CN114591448B - 一种桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖及其制备和用途 - Google Patents

一种桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖及其制备和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖及其制备和用途。该桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述多糖由半乳糖、甘露糖、岩藻糖、3‑O‑甲基‑半乳糖和葡萄糖组成，其对应摩尔比为5.8‑6.7:3.5‑4.3:2.6‑3.5:1.6‑2.5:0.7‑1.2。该桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖由桑树桑黄子实体经复合酶酶解后热水浸提分离纯化得到。本发明对纯化后多糖进行组分分析、结构鉴定及生物活性研究，发现本发明桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖具有良好的抗氧化活性、增强免疫力活性和抗肿瘤活性，可以直接作为抗氧化、增强免疫力和/或抗肿瘤功能品，也可用于制备抗氧化、增强免疫力和/或抗肿瘤功能产品，可广泛用于食品、保健品、动物饲料、医药等领域。

Description

一种桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖及其制备和用途
技术领域
本发明涉及多糖技术领域，具体涉及一种桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖及其制备和用途。
背景技术
桑黄孔菌属是一类多年生大型药用真菌，在《本草纲目》和《神农本草经》等历代本草著作中均有桑黄及其药效的明确记载，是目前公认的抗癌效果较高的一种药用大型真菌，有“森林黄金”的美称。自2015年国际桑黄分类学界明确桑黄孔菌属的命名与分类以来，我国流通的多为杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)、鲍姆桑黄(Sanghuangporusbaumii)和桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)，其中只有桑树桑黄(Sanghuangporussanghuang)才是正宗的桑黄。
多糖是桑黄子实体中的主要有效成分之一，研究表明桑黄多糖具有抗肿瘤、保肝、抗氧化等多种生物活性；而且它的免疫调节、抗肿瘤等生物活性与其分子链构象及动力学性能紧密相关。由于受糖苷键连接方式、支化结构、分子内氢键、取代基团静电排斥及温度变化等因素的影响，多糖分子的微小变化会引起生物活性的改变。越来越多的研究表明多糖重要功能的发挥是由其结构特征决定的，其高级结构(二级及三级结构)更为密切，多糖的生物活性与其分子量、分子链构象(Conformation)紧密相关，了解该糖分子的构象更有助于阐明其生物活性作用机制。所以发现新的多糖组分及活性，对研究开发新食品保健品、新药等领域具有非常重要的科学意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从桑树桑黄子实体中分离确定出化学结构特征的新型水溶性甘露半乳聚糖，即桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖，该多糖有较强的生物活性，例如抗氧化活性、增强免疫力活性和抗肿瘤活性，具有实际应用价值。
本发明的另一目的是提供所述桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖的制备方法，该方法具有操作简单、易于控制的优点，适于工业化大规模生产。
本发明还提供了所述桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖的用途，其具有显著地抗氧化活性、增强免疫力活性和抗肿瘤活性，可以直接作为抗氧化、增强免疫力和/或抗肿瘤功能品，也可用于制备抗氧化、增强免疫力和/或抗肿瘤功能产品。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述多糖由半乳糖、甘露糖、岩藻糖、3-O-甲基-半乳糖和葡萄糖组成，其中，半乳糖、甘露糖、岩藻糖、3-O-甲基-半乳糖和葡萄糖的摩尔比为5.8-6.7:3.5-4.3:2.6-3.5:1.6-2.5:0.7-1.2。
为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
所述半乳糖为α-半乳糖，进一步优选为α-D-半乳糖。
所述甘露糖为α-甘露糖，进一步优选为α-D-甘露糖。
所述岩藻糖为α-岩藻糖，进一步优选为α-L-岩藻糖。
所述3-O-甲基-半乳糖为3-O-甲基-α-半乳糖，进一步优选为3-O-甲基-α-D-半乳糖。
所述葡萄糖为α-葡萄糖，进一步优选为α-D-葡萄糖。
所述多糖的结构单元优选主链结构为(1→6)连接的3-O-甲基-α-D-半乳糖(3-O-methyl-α-D-galactose，缩写为3-O-Me-α-D-Galp，简写为α-3-O-Me-Galp)残基、(1→6)连接的α-D-半乳糖(α-D-Galp)残基和(1→6)连接的α-D-甘露糖(α-D-Manp)残基；在主链上连续的四个(1→6)连接的α-D-甘露糖残基的C-2位上分别被三个α-L-岩藻糖(α-L-Fucp)端基和一个α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)端基取代。进一步优选，所述主链结构为(1→6)连接的3-O-甲基-α-D-半乳糖残基、(1→6)连接的α-D-半乳糖残基和(1→6)连接的α-D-甘露糖残基依次连接。
本发明桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖主链上的三个α-L-岩藻糖端基和一个α-D-葡萄糖端基有多种不同的变化组合，三个α-L-岩藻糖端基和一个α-D-葡萄糖端基在主链上连续的四个(1→6)连接的α-D-甘露糖残基的C-2位上可按任意顺序排列，例如可具有如式Ⅰ所示的结构单元，式Ⅰ仅作为四个端基一种排列顺序的示例，并不用于限制四个端基的排列顺序：
Figure BDA0003578258340000021
式Ⅰ中，Galp为吡喃型半乳糖，Manp为吡喃型甘露糖，Glcp为吡喃型葡萄糖，Fucp为吡喃型岩藻糖。式Ⅰ所示结构为一个重复单元，具体重复单元的数量依据桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖的重均分子量来确定。
可选地，所述桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖的重均分子量优选为10KDa-60KDa，进一步优选为10KDa-35KDa，最优选20.8KDa-23.6KDa。
