CN105925640B - 酵母β-葡聚糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种酵母β‑葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：(1)将5‑15重量份的酿酒酵母加入30‑90重量份的酶液中，调节pH至5‑10，在45‑65℃水浴下诱导自溶10‑30小时，然后在90‑100℃水浴下灭酶活5‑15分钟，得到酶解液；(2)将酶解液离心，水洗2‑4次，得到沉淀物；(3)将沉淀物加入到10‑30重量份的酸液中，在65‑125℃下酸解1‑5小时，离心，水洗1‑3次，得到酸解物；(4)将酸解物用乙醇洗涤1‑3次，过滤，烘干，即得。本发明提供的酵母β‑葡聚糖制备方法，与现有技术相比，本发明最终得到的产品纯度高。本发明可实现工业副产物废啤酒酵母的综合利用，增加工业副产物的利用率和附加价值，具有重大的经济效益和环保意义。
Description
技术领域
本发明涉及营养食品领域，具体涉及一种酵母β-葡聚糖的制备方法。
背景技术
β-葡聚糖是一类广泛存在于细菌、真菌、藻类和植物体内的多糖，它的主要来源之一即为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisisae)。
酵母细胞壁从内向外分为三层，分别为葡聚糖层、蛋白层和甘露聚糖层。酵母的细胞壁占酵母细胞干重的25-30％，其中β-葡聚糖占50-60％、甘露聚糖占31％左右，除此之外还有11-13％左右的蛋白质、9％的脂类和1-2％的几丁质。其中，β-葡聚糖和几丁质主要作用是维持细胞壁结构的稳定性，从而保持细胞正常的生理形态。甘露聚糖的主要作用是特异性地识别外来的物质，从而达到维持细胞的免疫功能。
葡聚糖构成了细胞壁的基质，是酵母细胞壁最为重要的结构成分之一。根据β-葡聚糖的不同提取方法，可以分为碱溶性葡聚糖、碱不溶酸溶葡聚糖和碱不溶酸不溶葡聚糖三种。根据葡聚糖的连接方式，又可以分为β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖。β-1,3-葡聚糖具有良好的生物活性，这主要由它的连接方式、分子大小和构象来决定。高分子的β-1,3-葡聚糖具有独特的分子结构，会形成三股螺旋的构象，正是这种三股螺旋的结构，β-1,3-葡聚糖才具有免疫调节等活性。研究表明，分子量大于90kDa的分子才能形成三重螺旋的有序结构，有利于分子与受体发生作用，才具有生物效应。酵母细胞壁中85％的葡聚糖是由β-1,3糖苷键连接，同时含有3％的β-1,6糖苷键，聚合度和分子量都相当高，具有很强的免疫活性。
酿酒酵母β-葡聚糖的制备方法主要分为酸法、碱法、酸碱法、超声波法和结合法等。
本发明提供了一种酵母β-葡聚糖的制备方法，对于酵母的综合利用有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种酵母β-葡聚糖的制备方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种酵母β-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将5-15重量份的酿酒酵母加入30-90重量份的酶液中，调节pH至5-10，在45-65℃水浴下诱导自溶10-30小时，然后在90-100℃水浴下灭酶活5-15分钟，得到酶解液；
(2)将酶解液离心，水洗2-4次，得到沉淀物；
(3)将沉淀物加入到10-30重量份的酸液中，在65-125℃下酸解1-5小时，离心，水洗1-3次，得到酸解物；
(4)将酸解物用乙醇洗涤1-3次，过滤，烘干，即得。
所述的步骤(1)中调节pH值可以采用NaOH溶液、HCl溶液等。
优选地，所述步骤(1)中的酶液由下述质量百分比的原料组成：无花果蛋白酶1-5％、溶菌酶1-5％、β-甘露聚糖酶1-5％、水87-97％。
优选地，所述步骤(2)中的酸液由下述质量百分比的原料组成：乳酸0.2-2％、苹果酸0.2-2％、柠檬酸0.2-2％、水94-99％。
优选地，所述步骤(4)中的过滤为板框过滤机过滤，采用150-200目的滤布。
本发明提供的酵母β-葡聚糖制备方法，以酿酒酵母为原料，经酶解、酸解、过滤等步骤后烘干制得。与现有技术相比，本发明最终得到的产品纯度高。本发明可实现工业副产物废啤酒酵母的综合利用，增加工业副产物的利用率和附加价值，具有重大的经济效益和环保意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例中各原料介绍：
无花果蛋白酶，CAS号：9001-33-6，采用南京鑫越源生物科技有限公司提供的酶活为100U/mg的无花果蛋白酶。
溶菌酶，CAS号：12650-88-3，采用西安浩天生物工程有限公司提供的酶活力为100U/mg的溶菌酶。
