CN112980904B - 酶法制备柞蚕蛹低聚壳聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶法制备柞蚕蛹低聚壳聚糖的方法。利用盐酸溶液脱去柞蚕蛹皮中的无机盐，氢氧化钠溶液水解其中的蛋白质，得到甲壳素，甲壳素用间歇式浓碱热化学法脱乙酰基，提纯处理，获得柞蚕蛹壳聚糖，利用纤维素酶降解壳聚糖，冷冻干燥后即可得到柞蚕蛹低聚壳聚糖。通过本发明可得到优质的柞蚕蛹壳聚糖，进一步酶解成低聚壳聚糖，提高了柞蚕蛹经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及低聚壳聚糖领域，具体涉及酶法降解壳聚糖制备低聚壳聚糖的方法。
背景技术
柞蚕蛹为天蚕蛾科动物柞蚕的蛹，既是一种高营养的美食，也是味中药，具有和脾胃、祛风湿、长阳气之功效，自古以来就得到广泛应用。柞蚕产业是一项资源可再生，具有经济和生态双重效益的产业，是我国特有的一种生物资源。
柞蚕蛹皮是缫丝业及食品加工的废弃物，甲壳质占30％左右，含量丰富，壳聚糖是甲壳质脱乙酰基的产物，低聚壳聚糖是壳聚糖降解的产物。如能将废弃物柞蚕蛹皮进行充分利用，开发提取其中的壳聚糖和低聚壳聚糖将具有十分重要的经济和社会价值。
壳聚糖是一种具有巨大潜能生物大分子，具有多种生物活性，拥有出色生物相容性和可完全分解性，壳聚糖良好的吸附性、抑菌性、保湿性等使其在工业、农业、医药、食品等领域都有广泛的应用。甲壳素脱去乙酰基得到壳聚糖，这个过程实质上是甲壳素分子上酰胺的水解，由于甲壳素分子的复杂结构，其脱乙酰基是比较困难的，需要较高浓度的强碱和较长时间的反应，而且要获得100％脱乙酰的壳聚糖非常困难。
壳聚糖高分子的分子量通常在几十万左右，一般可溶于稀酸中但不能直接溶于水，而当壳聚糖降解为相对分子量较小的低聚壳聚糖后，其理化性质及某些生理功能将会发生变化。低聚壳聚糖可以直接溶于水中，其溶液粘度较低，具有较好的增湿性和保湿性。低聚壳聚糖不仅保持了壳聚糖大分子具有的某些功能性质，如降胆固醇、降血压等，还有调节肠道菌群、保湿性、功能性甜味剂等功能，因此低聚壳聚糖在保健食品、食品保鲜、生物医药等方面都有很多应用，低聚壳聚糖的开发具有远大的前景。低聚壳聚糖的制备方法主要有物理降解法、化学降解法和生物酶降解法。酶降解法具有无副反应、反应过程温和易控制、降解产物活性高且易分离，生产工艺绿色环保等突出的优点。生物酶降解法采用对壳聚糖具有生物活性的酶对壳聚糖进行降解制取低聚壳聚糖，用于制备低聚壳聚糖的生物酶较多，可分为专一性酶和非专一性酶。专一性酶主要有几丁质酶和壳聚糖酶等，专一性酶的来源有限，价格昂贵，而非专一性酶的价格低廉，在实现酶法制备低聚壳聚糖的商业化应用方面潜力巨大。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用间歇式碱处理，成本低的酶法制备柞蚕蛹低聚壳聚糖的方法。
本发明采用的技术方案是：酶法制备柞蚕蛹低聚壳聚糖的方法，包括如下步骤：
1)于柞蚕蛹皮粉中，加入氢氧化钠溶液，恒温磁力搅拌后抽滤，所得滤渣用去离子水清洗至中性，烘干；取烘干后的滤渣，加入盐酸溶液，恒温磁力搅拌后抽滤，所得滤渣用去离子水清洗至中性，得甲壳素；
2)于步骤1)所得甲壳素中，加入氢氧化钠溶液，恒温磁力搅拌，所得产物抽滤，水洗至中性，烘干，得粗壳聚糖；
3)提纯：于粗壳聚糖中加入醋酸溶液，磁力搅拌使其溶解后，用氢氧化钠溶液调整pH，离心收集沉淀，加去离子水悬浮，抽滤洗至中性，冷冻干燥，得提纯的柞蚕蛹壳聚糖；
4)于提纯的柞蚕蛹壳聚糖中，再次加入醋酸溶液，机械搅拌完全溶解，用氢氧化钠溶液或醋酸溶液调节溶液pH后，升温至50℃，加入纤维素酶，恒温摇床中酶解，得酶解液；
5)取酶解液于沸水浴中灭活，用氢氧化钠溶液调节酶解液的pH，离心取上清液，冷冻干燥，得柞蚕蛹低聚壳聚糖粉末。