所述桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖可采用水溶性多糖的制备方法从桑树桑黄子实体中制备得到，优选由桑树桑黄子实体经复合酶酶解-热水浸提分离纯化得到。包括：通过复合酶酶解-水提醇沉提取桑树桑黄子实体粗多糖，经酶-Sevage结合法去蛋白、超滤、阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化，真空冷冻干燥分离纯化组分得到桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖。具体技术方案如下：
所述桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖的制备方法，包括步骤：
(1)桑树桑黄子实体前处理：将桑树桑黄子实体洗净干燥粉碎，得到桑树桑黄子实体粉末；
(2)复合酶-热水提取：将步骤(1)中的桑树桑黄子实体粉末与水混合形成料液，先添加复合酶酶解，之后再用70℃-95℃热水提取、离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，在浓缩液中加入乙醇水溶液或乙醇，混匀，沉淀过夜，离心所得沉淀为一次桑树桑黄子实体粗多糖；
(3)去蛋白：将步骤(2)中一次桑树桑黄子实体粗多糖的水溶液用蛋白酶酶解，灭酶，离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液；
(4)超滤：将步骤(3)所得的提取液用截留分子量为5000Da-6000Da的超滤膜进行膜分离，收集截留液，真空冻干得二次桑树桑黄子实体粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次桑树桑黄子实体粗多糖的水溶液，经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖(DEAE纤维素-Sepharose)离子交换层析柱层析，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第一洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和真空冻干得到白色疏松絮状桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖，命名为SSPS1。
为了达到更好的发明效果，优选：
可选地，步骤(1)中，所述干燥条件为：在50℃-60℃(最优选55℃)干燥2h-6h；干燥条件比较温和，能够更好地保持桑树桑黄子实体中的营养物质，减少营养物质的流失。
可选地，所述桑树桑黄子实体粉末为过40目-100目筛的粉末，利于多糖的充分提取。
本发明桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)子实体，可采用市售产品。
可选地，步骤(2)中，所述复合酶选用纤维素酶和果胶酶，可以预先将桑树桑黄子实体中的木质结构等影响提取的物质分解，利于后续目标多糖的提取。所述纤维素酶和果胶酶的质量比优选为4-1:1。所述复合酶酶解温度为40℃-55℃，酶解时间为1h-2h。
可选地，所述乙醇水溶液或乙醇的用量为浓缩液体积的4倍-5倍。所述乙醇水溶液的体积百分浓度为大于等于90％。
可选地，所述沉淀过夜的温度优选为2℃-5℃。
可选地，所述料液中水作为提取剂，其用量一般没有严格的限制，可选用水的用量为桑树桑黄子实体粉末重量的2倍-5倍。所述提取时间以至少2小时为宜。
可选地，步骤(3)中，所述蛋白酶选用木瓜蛋白酶。所述蛋白酶的重量为一次桑树桑黄子实体粗多糖重量的1％-3％。
所述用蛋白酶酶解的条件优选为：在50℃-55℃水浴2h-2.5h。
本发明灭酶的条件采用本领域常规的灭酶条件，例如可在100℃-105℃灭酶15min-20min。
所述有机溶剂选用氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1。
可选地，步骤(4)中，选用超滤膜超滤利于工业化大规模生产使用，效率高。
可选地，步骤(5)中，所述二次桑树桑黄子实体粗多糖的水溶液的浓度在10mg/mL-25mg/mL，进一步优选为10mg/mL-15mg/mL；流速1.0mL/min-2.0mL/min。
所述二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析的条件可选用：采用梯度洗脱，洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L的NaCl水溶液，流速1.0mL/min-2.0mL/min。
所述凝胶过滤层析的条件可选用：洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3:1；流速0.5mL/min。
所述凝胶选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，例如市售的Sephacryl S系列(SephacrylS-200)等。
所述透析主要为了去除小分子物质，可选用透过分子量5000Da-6000Da的透析袋，以除去浓缩液中分子量小于5000Da-6000Da的小分子物质。
所述磷酸盐缓冲液等的配制方法按照本领域通用的方法，例如可参照《中国药典》。
本发明桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1具有良好的抗氧化活性、增强免疫力活性和抗肿瘤活性。例如：SSPS1在0.6mg/mL浓度时超氧阴离子自由基清除率可达54.37％-66.25％、羟自由基清除率可达61.86％-63.23％、DPPH自由基清除率可达51.64％-53.93％，较同从桑树桑黄子实体中提取分离纯化得到的SSPS2、SSPS3和空白对照组数据有极显著差异，表明SSPS1具有良好的抗氧化活性。SSPS1在0.6mg/mL浓度时，RAW264.7细胞中产生的NO含量在41.64μM-43.23μM、TNF-α含量在443.57pg/mL-445.82pg/mL、IL-1β含量在122.32pg/mL-125.21pg/mL、IL-6含量在54.87pg/mL-56.53pg/mL，较SSPS2、SSPS3和空白对照组数据有显著差异，表明SSPS1具有良好的增强免疫力活性。SSPS1在0.6mg/mL浓度时，对人肝癌细胞HepG2增殖抑制率在57.88％-58.9％、对人乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制率在50.38％-53.08％和对人结肠癌细胞SW480增殖抑制率在49.75％-52.16％，较SSPS2、SSPS3和空白对照组数据有极显著差异，表明SSPS1具有良好的抗肿瘤活性。因此，所述桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1可以直接作为具有抗氧化功能、增强免疫力功能和/或抗肿瘤功能的功能品使用，也可以与适当辅料一起用于制备具有抗氧化功能、增强免疫力功能和/或抗肿瘤功能的功能品。所述功能品包括添加剂、动物饲料、食品、保健品、药品等中的一种或多种。本发明桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖的抗肿瘤活性主要是通过SSPS1诱导肿瘤细胞凋亡实现的，例如诱导HepG2肿瘤细胞凋亡。