β-甘露聚糖酶，CAS号：37288-54-3，采用广州亿添元生物科技有限公司提供的酶活为100U/mg的β-甘露聚糖酶。
乳酸，CAS号：849585-22-4。
苹果酸，为D-苹果酸，CAS号：636-61-3。
柠檬酸，CAS号：77-92-9。
酿酒酵母，采用山东隆兴生物工程有限公司提供的酿酒酵母。
实施例1
酵母β-葡聚糖的具体制备方法，包括以下步骤：
(1)将100g的酿酒酵母加入500g的酶液中搅拌混合均匀，并用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，在55℃水浴下诱导自溶24小时，然后在95℃水浴下灭酶活10分钟，得到酶解液；
(2)将酶解液用离心机5000转/分离心10分钟，得到沉淀物a；将沉淀物a加入到200g蒸馏水300转/分搅拌5分钟后，用离心机5000转/分离心10分钟，得到沉淀物b；将沉淀物b加入到200g蒸馏水300转/分搅拌5分钟后，用离心机5000转/分离心10分钟，得到沉淀物c；
(3)将沉淀物c加入到200g的酸液中，在80℃下酸解2小时，用离心机5000转/分离心10分钟，得到酸解物a；将酸解物a加入到200g蒸馏水300转/分搅拌5分钟后，用离心机5000转/分离心10分钟，得到酸解物b；将酸解物b加入到200g蒸馏水300转/分搅拌5分钟后，用离心机5000转/分离心10分钟，得到酸解物c；
(4)将酸解物c加入到100g乙醇中300转/分搅拌5分钟后，用板框过滤机采用180目的滤布过滤，将滤渣在-30℃下冻干。得到实施例1的酵母β-葡聚糖。
所述步骤(1)中的酶液由下述质量百分比的原料组成：无花果蛋白酶2％、溶菌酶2％、β-甘露聚糖酶2％、蒸馏水94％；将无花果蛋白酶、溶菌酶、β-甘露聚糖酶加入到蒸馏中搅拌混合均匀即得酶液。
所述步骤(2)中的酸液由下述质量百分比的原料组成：乳酸0.8％、苹果酸0.8％、柠檬酸0.8％、蒸馏水97.6％；将乳酸、苹果酸、柠檬酸加入到蒸馏水中搅拌混合均匀即得酸液。
实施例2
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述步骤(1)中的酶液由下述质量百分比的原料组成：溶菌酶3％、β-甘露聚糖酶3％、蒸馏水94％。将溶菌酶、β-甘露聚糖酶加入到蒸馏水中搅拌混合均匀即得酶液。得到实施例2的酵母β-葡聚糖。
实施例3
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述步骤(1)中的酶液由下述质量百分比的原料组成：无花果蛋白酶3％、β-甘露聚糖酶3％、蒸馏水94％。将无花果蛋白酶、β-甘露聚糖酶加入到蒸馏水中搅拌混合均匀即得酶液。得到实施例3的酵母β-葡聚糖。
实施例4
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述步骤(1)中的酶液由下述质量百分比的原料组成：无花果蛋白酶3％、溶菌酶3％、蒸馏水94％。将无花果蛋白酶、溶菌酶加入到蒸馏水中搅拌混合均匀即得酶液。得到实施例4的酵母β-葡聚糖。
实施例5
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述步骤(2)中的酸液由下述质量百分比的原料组成：苹果酸1.2％、柠檬酸1.2％、蒸馏水97.6％。将苹果酸、柠檬酸加入到蒸馏水中搅拌混合均匀即得酸液。得到实施例5的酵母β-葡聚糖。
实施例6
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述步骤(2)中的酸液由下述质量百分比的原料组成：乳酸1.2％、柠檬酸1.2％、蒸馏水97.6％。将乳酸、柠檬酸加入到蒸馏水中搅拌混合均匀即得酸液。得到实施例6的酵母β-葡聚糖。
实施例7
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述步骤(2)中的酸液由下述质量百分比的原料组成：乳酸1.2％、苹果酸1.2％、蒸馏水97.6％。将乳酸、苹果酸加入到蒸馏水中搅拌混合均匀即得酸液。得到实施例7的酵母β-葡聚糖。
测试例1
对实施例1-7制备的酵母β-葡聚糖的产率进行测试。
称取10mg样品于具塞试管中，加1.5mL 72％(m/m)的硫酸溶液，混匀，室温放置3h，然后加入去离子水使硫酸的最终浓度为2mol/L，于100℃下水解4h，取出冷却至室温，调pH至中性(6.5～7.0)，再用0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)定容至100mL，取2mL(空白取2mL水)置于10mL容量瓶中，加3mL GOPGD双酶试剂，37℃反应1h，加水定容至10mL，紫外分光光度计测定吸光值，计算样品葡聚糖含量。
产率(％)＝酵母β-葡聚糖质量/酿酒酵母质量×100
具体结果见表1。
表1：酵母β-葡聚糖产率结果表单位：％