进一步的，上述的方法，步骤1)中，按固液比1:10，加入2mol/L的氢氧化钠溶液，85℃恒温磁力搅拌5h。
进一步的，上述的方法，步骤1)中，按固液比1:20，加入1.6mol/L的盐酸溶液，40℃恒温磁力搅拌6h。
进一步的，上述的方法，步骤2)中，按固液比1:20，加入质量百分浓度为50％的氢氧化钠溶液，90℃恒温磁力搅拌7h。
进一步的，上述的方法，步骤3)中，按固液比1:30，质量百分浓度为10％的醋酸溶液，用1N的氢氧化钠溶液调节pH至10，8000r/min离心20min。
进一步的，上述的方法，步骤4)中，按固液比1:100，于提纯的柞蚕蛹壳聚糖中加入0.2mol/L的醋酸溶液，调节溶液pH至5.0；按2500U/g的酶用量加入纤维素酶，50℃恒温摇床中酶解24h。
进一步的，上述的方法，步骤5)中，灭活时间为10min，用氢氧化钠溶液调节酶解液的pH至8。
本发明的有益效果是：
1、本发明，利用间歇式制备的壳聚糖脱乙酰程度高，效果好，利用酶法降解制备柞蚕蛹低聚壳聚糖，条件温和，易于控制，可降低平均分子量，得到低聚合度的壳聚糖。
2、本发明，采用间歇式碱处理，在一次碱处理的基础上二次脱乙酰，可以得到较好的脱乙酰度。
3、本发明选用纤维素酶降解壳聚糖制备柞蚕蛹低聚壳聚糖，研究确定壳聚糖的降解条件，为低聚壳聚糖的开发与研究、补充并完善蚕业综合利用体系、提高蚕农收入和增加附加值带来巨大的经济效益。提取的柞蚕蛹低聚壳聚糖有很高的应用价值。
附图说明
图1是脱乙酰测定中，溶液的pH与氢氧化钠标准溶液体积曲线图。
图2是壳聚糖原料的ηsp/C～C关系曲线图。
图3是还原糖的标准曲线图。
图4是氨基葡萄糖盐酸盐的标准曲线图。
具体实施方法
实施例1柞蚕蛹壳聚糖的制备
(一)制备方法，包括如下步骤：
1、将柞蚕蛹放入冰箱，待完全冷冻后取出，室温缓冻5min后，将柞蚕蛹的皮和内容物分离，反复水洗至蛹皮内没有白色膜状物为止，用滤纸吸干水分，烘干，将烘干后的柞蚕蛹皮粉碎，得柞蚕蛹皮粉，备用。
2、取20g柞蚕蛹皮粉置于干燥的烧杯中，按固液比1g:10mL，加入200mL浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液，85℃恒温磁力搅拌5h，反应结束后抽滤，所得滤渣用去离子水清洗至中性，烘干。取烘干后的滤渣置于烧杯中，按固液比1g:20mL，加入浓度为1.6mol/L的盐酸溶液，40℃恒温磁力搅拌6h，反应结束后抽滤，所得滤渣用去离子水反复冲洗至中性，得产物甲壳素，烘干，备用。
3、取甲壳素置干燥烧杯中，按固液比1g:20mL加入50％(w/w)的氢氧化钠溶液，90℃恒温磁力搅拌7h，让甲壳素和氢氧化钠充分反应脱去乙酰基，产物抽滤水洗至中性，烘干。取烘干后的产物再次按固液比1g:20mL加入50％(w/w)的氢氧化钠溶液，90℃恒温磁力搅拌3h，进行二次脱乙酰基，所得产物抽滤水洗至中性，烘干，得粗壳聚糖。
4、对粗壳聚糖提纯：于所得粗壳聚糖中，按固液比1g:30mL加入10％(w/w)的醋酸溶液，磁力搅拌使其溶解，用1N的氢氧化钠溶液调节pH至10，使壳聚糖沉淀，8000r/min离心20min，收集沉淀，加入去离子水悬浮，抽滤洗至中性，冷冻干燥，得提纯后的柞蚕蛹壳聚糖。
(二)检测
1、得率的测定
本发明所称甲壳素与柞蚕蛹壳聚糖得率，即指制得的甲壳素或壳聚糖占未处理前样品总质量的百分比，甲壳素和壳聚糖得率根据公式(1)和(2)计算：
式中：
R甲壳素：甲壳素得率，％；
R1：制得甲壳素质量，g；
R0：柞蚕蛹皮原料的质量，g
式中：
R壳聚糖：壳聚糖得率，％；
R3：制得壳聚糖质量，g；
R2：甲壳素质量，g。
经检测，甲壳素得率为36.31％，高纯度的柞蚕蛹壳聚糖得率为49.19％。