本发明所用的原料、试剂、耗材、仪器等均可采用市售产品。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明通过对桑树桑黄子实体提取分离首次获得一种具有生物活性的大分子桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1，经检测其多糖重量百分含量在99％以上，经单糖组成鉴定发现该多糖是由半乳糖、甘露糖、岩藻糖、3-O-甲基-半乳糖和葡萄糖组成，其中，半乳糖、甘露糖、岩藻糖、3-O-甲基-半乳糖和葡萄糖的摩尔比为5.8-6.7:3.5-4.3:2.6-3.5:1.6-2.5:0.7-1.2。FTIR证明SSPS1是甘露半乳聚糖。激光光散射法证明SSPS1是重均分子量均一的多糖且重均分子量在10KDa-60KDa。核磁共振图谱确定SSPS1糖苷键连接方式，多糖的结构单元中主链结构为(1→6)连接的3-O-甲基-α-D-半乳糖残基、(1→6)连接的α-D-半乳糖残基和(1→6)连接的α-D-甘露糖残基；在主链上连续的四个(1→6)连接的α-D-甘露糖残基的C-2位上分别被三个α-L-岩藻糖端基和一个α-D-葡萄糖端基取代。原子力显微镜观测出该多糖的单糖链高度为0.420nm-0.900nm。
本发明桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1有良好生物活性，例如良好的抗氧化活性、增强免疫力活性和抗肿瘤活性，具有实际应用价值。
本发明制备方法操作简便，易于控制，能够获得具有较高有序性、结构明确的大分子，为深入研究其高级结构与功能关系提供研究价值。利用本发明方法制备桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖，不影响其天然结构和活性，且该方法对设备要求较低、成本低，大多数工厂均可采用现有设备生产，利于工业生产上大规模的推广、开发和使用。
附图说明
图1为二次桑树桑黄子实体粗多糖水溶液经DEAE纤维素-琼脂糖离子交换层析收集的洗脱液在490nm的吸光度(Absorbance at 490nm，记作A490)曲线，Tube number为管数；
图2为经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶Sephacryl S-200纯化后的洗脱液在490nm的吸光度(Absorbance at 490nm)曲线，Tube number为管数；
图3为实施例6中乙酰化产物的GC-MS图谱；A为标准品对照图谱，B为样品图谱；其中，纵坐标Relative Abundance为响应值，横坐标为保留时间：分钟(min)，Rham为鼠李糖，Rib为核糖，Ara为阿拉伯糖，Fuc为岩藻糖，Xyl为木糖，Man为甘露糖，Glc为葡萄糖，Gal为半乳糖；
图4为实施例7中部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物的GC-MS图；纵坐标RelativeAbundance为响应值，横坐标Time(min)为保留时间：分钟；
图5为SSPS1的激光光散射图；其中，纵坐标Relative Scale为相对比例，横坐标time(min)为时间(分钟)；
图6A为SSPS1的1H-NMR图谱，图6B为SSPS1的13C-NMR图谱，图6C为SSPS1的HSQC图谱，图6D为SSPS1的COSY图谱，图6E为SSPS1的TCOSY图谱，图6F为SSPS1的1H-13C HMBC图谱。
图7为SSPS1二维原子力显微镜测试图；
图8为不同浓度的SSPS1对HepG2细胞的抗肿瘤作用效果图；其中纵坐标Inhibition(％)表示抑制率(％)，横坐标Concentration(μg/mL)表示浓度(μg/mL)；
图9为不同浓度的SSPS1对HepG2细胞的凋亡作用图；其中纵坐标PI表示PI响应值，横坐标Annexin V-FITC表示Annexin V-FITC响应值，A、B、C、D分别表示SSPS1水溶液浓度为0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL；
图10A、10D、10G和10J分别表示SSPS1样品浓度为0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL影响下HepG2细胞形貌图；图10B和10C分别为图10A中细胞形貌中直线高度测量值曲线图、直线能谱曲线图；图10E和10F分别为图10D中细胞形貌中直线高度测量值曲线图、直线能谱曲线图；图10H和10I分别为图10G中细胞形貌中直线高度测量值曲线图、直线能谱曲线图；图10K和10L分别为图10J中细胞形貌中直线高度测量值曲线图、直线能谱曲线图。
具体实施方式
以下结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
桑树桑黄子实体(Sanghuangporus sanghuang)购于同仁堂药店。
实施例1
(1)桑树桑黄子实体前处理：将桑树桑黄子实体水洗干净后在55℃干燥3h烘干，粉碎，过40目筛，得到桑树桑黄子实体粉末。
(2)提取：将桑树桑黄子实体粉末与水混合形成料液，水与桑树桑黄子实体粉末的重量比为2：1，先添加由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶(纤维素酶和果胶酶的质量比为2:1)在40℃酶解2h，之后再在70℃提取3h，离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，在浓缩液中加入占浓缩液体积4倍量、体积百分浓度95％的乙醇水溶液，搅拌混匀，3℃沉淀过夜，离心所得沉淀为一次桑树桑黄子实体粗多糖。
(3)去蛋白：在一次桑树桑黄子实体粗多糖的水溶液中加入木瓜蛋白酶酶解，蛋白酶的添加量为一次桑树桑黄子实体粗多糖重量的1％，酶解条件：在55℃水浴2h，经105℃灭酶15min，离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用氯仿和正丁醇有机溶剂(氯仿和正丁醇的体积比为4:1)离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液。
(4)超滤：将步骤(3)所得的提取液用截留分子量为5000Da的超滤膜进行膜分离，膜面积为1m2，膜通量为0.15m2/h，压力差为0.15MPa、料液温度为25℃的条件下进行膜分离，收集截留液，经真空冷冻干燥得到二次桑树桑黄子实体粗多糖；
(5)纯化：将二次桑树桑黄子实体粗多糖溶于去离子水，得到10mg/mL二次桑树桑黄子实体粗多糖的水溶液，经去离子水平衡好的DEAE纤维素-Sepharose离子交换层析柱(10cm×26cm)层析，上样量10mL，流速1.0mL/min；洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L NaCl水溶液梯度洗脱，洗脱液流速1.0mL/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰(如图1)，分别收集第一洗脱峰的洗脱液、第二洗脱峰的洗脱液以及第三洗脱峰的洗脱液。