比较实施例1与实施例2-4，实施例1(无花果蛋白酶、溶菌酶、β-甘露聚糖酶复配)酵母β-葡聚糖产率明显高于实施例2-4(无花果蛋白酶、溶菌酶、β-甘露聚糖酶中任意二者复配)；比较实施例1与实施例5-7，实施例1(乳酸、苹果酸、柠檬酸复配)酵母β-葡聚糖产率明显高于实施例5-7(乳酸、苹果酸、柠檬酸中任意二者复配)。
测试例2
将实施例1-7制备的酵母β-葡聚糖，置于25℃，相对湿度85％环境下保藏半年，采用《GB/T 4789.2-2010食品卫生微生物学检验菌落总数测定》进行菌落总数测试。具体测试结果见表2。
表2：菌落总数测试表cfu/g
| 菌落总数 | |
| 实施例1 | 4.6×10<sup>3</sup> |
| 实施例2 | 9.8×10<sup>3</sup> |
| 实施例3 | 9.3×10<sup>3</sup> |
| 实施例4 | 10.1×10<sup>3</sup> |
| 实施例5 | 11.6×10<sup>3</sup> |
| 实施例6 | 11.3×10<sup>3</sup> |
| 实施例7 | 11.8×10<sup>3</sup> |
发明人意外的发现，比较实施例1与实施例2-4，实施例1(无花果蛋白酶、溶菌酶、β-甘露聚糖酶复配)防腐性能明显优于实施例2-4(无花果蛋白酶、溶菌酶、β-甘露聚糖酶中任意二者复配)；比较实施例1与实施例5-7，实施例1(乳酸、苹果酸、柠檬酸复配)防腐性能明显优于实施例5-7(乳酸、苹果酸、柠檬酸中任意二者复配)。
测试例3
将实施例1-7制备的酵母β-葡聚糖进行DPPH自由基清除活性测试。
DPPH法是一种快速、简便、重复性高的测定抗氧化活性的方法。称取DPPH粉末0.0039g，用无水乙醇溶解DPPH粉末，并定容至100mL，配制成最终浓度为0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液。将实施例1-6制备的酵母β-葡聚糖配制成相同浓度的样品，将2.0ml的样品与2.0mL的DPPH乙醇溶液混合均匀，在25℃下避光反应1h后，测定在517nm初的吸光值As；同时，用水和DPPH乙醇溶液反应作为对照组测定吸光值标记为Ac，用样品和不含有DPPH的无水乙醇溶液反应作为背景组测定吸光值标记为Ax。
DPPH自由基清除率(％)＝100-(As-Ax)/Ac×100
测试结果见表3。
表3：DPPH自由基清除活性测试结果表单位：％
| DPPH自由基清除率 | |
| 实施例1 | 29 |
| 实施例2 | 24 |
| 实施例3 | 26 |
| 实施例4 | 21 |
| 实施例5 | 24 |
| 实施例6 | 20 |
| 实施例7 | 21 |
在比较实施例1与实施例2-4，实施例1(无花果蛋白酶、溶菌酶、β-甘露聚糖酶复配)DPPH自由基清除活性明显高于实施例2-4(无花果蛋白酶、溶菌酶、β-甘露聚糖酶中任意二者复配)；比较实施例1与实施例5-7，实施例1(乳酸、苹果酸、柠檬酸复配)DPPH自由基清除活性明显高于实施例5-7(乳酸、苹果酸、柠檬酸中任意二者复配)。
Claims (1)
1.一种酵母β-葡聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将100g的酿酒酵母加入500g的酶液中搅拌混合均匀，并用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，在55℃水浴下诱导自溶24小时，然后在95℃水浴下灭酶活10分钟，得到酶解液；
（2）将酶解液用离心机5000转/分离心10分钟，得到沉淀物a；将沉淀物a加入到200g蒸馏水300转/分搅拌5分钟后，用离心机5000转/分离心10分钟，得到沉淀物b；将沉淀物b加入到200g蒸馏水300转/分搅拌5分钟后，用离心机5000转/分离心10分钟，得到沉淀物c；
（3）将沉淀物c加入到200g的酸液中，在80℃下酸解2小时，用离心机5000转/分离心10分钟，得到酸解物a；将酸解物a加入到200g蒸馏水300转/分搅拌5分钟后，用离心机5000转/分离心10分钟，得到酸解物b；将酸解物b加入到200g蒸馏水300转/分搅拌5分钟后，用离心机5000转/分离心10分钟，得到酸解物c；
（4）将酸解物c加入到100g乙醇中300转/分搅拌5分钟后，用板框过滤机采用180目的滤布过滤，将滤渣在-30℃下冻干；得酵母β-葡聚糖；
所述步骤（1）中的酶液由下述质量百分比的原料组成：无花果蛋白酶2%、溶菌酶2%、β-甘露聚糖酶2%、蒸馏水94%；将无花果蛋白酶、溶菌酶、β-甘露聚糖酶加入到蒸馏中搅拌混合均匀即得酶液；
所述步骤（2）中的酸液由下述质量百分比的原料组成：乳酸0.8%、苹果酸0.8%、柠檬酸0.8%、蒸馏水97.6%；将乳酸、苹果酸、柠檬酸加入到蒸馏水中搅拌混合均匀即得酸液。
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