2、脱乙酰的测定
壳聚糖的脱乙酰度是分子中脱除乙酰基的糖残基数占分子中总的糖残基数的百分数，脱乙酰度越高的壳聚糖，具有更强的溶解和离子交换能力，测定壳聚糖中的脱乙酰度是对产品质量分析的一个重要指标。
本实施例采用电位滴定法来测定壳聚糖的脱乙酰度。依据GB29941-2013《食品安全国家标准食品添加剂脱乙酰甲壳素(壳聚糖)》中，关于脱乙酰度测定的内容进行检测。
结果如图1所示，经检测，壳聚糖的脱乙酰度为92.00％。
3、壳聚糖的粘均分子量的测定
采用粘度法测定壳聚糖的分子量。方法：准确称取0.1g干燥的壳聚糖原料，将其加入10mL含0.2mol/L醋酸和0.1mol/L醋酸钠的混合溶剂中搅拌溶解，将滤液转移至25mL试管中，用0.2mol/L醋酸和0.1mol/L醋酸钠的混合溶剂稀释至20mL。分别取2、4、6、8mL壳聚糖溶液转移至25mL试管中，分别用0.2mol/L醋酸和0.1mol/L醋酸钠的混合溶剂稀释至20mL，得到浓度依次为0.5、1、1.5和2mg/mL的壳聚糖溶液。将混合溶剂沿乌氏粘度计的宽管内壁流入储存器内，使溶液的液面位于储存器的两个刻度线之间，然后将乌氏粘度计垂直固定于25℃的玻璃恒温水浴槽中，使粘度计的缓冲球位于水浴的液面下，静置恒温30min，用洗耳球从主管管口将待测溶液转移至主管中，待溶液的液面上升至缓冲球中部，放开测管，使溶液在管内自由下落，待液面下降至主管上刻度线a时开始计时，待液面下降至主管上刻度线b时停止计时，记录待测溶液流经两个刻度线的时间差，重复测定三次，取平均值作为溶液的流出时间(T0)。采取相同的方法测试不同浓度的壳聚糖溶液流经主管两个刻度线的时间差，测试三次，取平均值作为该浓度壳聚糖溶液的流出时间(T)，根据公式(3)和(4)计算壳聚糖原料的特性粘度。
式中：
ηsp：壳聚糖溶液的增比粘度；
T0：溶剂流出时间，s；
T：壳聚糖溶液的流出时间，s；
[η]：壳聚糖原料的特性粘度，mL/g；
C：壳聚糖溶液的浓度，g/mL。
以ηsp/C～C做图，线性拟合后外推至C＝0，即直线在纵坐标上的截距为壳聚糖原料的特性粘度[η]，然后根据Mark-Houwink方程(5)中关于特性粘度和分子量的关系，反推出壳聚糖原料的：
[η]＝K×Mα (5)
式中：
[η]：壳聚糖原料的特性粘度，mL/g；
K：比例常数，K＝1.64(DD100)14×10-30；
α：经验常数，α＝-1.02×(DD×100)×10-2+1.82；
DD：壳聚糖原料的脱乙酰度；
M：壳聚糖原料的相对分子量。
结果如图2，壳聚糖曲线的R2为0.9931，拟合程度较好，线性方程为：y＝116478x+409.1，y代表壳聚糖溶液的增比粘度和壳聚糖溶液的浓度之比，x表示壳聚糖溶液的浓度。由此可得壳聚糖的特性粘度[η]为409.10mL/g，壳聚糖原料的相对分子量为374.13KDa。
实施例2酶法制备柞蚕蛹低聚壳聚糖的方法
(一)制备方法，包括如下步骤：
1、将柞蚕蛹放入冰箱，待完全冷冻后取出，室温缓冻5min后，将柞蚕蛹的皮和内容物分离，反复水洗至蛹皮内没有白色膜状物为止，用滤纸吸干水分，烘干，将烘干后的柞蚕蛹皮粉碎，得柞蚕蛹皮粉，备用。
2、取20g处理好的柞蚕蛹皮粉置于干燥的烧杯中，按固液比1g:10mL加入200mL浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液，85℃恒温磁力搅拌5h，反应结束后抽滤，所得滤渣用去离子水清洗至中性，烘干。取烘干后的滤渣置于烧杯中，按固液比1g:20mL，加入浓度为1.6mol/L的盐酸溶液，40℃恒温磁力搅拌6h，反应结束后抽滤，所得滤渣用去离子水反复冲洗至中性，得产物甲壳素，烘干，备用。