将收集的第一洗脱峰的洗脱液经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶(Sephacryl S-200)层析柱(2.6cm×100cm)过滤层析，上样量5mL，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，洗脱液流速0.5mL/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰(如图2)，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透过分子量为5000Da的透析袋透析，去除透过液，透析液经冻干得到白色疏松絮状桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖，命名为SSPS1。
将收集的第二洗脱峰的洗脱液经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶(Sephacryl S-200)层析柱(2.6cm×100cm)过滤层析，上样量5mL，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，洗脱液流速0.5mL/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透过分子量为5000Da的透析袋透析，去除透过液，透析液经冻干得到桑树桑黄子实体多糖，命名为SSPS2。
将收集的第三洗脱峰的洗脱液经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶(Sephacryl S-200)层析柱(2.6cm×100cm)过滤层析，上样量5mL，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，洗脱液流速0.5mL/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透过分子量为5000Da的透析袋透析，去除透过液，透析液经冻干得到桑树桑黄子实体多糖，命名为SSPS3。
实施例2
(1)桑树桑黄子实体前处理：将桑树桑黄子实体水洗干净后在50℃干燥6h烘干，粉碎，过80目筛，得到桑树桑黄子实体粉末。
(2)提取：将桑树桑黄子实体粉末与水混合形成料液，水与桑树桑黄子实体粉末的重量比为3：1，先添加由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶(纤维素酶和果胶酶的质量比为4:1)在55℃酶解1h，之后再在85℃提取2h，离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，在浓缩液中加入占浓缩液体积5倍量、体积百分浓度97％的乙醇水溶液，搅拌混匀，2℃沉淀过夜，离心所得沉淀为一次桑树桑黄子实体粗多糖。
(3)去蛋白：在一次桑树桑黄子实体粗多糖的水溶液中加入木瓜蛋白酶酶解，蛋白酶的添加量为一次桑树桑黄子实体粗多糖重量的3％，酶解条件：在50℃水浴2.5h，经105℃灭酶20min，离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用氯仿和正丁醇有机溶剂(氯仿和正丁醇的体积比为4:1)离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液。
(4)超滤：将步骤(3)所得的提取液用截留分子量为6000Da的超滤膜进行膜分离，膜面积为1m2，膜通量为0.10m2/h，压力差为0.10MPa、料液温度为20℃的条件下进行膜分离，收集截留液，经真空冷冻干燥得到二次桑树桑黄子实体粗多糖；
(5)纯化：将二次桑树桑黄子实体粗多糖溶于去离子水，得到15mg/mL二次桑树桑黄子实体粗多糖的水溶液，经去离子水平衡好的DEAE纤维素-Sepharose离子交换层析柱(10cm×26cm)层析，上样量10mL，流速1.5mL/min；洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L NaCl水溶液梯度洗脱，洗脱液流速1.5mL/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰(如图1)，收集第一洗脱峰的洗脱液。将收集的第一洗脱峰的洗脱液经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶(Sephacryl S-200)层析柱(2.6cm×100cm)过滤层析，上样量5mL，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为3:1)，洗脱液流速0.5mL/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰(如图2)，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透过分子量为6000Da的透析袋透析，去除透过液，透析液经冻干得到白色疏松絮状桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖，命名为SSPS1。
实施例3
(1)桑树桑黄子实体前处理：将桑树桑黄子实体水洗干净后在60℃干燥2h烘干，粉碎，过100目筛，得到桑树桑黄子实体粉末。
(2)提取：将桑树桑黄子实体粉末与水混合形成料液，水与桑树桑黄子实体粉末的重量比为5：1，先添加由纤维素酶和果胶酶组成的复合酶(纤维素酶和果胶酶的质量比为1:1)在50℃酶解1h，之后再在95℃提取2h，离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，在浓缩液中加入占浓缩液体积5倍量、体积百分浓度90％的乙醇水溶液，搅拌混匀，5℃沉淀过夜，离心所得沉淀为一次桑树桑黄子实体粗多糖。
(3)去蛋白：在一次桑树桑黄子实体粗多糖的水溶液中加入木瓜蛋白酶酶解，蛋白酶的添加量为一次桑树桑黄子实体粗多糖重量的2％，酶解条件：在55℃水浴2.5h，经100℃灭酶20min，离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用氯仿和正丁醇有机溶剂(氯仿和正丁醇的体积比为4:1)离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液。
(4)超滤：将步骤(3)所得的提取液用截留分子量为5000Da的超滤膜进行膜分离，膜面积为1m2，膜通量为0.20m2/h，压力差为0.20MPa、料液温度为28℃的条件下进行膜分离，收集截留液，经真空冷冻干燥得到二次桑树桑黄子实体粗多糖；
(5)纯化：将二次桑树桑黄子实体粗多糖溶于去离子水，得到10mg/mL二次桑树桑黄子实体粗多糖的水溶液，经去离子水平衡好的DEAE纤维素-Sepharose离子交换层析柱(10cm×26cm)层析，上样量10mL，流速2.0mL/min；洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L NaCl水溶液梯度洗脱，洗脱液流速2.0mL/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰(如图1)，收集第一洗脱峰的洗脱液。将收集的第一洗脱峰的洗脱液经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶(Sephacryl S-200)层析柱(2.6cm×100cm)过滤层析，上样量5mL，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，洗脱液流速0.5mL/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖490nm吸收峰(如图2)，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透过分子量为5000Da的透析袋透析，去除透过液，透析液经冻干得到白色疏松絮状桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖，命名为SSPS1。
