖含量为(81.42±0.59)％，高于传统水提法得到的鳞杯伞多糖(63.84±1.53)％，表明超声辅助低共熔溶剂提取的鳞杯伞多糖相比于传统水提鳞杯伞多糖含杂质较少[郭东东，雷佳钰，彭志杰，等.鳞杯伞子实体多糖提取工艺优化及其结构与理化性质[J].食用菌学报，2021，28(4):39-47；GUO DD,LEI JY,HE C,et al.In vitro digestion andfermentation by human fecal microbiota of polysaccharides from Clitocybesquamulose[J].International journal of biological macromolecules,2022,208:343-355]。
1.3 D-CSFP的形态观察和结构鉴定
1.3.1扫描电镜分析
将5mg最优提取工艺条件下制备的D-CSFP放置在样品台上，用真空溅射涂布机在样品上喷涂一层导电膜。使用扫描电子显微镜观察D-CSFP的形态特征。
放大(2000×)的D-CSFP由大小比较均一的球状突起相连。放大(5000×)的D-CSFP可观察到簇状球体堆积。放大(10000×)的D-CSFP可观察到多糖分子表面细小的波纹(图3)。
1.3.2红外光谱分析
取1mg冻干的D-CSFP多糖样品，采用KBr压片法检测400-4000cm-1范围内的红外光谱。
图4展示了D-CSFP红外光谱图，检测了在400-4000cm-1范围内存在的特征有机基团。样品在约3379.20、2925.94和1045.39cm-1处出现典型的多糖吸收峰，这主要归因于O-H和C-H伸缩振动以及O-H变角振动，表明多糖中含有吡喃糖环结构。在1652.96cm-1处的吸收峰是由COO-的不对称伸缩振动引起的，表明多糖中含有羧基。在1555cm-1处蛋白质吸收峰处没有明显的信号峰值，表明蛋白质含量较低。在1417.65cm–1处的吸收峰，归属于C-O伸缩振动。
1.3.3分子量分布分析
通过高效凝胶渗透色谱法(High Performance Gel PermeationChromatography，HPGPC)测定多糖分子量。5mg·mL-1的D-CSFP溶液过0.22μm的水相微滤膜备用。色谱条件：柱温为40℃，流动相为0.05mol/L的NaCl溶液，流速为0.6mL/min，色谱柱为BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)，进样量为20μL。图5为D-CSFP的HPGPC色谱图。
大量研究表明，分子量对多糖的抗氧化、免疫增强、抗肿瘤等生物学活性都有重要影响[李珺铭，刘富饶，李波，等.基于分子量探究人参多糖免疫活性构效关系[J].中成药，2021，43(11):3088-3092]。D-CSFP的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)分别为35312Da、24494Da，多分散系数(Mw/Mn)为1.44。D-CSFP的分子量高于传统水提法得到的鳞杯伞多糖(1.95×104)[郭东东，雷佳钰，彭志杰，等.鳞杯伞子实体多糖提取工艺优化及其结构与理化性质[J].食用菌学报，2021，28(4):39-47]。有研究结果表明，多糖的分子量大小通常与其体外生物活性密切相关[YANG WJ,PEI F,SHI Y,et al.Purification,characterization and anti-proliferation activity of polysaccharides fromFlammulina velutipes[J].Carbohydrate Polymers,2012,88(2):474-480.；王帅，赵冬雪，韩成凤，等.6种活性多糖的结构、性质及其抗氧化活性的比较研究[J].食品研究与开发，2021，42(16):7-15]。
1.3.4单糖组成测定
参考郭东东等的方法采用Thermo ICS5000离子色谱仪连接DionexTMCarboPacTMPA20液相色谱柱进行单糖组成的测定。流动相：A：H2O；B：15mmol/LNaOH；C:15mmol/L NaOH&100mmol/LNaOAC；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃。