3、取甲壳素置于干燥烧杯中，按固液比1g:20mL加入50％(w/w)的氢氧化钠溶液，90℃恒温磁力搅拌7h，让甲壳素和氢氧化钠充分反应脱去乙酰基，产物抽滤水洗至中性，烘干。取烘干后的产物再次按固液比1g:20mL加入50％(w/w)的氢氧化钠溶液，90℃恒温磁力搅拌3h，进行二次脱乙酰基，所得产物抽滤水洗至中性，烘干，得粗壳聚糖。
4、对粗壳聚糖提纯：于所得粗壳聚糖中，按固液比1g:30mL加入10％(w/w)的醋酸溶液，磁力搅拌使其溶解，用1N的氢氧化钠溶液调节pH至10，使壳聚糖沉淀，8000r/min离心20min，收集沉淀，加入去离子水悬浮，抽滤洗至中性，冷冻干燥，得提纯后的柞蚕蛹壳聚糖。
5、按固液比1g:100mL，取提纯后的柞蚕蛹壳聚糖0.3g，将其溶解于30mL浓度为0.2mol/L的醋酸溶液中，机械搅拌使其完全溶解，用氢氧化钠溶液或醋酸溶液调节溶液pH至5.0，然后升温，当升温至50℃时，按照2500U/g的酶用量加入纤维素酶0.075g，50℃下恒温摇床中酶解24h，得酶解液。
6、取酶解液于沸水浴中灭活10min，用氢氧化钠溶液调节酶解液的pH至8，离心除去沉淀，将上清液倒入平皿中，进行冷冻干燥，得柞蚕蛹低聚壳聚糖粉末。
(二)检测
1、低聚壳聚糖得率的测定：
本发明以低聚壳聚糖的得率为指标，根据公式(6)计算：
式中：
R低聚壳聚糖：低聚壳聚糖的得率，％；
R5：低聚壳聚糖质量，g；
R4：壳聚糖投入量，g。
经检测，柞蚕蛹低聚壳聚糖的得率为76.59％。
2、酶解液还原糖的测定：DNS法测定
1)标准曲线的制作
取19只具塞试管，编号管0及管1-6每组三组平行，按表1取浓度为1mg/mL的氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液加蒸馏水定容至2mL，得系列氨基葡萄糖盐酸盐浓度溶液，于系列氨基葡萄糖盐酸盐浓度溶液中按表1加入试剂DNS，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，波长540nm，用0号管调零，测出1-6号管的吸光度，以氨基葡萄糖盐酸盐的毫克数为横坐标，吸光度为纵坐标，取三组平均值，绘出标准曲线，结果如图3。
表1
标准曲线如图3，由图3可见，在0.2-1.2mg的含量范围内具有线性关系，线性方程为y＝0.2431x-0.0481，R2＝0.9996。
2)酶解液还原糖的测定
取0.2mL灭活后的酶解液加蒸馏水定容至2mL，再加入1.5mLDNS，摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在540nm处测吸光值，将吸光值带入标准曲线得出对应的还原糖毫克数。
经检验，酶解液中还原糖含量为1.02mg。
3、低聚壳聚糖分子量的测定：采用乙酰丙酮测定
1)标准曲线的制作
取16只具塞试管，编号管0及管1-5每组三组平行，按表2取浓度为30μg/mL的氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液加蒸馏水定容至5mL，得系列氨基葡萄糖盐酸盐浓度溶液，于系列氨基葡萄糖盐酸盐浓度溶液中按表2加入试剂乙酰丙酮溶液，盖塞后，摇匀，于沸水中水浴25min，立即用冷水冷却至室温，按表2加入对-二甲氨基苯甲醛溶液(DMABA)和无水乙醇，摇匀，60℃保温1h，冷却至室温，以0号管为对照，在525nm处测吸光值。以氨基葡萄糖盐酸盐的微克数为横坐标，吸光度为纵坐标，取三组平均值，绘出标准曲线，结果如图4。
表2
标准曲线如图4，由图4可见，在0-150μg的含量范围内具有线性关系，线性方程为y＝0.0049x+0.0333，R2＝0.9972。
2)样品低聚壳聚糖数均分子量的测定