下面是对SSPS1结构鉴定或性能分析的实施例：
实施例4：理化性质组分及分子量检测
将实施例1制得的桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.5％。从图5看出，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。样品SSPS1的保留时间主要分布在29min-46min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明SSPS1是分子量分布均一的多糖。分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。该桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖Mw/Mn的比值为1.03，比较接近1，表明SSPS1是一个相对分布较窄的多糖组分，其分子量Mw＝2.08×104Da。
将实施例2制得的桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.6％。其激光光散射图与图5相同，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。样品SSPS1的保留时间主要分布在29min-46min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明SSPS1是分子量分布均一的多糖。该桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖Mw/Mn的比值为1.15，比较接近1，表明SSPS1是一个相对分布较窄的多糖组分，其分子量Mw＝2.36×104Da。
将实施例3制得的桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.5％。其激光光散射图与图5相同，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。样品SSPS1的保留时间主要分布在29min-46min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明SSPS1是分子量分布均一的多糖。该桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖Mw/Mn的比值为1.24，比较接近1，表明SSPS1是一个相对分布较窄的多糖组分，其分子量Mw＝2.26×104Da。
实施例5：不同桑树桑黄子实体多糖的生物活性对比
1.体外抗氧化试验
1.1 DPPH自由基清除能力的测定
参照李亚辉等的方法，精确配制DPPH浓度为5mmol/L的DPPH-乙醇溶液，分别精确吸取3mL不同质量浓度的桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1样品水溶液，各加入5mLDPPH-乙醇溶液，混匀后在室温下静置30min，以5mL无水乙醇和3mL蒸馏水的混合液为参比，测定517nm波长处的吸光度。样品对DPPH自由基清除率(R1，％)计算为：R1＝[1-(A1-A2)/A0]×100％。式中：A0为只加DPPH-乙醇溶液的吸光度；A1为样品和DPPH-乙醇溶液的吸光度；A2为样品水溶液的吸光度。
1.2超氧阴离子自由基(O2 －自由基)清除能力测定
采用邻苯三酚自氧化法，4.5mL pH 8.2Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L)分别与0.5mL不同质量浓度桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1样品水溶液混合，于25℃水浴中预热20min，加入0.5mL 25mmol/L邻苯三酚水溶液。混匀后于25℃水浴中反应5min后，加1mL8mol/LHCl水溶液终止反应10min，后于420nm波长处测定吸光度。样品对超氧阴离子自由基清除率(R2)计算为：R2＝100％×(A0-A1)/A0。式中：A1为加入样品溶液后反应液的吸光度；A0为等量蒸馏水代替样品溶液的吸光度。
1.3羟基自由基清除能力测定
羟自由基清除能力测定采用Fenton反应体系。在10mL试管中加入2mL6mmol/LFeSO4水溶液、2mL 6mmol/L H2O2水溶液、2mL 6mmol/L水杨酸水溶液和2mL不同质量浓度的桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1样品水溶液，在37℃下反应1h，在510nm波长处测定反应液吸光度，以VC作对照。样品对羟自由基清除率(R3，％)计算为：R3＝[A0-(A1-A2)]/A0×100％。式中：A0为将2mL样品水溶液用2mL蒸馏水代替反应液的吸光度；A1为添加样品水溶液的反应体系的反应液的吸光度；A2为单纯样品水溶液的吸光度。
表1不同桑树桑黄子实体多糖的抗氧化活性对比
Figure BDA0003578258340000121
注：SSPS1分别与SSPS2、SSPS3对比，*表示P<0.05，**表示p<0.01。
比较二次桑树桑黄子实体粗多糖经DEAE纤维素-Sepharose分离得到的3个组分SSPS1、SSPS2、SSPS3的体外抗氧化实验结果，由表1可以看出，与空白对照组相比，桑黄子实体多糖组分SSPS3的超氧阴离子自由基清除率、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率均无显著差别，表明桑黄子实体多糖组分SSPS3无体外抗氧化活性。桑黄子实体多糖组分SSPS2的超氧阴离子自由基清除率、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率比SSPS3略强，但差别不显著。桑黄子实体多糖组分SSPS1在超氧阴离子自由基清除率、羟自由基清除率和DPPH自由基清除率方面均高于SSPS2和SSPS3，且差异极显著(P<0.01)，表明SSPS1具有较强的体外抗氧化能力。由此可见，从桑树桑黄子实体中提取分离出的多糖组分抗氧化活性差别巨大，桑黄子实体多糖组分SSPS3不具有抗氧化能力，SSPS1具有显著地体外抗氧化活性。
2.体外免疫功能实验：
2.1细胞培养
RAW264.7细胞以RPMI 1640(含20μg/mLPMB，质量百分比10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)完全培养液于37℃、体积百分比5％CO2细胞培养箱中培养，第4-6代指数生长期细胞用于实验。CCK-8法测定RAW264.7巨噬细胞的细胞活力。