D-CSFP中含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、盐酸氨基葡萄糖、木糖，摩尔比为6.53:2.04:1.23:0.1:0.09(图6)。有学者表明水提鳞杯伞多糖的单糖组成主要为葡萄糖、甘露糖、半乳糖和鼠李糖组成，其摩尔比为1.07:0.38:0.11:0.02，传统水提法未检出盐酸氨基葡萄糖、木糖。
1.4 D-CSFP体外流变学特性的研究
采用流变仪检测不同质量浓度(10、30、50、70、90，mg/mL)，不同温度(10、20、30、40、50，℃)、不同pH(3、5、7、9、11)、不同Na+浓度(0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9，mol/L)和不同Ca2 +浓度(0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9，mol/L)的D-CSFP溶液在1～1000s-1的剪切速率下，黏度(η)随剪切速率(γ)的变化。采用角频率扫描模式，测定不同浓度(50、100，mg/mL)下D-CSFP溶液储能模量和损耗模量的变化，应用RheoCompassTM分析软件进行数据处理。
多糖具有优良的流变性能，在食品工业中常用作增稠剂、胶凝剂和乳化剂。在不同浓度和温度下，D-CSFP的表观黏度随剪切速率的增加而降低，表明D-CSFP溶液具有典型的假塑性非牛顿流体的剪切稀化特性。在1-1000s-1的剪切速率范围内，D-CSFP溶液的表观黏度随其浓度的增大而增大，这是因为在多糖浓度增大的同时增强了多糖的分子间作用，提升了多糖分子的一致性和假塑性行为；D-CSFP溶液的表观粘度随温度的升高逐渐减小，这是由于温度升高导致多糖的黏度下降，在虫草菌的发酵培养基中提取的胞外多糖也发现了类似的特性(图7AB)；在不同pH范围内，D-CSFP溶液仍存在剪切稀化行为，pH为7时，D-CSFP溶液在相同剪切速率下表观粘度最大。在强酸和强碱环境下，D-CSFP溶液的表观黏度急剧下降(图7C)；在0mol/L至0.9mol/L的钠离子浓度范围内，D-CSFP溶液的表观黏度随离子浓度的增大先下降后上升(图7D)；在0mol/L至0.9mol/L的钙离子浓度范围内，D-CSFP溶液的表观黏度随离子浓度的增大不断下降(图7E),这是由于Ca2+浓度升高导致多糖分子构象变得紧密，使多糖分子的流体力学发生了改变，导致D-CSFP溶液的黏度下降。
动态流变可以检测D-CSFP溶液的黏弹性，G'为储能模量，可表示多糖溶液在应力作用下储存的能量，也就是多糖溶液的弹力；G”为损耗模量，可表示为多糖溶液损耗的能量，也就是多糖溶液的黏性。D-CSFP溶液的G'和G”均随着角频率的增大呈上升趋势，在50mg/mL和100mg/mL的D-CSFP溶液中G'均大于G”，表明D-CSFP溶液呈弹性特征，为典型的弱凝胶，这与猴头菌子实体碱提多糖相似。100mg/mL的D-CSFP溶液的G'和G”均大于50mg/mL的D-CSFP溶液，呈现的凝胶特性可能与D-CSFP的三维网状结构、官能团、交联程度及聚合度等相关(图7F)。
1.5 D-CSFP的抗氧化活性研究
1.5.1 RAW 264.7细胞培养
将RAW 264.7细胞放在含10％胎牛血清的高糖培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，并定期观察细胞状态，待细胞长至培养瓶底80％左右时进行传代培养。
1.5.2 D-CSFP对RAW264.7细胞生长活力的影响
使用MTT法评估D-CSFP对RAW264.7细胞生长活力的影响。按照每孔1×105个接种于96孔板中，在37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜。去除上清液，分别加入100μL含有不同浓度多糖的培养基(D-CSFP的最终浓度为100、200、400、800、1600、2000μg/mL)，同时设置Control组(加入新鲜培养基)，置于CO2培养箱中培养24h。培养完成后，弃上清，每孔加入100μL新鲜培养基和5mg/mL MTT溶液10μL，在培养箱中继续培养4h，去除上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，混匀，490nm处测定其吸光值，并计算RAW264.7细胞的存活率。RAW264.7细胞的存活率采用下列公式计算：