取0.04g低聚壳聚糖粉末溶于蒸馏水中并定容至25mL，取3mL于比色管，加水至5mL，加入试剂乙酰丙酮溶液，盖塞后，摇匀，于沸水中水浴25min，立即用冷水冷却至室温，加入对-二甲氨基苯甲醛溶液(DMABA)1mL和无水乙醇3mL，摇匀，60℃保温1h，冷却至室温，在525nm处测吸光值。将吸光值带入标准曲线中得到单糖微克数再除以10得到单糖浓度X，带入公式(7)：
式中：
Mn：数均分子量；
W：低聚壳聚糖粉末质量，g；
V：定容体积，mL；
X：样品浓度，μg/mL；
215.6：氨基葡萄糖盐酸盐分子量。
经检测，低聚壳聚糖的相对分子量为61.46KDa。
Claims (1)
1.酶法制备柞蚕蛹低聚壳聚糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）于柞蚕蛹皮粉中，按固液比1:10，加入2mol/L的氢氧化钠溶液，85℃恒温磁力搅拌5h后抽滤，所得滤渣用去离子水清洗至中性，烘干；取烘干后的滤渣，按固液比1:20，加入1.6mol/L的盐酸溶液，40℃恒温磁力搅拌6h后抽滤，所得滤渣用去离子水清洗至中性，得甲壳素；
2）采用间歇式碱处理，在一次碱处理的基础上二次脱乙酰，具体为：于步骤1）所得甲壳素中，按固液比1:20加入质量百分浓度为50%的氢氧化钠溶液，90℃恒温磁力搅拌7h，让甲壳素和氢氧化钠充分反应脱去乙酰基，产物抽滤水洗至中性，烘干；取烘干后的产物再次按固液比1:20加入质量百分浓度为50%的氢氧化钠溶液，90℃恒温磁力搅拌3h，进行二次脱乙酰基，所得产物抽滤水洗至中性，烘干，得粗壳聚糖；
3）提纯：于粗壳聚糖中，按固液比1:30，加入质量百分浓度为10%的醋酸溶液，磁力搅拌使其溶解后，用1N的氢氧化钠溶液调节pH至10，8000r/min离心20min，离心收集沉淀，加去离子水悬浮，抽滤洗至中性，冷冻干燥，得提纯的柞蚕蛹壳聚糖；
4）按固液比1:100，于提纯的柞蚕蛹壳聚糖中再次加入0.2mol/L的醋酸溶液，机械搅拌完全溶解，用氢氧化钠溶液或醋酸溶液调节壳聚糖溶液pH至5.0后，升温至50℃，按2500U/g的酶用量加入纤维素酶，50℃恒温摇床中酶解24h，得酶解液；
5）取酶解液于沸水浴中灭活10min，用氢氧化钠溶液调节酶解液的pH至8，离心取上清液，冷冻干燥，得低聚壳聚糖粉末。
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Citations (3)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN107058420A (zh) * | 2017-03-02 | 2017-08-18 | 杭州垚信生物科技有限公司 | 一种将甲壳素制备成壳寡糖的方法 |
| CN111085171A (zh) * | 2018-10-23 | 2020-05-01 | 南通安广美术图案设计有限公司 | 一种磁性壳聚糖改性蚕丝织物的制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 低聚壳聚糖的制备、溶解及其包覆海藻纤维的结构与性能;张传杰;《中国博士论文库工程科技Ⅰ辑》;第14页第2.3.2节，第16页第2.3.5节 * |
| 柞蚕蛹外壳壳聚糖的制备及理化性质研究;张兰杰,侯冬岩,辛广,谷昊,孙晓瑜;江苏农业科学(02);第111-112页 * |
| 柞蚕蛹皮壳聚糖不同提取方法的比较研究;薛强;《中国优秀硕士论文库工程科技Ⅰ辑》;第7页最后一段至第8页倒数第2段，第13页第2-5段，第14页第3-4段 * |
| 蛹皮壳聚糖的制备及在毛织物艾蒿染色中的应用;贾艳梅;;毛纺科技(11);第14-17页 * |
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