RAW264.7细胞在96孔板中以5×104个细胞/mL/孔的密度预孵育24h。每孔加入多糖样品，37℃孵育24h。根据Griess试剂法测定RAW264.7细胞培养上清中NO的含量。按照ELISA试剂盒说明书，使用ELISA试剂盒检测RAW264.7细胞培养上清中炎症细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的含量水平(2021，食品工业科技，祁嘉仪，曾冉华，陈忠正，林晓蓉，张玉婷，吴吉莉，高雄，李斌，点柄乳牛肝菌多糖的结构表征及其免疫调节活性的研究)。
表2不同桑树桑黄子实体多糖的增强免疫力功能对比
Figure BDA0003578258340000122
Figure BDA0003578258340000131
注：SSPS1分别与SSPS2、SSPS3对比，*表示P<0.05，**表示p<0.01。
比较二次桑树桑黄子实体粗多糖经DEAE纤维素-Sepharose分离得到的3个组分SSPS1、SSPS2、SSPS3的体外增强免疫力能力，由表2可以看出，与空白对照组相比，桑黄多糖组分SSPS3未促进RAW264.7细胞产生NO、TNF-α、IL-1β、IL-6，表明桑黄多糖组分SSPS3无体外增强免疫力活性。桑黄多糖组分SSPS2对RAW264.7细胞产生NO、TNF-α、IL-1β、IL-6的促进作用比SSPS3略强，但差异不显著。与SSPS2和SSPS3相比，桑黄多糖组分SSPS1显著促进RAW264.7细胞产生NO、TNF-α、IL-1β、IL-6，差异显著(P<0.05)，表明SSPS1具有较强的体外增强免疫力活性。由此可见，从桑树桑黄子实体中提取分离出的多糖组分增强免疫力活性差别巨大，桑黄多糖组分SSPS3不具有免疫调节活性，SSPS1具有显著地免疫调节活性。
3.体外抗肿瘤(MTT法)
取对数生长期的人肝癌细胞HepG-2、人乳腺癌细胞MCF-7和人结肠癌细胞SW480，贴壁细胞用0.25％胰蛋白酶消化，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1-10×104个/mL的细胞悬液，经过准确的细胞计数后按500个细胞/孔接种于96孔培养板中，每孔加100μL，置于37℃5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h，再加入用完全培养基将桑黄多糖稀释成不同浓度的样品溶液10μL，空白对照组为加入等体积的RPMll640完全培养基，每组设5个复孔，将细胞培养板移入CO2培养箱中，在37℃5％CO2及饱和湿度条件下培养24h、48h。培养结束后，每孔加入用按5mg/mL新鲜配制的四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液50μL，温育4小时，使MTT还原，当在倒置显微镜下看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体时倒掉上清液，每孔加二甲基亚砜(DMSO)200μL，用平板摇床摇匀后，使用酶标仪于570nm处测定光密度值(OD)，设置对照组，按公式计算细胞的抑制率。抑制率(％)＝(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100％。
表3不同桑树桑黄子实体多糖的抗肿瘤活性对比
Figure BDA0003578258340000132
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Figure BDA0003578258340000141
注：SSPS1分别与SSPS2、SSPS3对比，*表示P<0.05，**表示p<0.01。
比较二次桑树桑黄子实体粗多糖经DEAE纤维素-Sepharose分离得到的3个组分SSPS1、SSPS2、SSPS3的体外抗肿瘤活性，由表3可以看出，与空白对照组相比，桑黄多糖组分SSPS3对人肝癌细胞HepG2抑制率、对人乳腺癌细胞MCF-7抑制率和对人结肠癌细胞SW480抑制率无显著差异，表明桑黄多糖组分SSPS3不具有抑制肿瘤细胞的能力；桑黄多糖组分SSPS2对人肝癌细胞HepG2抑制率、对人乳腺癌细胞MCF-7抑制率和对人结肠癌细胞SW480抑制率比SSPS3略高，但差异不显著。与SSPS2和SSPS3相比，桑黄多糖组分SSPS1对人肝癌细胞HepG2抑制率、对人乳腺癌细胞MCF-7抑制率和对人结肠癌细胞SW480抑制率大幅提高，差异极显著(P<0.01)，表明SSPS1具有较强的体外抑制肿瘤细胞的活性。由此可见，从桑树桑黄子实体中提取分离出的多糖组分体外抑制肿瘤细胞的活性差别巨大，桑黄多糖组分SSPS3不具有抑制肿瘤细胞的能力，SSPS1在对人肝癌细胞HepG2抑制率、对人乳腺癌细胞MCF-7抑制率和对人结肠癌细胞SW480抑制率方面均明显高于SSPS2和SSPS3，差异显著。
实施例6：单糖组成
取实施例1、实施例2或者实施例3制得的桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖3mg，放入薄壁长试管中，加入2.0mol/L三氟乙酸4.0mL，封管，110℃水解2h。水解后，试管中溶液在低于40℃减压蒸干，然后加入甲醇蒸干，“加入甲醇蒸干”的步骤重复操作4-5次，以完全除去三氟乙酸，得到完全酸水解的样品。
将各种单糖标准品和完全酸水解的样品分别溶于3mL蒸馏水中，加入30mg硼氢化钠，密塞，于室温下还原3h，然后用冰醋酸中和过量的硼氢化钠，加入少量甲醇，减压浓缩蒸干，重复“加入少量甲醇，减压浓缩蒸干”步骤4-5次。再加入醋酐(乙酸酐)4mL，100℃反应1h，然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，得到乙酰化后的产物。将各乙酰化后的产物分别用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入等量的蒸馏水充分混匀，待静置后，除去上层水溶液，如此重复3-4次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥、过滤，用氯仿定容至10mL，即得乙酰化产物，待GC-MS分析。
GC-MS条件：采用DB-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升温(初始柱温为120℃，以10℃/min升温至240℃，保持6.5min)，接口温度250℃，离子源温度250℃，进样量2.0μL，以氦气做载气，流速1.0mL/min。
多糖水解物的乙酰化产物的GC-MS图谱如图3B，对应单糖标准品谱图(图3A)，实施例1中SSPS1多糖部分的单糖组成为由D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、3-O-甲基-D-半乳糖和D-葡萄糖组成，其中，D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、3-O-甲基-D-半乳糖和D-葡萄糖的摩尔比为6.2:3.9:3.1:2.1:1。说明SSPS1是一种新型的甘露半乳聚糖。
实施例2中SSPS1多糖部分的单糖组成为由D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、3-O-甲基-D-半乳糖和D-葡萄糖组成，其中，D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、3-O-甲基-D-半乳糖和D-葡萄糖的摩尔比为6.5:3.7:3.3:2.3:1.2。说明SSPS1是一种新型的甘露半乳聚糖。