采用MTT法检测不同浓度D-CSFP对RAW264.7细胞活力的影响。结果表明在200-1600μg/mL浓度范围内，D-CSFP对RAW264.7细胞的生长有促进作用，在该浓度范围内D-CSFP对RAW264.7细胞无毒性。随着D-CSFP浓度的进一步升高，RAW264.7细胞存活率下降，细胞生长受到抑制(图8A)。
1.5.3 H2O2诱导RAW 264.7细胞氧化损伤模型的建立
将RAW 264.7细胞浓度按照1×105个/孔接种于96孔板中，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。弃上清，加入新鲜培养基配制的0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mM H2O2溶液100μL，设置Control组(加入新鲜培养基)，CO2培养箱继续培养4h，参考1.5.2的方法检测细胞存活率。
实验采用不同浓度的H2O2处理RAW264.7细胞4h，发现当H2O2浓度为0.4mM时，RAW264.7细胞的存活率为52.26％。过高和过低的H2O2浓度都不适宜建模，过高的H2O2浓度会使细胞损伤过量，而过低的H2O2浓度对细胞损伤不明显。因此，选用0.4mMH2O2建立RAW264.7细胞氧化损伤模型(图8B)。
1.5.4 D-CSFP对RAW 264.7细胞氧化损伤保护作用影响
将RAW 264.7细胞浓度按照1×105个/孔接种于96孔板中，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。弃上清，Control组和模型组中加入100μL新鲜培养基，多糖组加入100μL含有不同浓度D-CSFP的培养基，继续培养24h。弃上清，于模型组和多糖组中加入含有H2O2的培养基，Control组加入新鲜培养基，培养4h后根据1.5.2的方法检测细胞存活率。
采用MTT测定细胞活力来评价D-CSFP对H2O2诱导的RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用。与空白组相比，模型组细胞存活率显著下降(P<0.05),为54.11％，表明模型构建成功。不同浓度的D-CSFP处理RAW264.7细胞后，细胞存活率逐渐升高，且呈剂量依赖性。当D-CSFP浓度为1600μg/mL，细胞存活率最高，为85.14％，显著高于模型组(P<0.05)(图8C)。
1.6 D-CSFP的抗炎活性研究
1.6.1 LPS诱导RAW 264.7细胞炎症模型的建立
将RAW 264.7细胞浓度按照1×105个/孔接种于96孔板中，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。弃上清，设置Control组(加入新鲜培养基)和LPS组(加入含有不同浓度LPS的新鲜培养基)，培养24h后，吸取上清液，使用试剂盒测定其NO含量。
与Control组相比，加入LPS可提高RAW264.7细胞NO释放量，且随着LPS浓度的升高NO释放量也逐渐增大。当LPS浓度为1μg/mL时，RAW264.7细胞NO浓度为20.46μmol，显著高于Control组(P<0.05)。因此，选用LPS浓度为1μg/mL构建RAW264.7细胞炎症模型(图9A)。
1.6.2 D-CSFP对LPS诱导RAW 264.7细胞NO水平变化的影响
参照1.6.1建立RAW264.7细胞炎症模型，设置Control组(加入新鲜培养基)，LPS组(加入浓度为1μg/mL的LPS培养基)和多糖组(添加D-CSFP浓度为100、200、400、800、1600μg/mL的新鲜培养基预处理4h，随后加入含有1μg/mL的LPS培养基)，培养24h后，吸取上清液，使用试剂盒测定其NO含量。
与Control组相比，模型组RAW264.7细胞NO含量显著升高(P<0.05)，为19.28μmol，表明炎症模型构建成功。与模型组相比，多糖处理组RAW264.7细胞产生的NO含量均有下降，且呈剂量依赖性，表明D-CSFP在实验浓度范围内对RAW264.7细胞炎症模型有保护作用(图9B)。