实施例3中SSPS1多糖部分的单糖组成为由D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、3-O-甲基-D-半乳糖和D-葡萄糖组成，其中，D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、3-O-甲基-D-半乳糖和D-葡萄糖的摩尔比为6.0:4.1:2.9:1.9:0.9。说明SSPS1是一种新型的甘露半乳聚糖。
实施例7：甲基化分析
取2mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1样品溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中，通氮气密封，超声片刻助溶，然后按照Ciucanu,et al.方法进行甲基化制备(Ciucanu,L.,&Kerek,F..A simple and repid method forpermethylation ofcarbohydrates.Carbohydrate Research,131,209-217)。
SSPS1经过三次甲基化后，再经酸水解、还原，乙酰化制备成部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行GC-MS分析(见图4和表4)。由表4可知：该多糖含有4种残基，分别是端基L-岩藻糖(T-L-Fucp)(23.91mol％)，端基D-葡萄糖(T-D-Glcp)(4.35mol％)，(1→6)连接的D-半乳糖(45.65mol％)，(1,2→6)连接的D-甘露糖(26.09mol％)。上述结果表明SSPS1中包括D-Glcp-(1→，L-Fucp-(1→，→6)-D-Galp-(1→和→1)-D-Manp-(2,6→。
通过比较SSPS1的甲基化结果发现，多糖中(1→6)糖苷键连接的D-半乳糖含量最高，D-葡萄糖含量较少。
表4 SSPS1甲基化分析
Figure BDA0003578258340000151
Figure BDA0003578258340000161
实施例8：核磁共振
取60mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1溶于0.5mL氘水中，瑞士Bruker-AVIII500M进行600MHz NMR扫描。
根据SSPS1的1H-NMR(见图6A)、13C-NMR(见图6B)结合HSQC谱(见图6C)，检测到5个峰较为显著可用于分析。在1H-NMR谱中，于化学位移δ4.56-5.32ppm之间显示了SSPS1的主要的5个异头质子信号，按低场到高场分别为δ5.10,5.03,5.02,4.97和4.97ppm，分别命名为糖残基A、B、C、D、E；13C-NMR谱中也有5个异头碳信号(图6B)，δ102.57,δ104.04,δ99.55,δ99.73和δ99.73ppm分别逐一对应。为了进一步阐明其化学结构，糖残基A-E的1H-NMR、13C-NMR谱化学位移经进一步结合1H-1H COSY图谱(见图6D)、1H-1H TCOSY图谱(见图6E)、1H-13CHSQC图谱(见图6C)和1H-13C HMBC图谱(见图6F)等二维核磁共振谱得到归属，归属结果见表5。
各残基的化学位移见表5，分析推断所有残基的氢、碳化学位移，耦合常数与标准残基对照发现，A归属于T-Fuc糖残基(末端残基)，B归属于→2,6)-α-D-Manp-(1→残基，C归属于T-Glc糖残基(末端残基)，D归属于→6)-α-D-Galp-(1→残基，E归属于→6)-α-3-O-Me-D-Galp-(1→残基。一般来说可以通过“苷化位移”来判断多糖中单糖之间的连接位置，糖残基的各个碳都得到归属后，通过与已知单糖的碳的化学位移相对照，确定糖链的连接位置。
残基A的各个氢和碳的化学位移几乎与标准单糖的化学位移一致，属于末端残基，为α-L-Fucp-(1→。残基B的C-2位、C-6位与未发生取代的糖残基的化学位移向低场分别移动，所以残基B的连接位置在2,6位，为→2,6)-α-D-Manp-(1残基。残基C的各个氢和碳的化学位移几乎与标准单糖的化学位移一致，属于末端残基，为α-D-Glcp-(1→。残基D的C-6化学位移向低场移动，表明连接位置为6位，表明D为→6)-α-D-Galp-(1→残基。同理分析残基E为→6)-α-3-O-Me-D-Galp-(1→残基。以上分析结果和甲基化分析结果相一致。
表5 SSPS1糖残基的化学位移全归属
Figure BDA0003578258340000162
Figure BDA0003578258340000171
通过HMBC谱可以推断出多糖SSPS1糖残基之间的连接方式。在HMBC谱中，残基D的C-6(δ69.85ppm)与残基D的H-1(δ4.97ppm)存在交叉峰，表明残基D的H-1连接在残基D的C-6位。同理分析可以得出，残基E的H-1连接到残基E的C-6位，为(1→6)连接的3-O-甲基-α-D-半乳糖残基；残基B的H-1连接到残基B的C-6位，为(1→6)连接的α-D-甘露糖残基。残基E的H-1(δ4.97ppm)与残基D的C-6(δ69.85ppm)存在交叉峰，表明残基E连接在残基D的C-6位上。同理分析可以得出，残基D连接在残基B的C-6位上；残基B连接在残基E的C-6位上；残基A连接在残基B的C-2位上；残基C连接在残基B的C-2位上。上述残基间的连接方法也可由NOESY谱进一步证明。
上述结果与甲基化分析的结果相符。
实施例9：原子力显微镜测试
将质量百分浓度为5％-10％的实施例1、实施例2或者实施例3制得的桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1水溶液涂抹在云母片上测试，获得该多糖的原子力图，如图7中的二维原子力形貌图，从结果中可以看出样品呈现出为伸展的柔顺链，单糖链高度为0.420nm-0.900nm。
本发明建立了桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖提取纯化的方法，获得均一多糖，并初步研究其一级结构，对进一步进行生物活性及构效关系的探讨有重要的意义。
综合实施例4-实施例9的分析结果，证实了SSPS1由重量百分含量为99％以上的多糖组成；经单糖组成鉴定发现该多糖是由D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、3-O-甲基-D-半乳糖和D-葡萄糖组成，其中，D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、3-O-甲基-D-半乳糖和D-葡萄糖的摩尔比为6.2:3.9:3.1:2.1:1。说明SSPS1是一种新型的甘露半乳聚糖。激光光散射法证明它是单一组分且重均分子量为10KDa-60KDa。核磁共振图谱确定其糖苷键连接方式，多糖的结构单元中主链结构为(1→6)连接的3-O-甲基-α-D-半乳糖残基、(1→6)连接的α-D-半乳糖残基和(1→6)连接的α-D-甘露糖残基依次连接；其中(1→6)连接的3-O-甲基-α-D-半乳糖残基连接在(1→6)连接的α-D-半乳糖残基的C-6位上，(1→6)连接的α-D-半乳糖残基连接在(1→6)连接的α-D-甘露糖残基的C-6位上，(1→6)连接的α-D-甘露糖残基连接在(1→6)连接的3-O-甲基-α-D-半乳糖残基的C-6位上；在主链上连续的四个(1→6)连接的α-D-甘露糖残基的C-2位上分别被三个α-L-岩藻糖(α-L-Fucp)端基和一个α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)端基取代。具体结构单元可以是结构式Ⅰ所示的一种结构单元，也可以是三个α-L-岩藻糖端基和一个α-D-葡萄糖端基在主链上连续的四个(1→6)连接的α-D-甘露糖残基的C-2位上按其它排列顺序排列的结构单元。