本发明方法的多糖得率(6.52％)显著高于传统的水提法(4.07％)，且提取时间(40min)显著低于水提法(3.6h)。超声辅助DESs提取鳞杯伞子实体多糖的得率高于水提法，有可能是因为DESs耐高温，能保护多糖在高温环境下不被降解，且DESs有更好的极性、黏度以及张力[REDHA AA.Review on Extraction of Phenolic Compounds from NaturalSources Using Green Deep Eutectic Solvents[J].Journal of Agricultural andFood Chemistry,2021,69(3):878-912]。
对得到的D-CSFP进行了结构鉴定，其放大后可观察到多糖分子表面有细小的波纹，而水提鳞杯伞多糖分子表面平展光滑；D-CSFP的分子量及单糖组成与水提鳞杯伞多糖存在差异，出现这些现象的原因可能是因为不同的提取方法提取到了不同种类的多糖以及提取方式对多糖糖苷键及多糖链内与链间的氢键破坏程度不同。综上推测D-CSFP可能为一种新的鳞杯伞多糖，可用于后续研究使用。流变学特性研究表明D-CSFP溶液具有典型的假塑性非牛顿流体的剪切稀化特性，可作为一种新型的水胶体应用于食品等行业。浓度、温度、pH值和盐离子浓度对其流变性能的影响可为其加工应用提供参考。
抗氧化和抗炎活性结果表明D-CSFP能够缓解RAW264.7细胞的氧化损伤和炎症损伤，可作为一种具有生物活性的功能食品应用到食品加工产业。今后的工作将重点放在该多糖的抗氧化和抗炎机理研究方面。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.一种制备鳞杯伞多糖的方法，包括如下步骤：
1)将鳞杯伞子实体干燥、粉碎后过筛；
2)将氯化胆碱与多元醇、酸和酰胺中的至少一种按一定摩尔比混合，加热搅拌至完全溶解，在室温下形成无色透明的液体，即低共熔溶剂；
3)将鳞杯伞子实体粉末与所述低共熔溶剂混合，超声浸提，将所得浸提液离心取上清液，去除所得上清液中的蛋白质，离心，取上清液，蒸馏水透析，然后醇沉，离心，收集沉淀，蒸馏水溶解沉淀，冻干，即得DESs提取的鳞杯伞多糖(D-CSFP)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述多元醇为1,4-丁二醇、乙二醇、丙三醇中的一种或几种的混合物；
所述酸为乳酸、草酸二水、柠檬酸中的一种或几种的混合物；
所述酰胺为乙酰胺、尿素中的一种或两种的混合物；
氯化胆碱与多元醇、酸和酰胺中的至少一种的摩尔比为2:1-8。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：将摩尔比2:1的氯化胆碱与草酸二水混合制备低共熔溶剂；
所述低共熔溶剂的含水量为30％-70％(v/v)，优选60％(v/v)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤3)中，料液比为1:10-30，优选1:20-25。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述超声浸提的温度为60-80℃，优选70-75℃；时间为30-50min，优选40min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：通过亚铁氰化钾-乙酸锌法去除上清液中的蛋白质；
蒸馏水透析时，截留分子量3500Da；
所述醇沉的操作为向所得上清液中加入无水乙醇，4℃静置过夜，即可，其中，上清液与无水乙醇的体积比为1:4。
7.由权利要求1-6中任一项所述方法得到的DESs提取的鳞杯伞多糖。
8.根据权利要求7所述的DESs提取的鳞杯伞多糖，其特征在于：所述DESs提取的鳞杯伞多糖含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、盐酸氨基葡萄糖、木糖，且摩尔比依次为6.53:2.04:1.23:0.1:0.09。
9.权利要求7或8所述的DESs提取的鳞杯伞多糖作为水胶体在食品行业中的应用。
10.权利要求7或8所述的DESs提取的鳞杯伞多糖制备具有抗氧化和抗炎功能的产品中的应用。
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