实施例10：不同浓度的SSPS1对HepG2细胞增殖抑制的影响
参考Zhang的方法(Zhang,Y.,Zhou,T.,Wang,H.,Cui,Z.,Cheng,F.,&Wang,K.Structural characterization and in vitro antitumor activity of anacidicpolysaccharide from Angelica sinensis(Oliv.)Diels.CarbohydratePolymers,(2016)147,401-408.)采用MTT法检测桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1的体外抗肿瘤活性。在96孔板中放入人肝癌细胞(HepG2)和100μL RPMI-1640培养基置于37℃、5％(体积百分比)CO2的培养箱中培养24h。每孔分别添加SSPS1(100μL)，SSPS1最终浓度分别为50、100、200、400、600μg/mL；阴性对照组仅用RPMI-1640培养基处理。37℃孵育24h后，各孔中细胞加入20μLMTT(5mg/mL)混合，37℃孵育4h，抽吸上清，加入150μL二甲基亚砜，结果如图8所示，其中5-Fu为5-氟尿嘧啶，作为阳性对照，在加药培养24h后，桑黄多糖SSPS1对HepG2细胞具有明显的增殖抑制作用，当SSPS1浓度从50μg/mL增加至600μg/mL时，其生长抑制率从16.7％增加到58.9％，结果表明，桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1对HepG2细胞的增殖抑制作用呈浓度依赖性，IC50值被计算为376μg/mL。
实施例11：原子力显微镜下观察不同浓度的桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1对HepG2细胞形貌特征变化的影响
参照Zhu的方法(Zhu,H.,Jin,H.,Pi,J.,Bai,H.,Yang,F.,Wu,C.,Jiang,J.,&Cai,A.Apigenin Induced Apoptosis in Esophageal Carcinoma Cells by DestructionMembrane Structures.Scanning,(2016).38,322-328.)将HepG2细胞转入平板，用0-600μg/mL的SSPS1处理后，观察细胞凋亡形态学变化。培养24h后，将HepG2细胞滴于干净玻璃上10min，然后用2.5％(质量百分比)多聚甲醛水溶液固定细胞，用纯水冲洗3次。所有固定样品随后风干。制备的样品在空气中接触模式下，在25℃下进行AFM成像，结果如图10A-10L所示。如图10A所示，未经处理的细胞呈规则形状，中央隆起，表面光滑。而200-600μg/mLSSPS1水溶液处理细胞24h后，细胞形态发生明显变化，细胞高度降低，细胞膜明显萎缩，表面更加粗糙，如图10D、10G和10J所示。不同浓度(200-600μg/mL)的SSPS1水溶液处理后，HepG2细胞的平均高度由1050nm下降到86nm。同时，HepG2细胞的均方根粗糙度(Rq)从17.52nm增加到73.93nm，平均粗糙度(Ra)从14.1nm增加到53.92nm。这些结果表明，当肿瘤细胞被本发明活性多糖SSPS1药物作用后，细胞骨架发生较大变化。
实施例12：不同浓度的桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖SSPS1对HepG2细胞的凋亡作用
参照Li的方法(Li,H.,Yu,H.,&Zhu,H.Structure studies of theextracellular polysaccharide from Trichoderma sp.KK19L1 and its antitumoreffect via cell cycle arrest and apoptosis.Applied Biochemistry andBiotechnology,(2016).182,1-14.)采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒以及流式细胞仪检测细胞凋亡。在各种条件培养基处理HepG2细胞48h后，去除上清液，用PBS洗涤细胞3次，胰酶消化1min后，在900r/min的转速下，离心3min收集细胞。将含有异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V(Annexin V-FITC)(5μL)和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)(10μL)的细胞凋亡检测试剂盒溶液加入细胞后，悬浮于200μL的结合缓冲液(pH值6.5)中，并在4℃的黑暗孵育15min。最后在1h内用流式细胞仪检测细胞。结果如图9所示，不同浓度(200-600μg/mL)的SSPS1水溶液处理后，细胞早期凋亡率从1.49％增加到8.88％，和晚期从0.057％增加到18.7％，凋亡细胞百分比显著增加。这些结果与MTT分析结果一致，说明SSPS1对HepG2细胞生长的抑制作用与SSPS1诱导的细胞凋亡有关。
上述研究表明本发明桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖具有较强的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤添加剂、动物饲料、食品和/或保健品等抗肿瘤功能品，也可用于制备具有抗肿瘤功能的食品、保健品、动物饲料和/或药品等。
本发明中桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述多糖由D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、3-O-甲基-半乳糖和D-葡萄糖组成，其中，D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、3-O-甲基-D-半乳糖和D-葡萄糖的摩尔比为5.8-6.7:3.5-4.3:2.6-3.5:1.6-2.5:0.7-1.2。该组成的多糖具有较强的生物活性，例如抗氧化活性、增强免疫力活性和抗肿瘤活性。本发明制备方法中参数的变化并不影响桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖的制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖的制备。在此不再赘述。

Claims (2)

1.一种桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖，其特征在于，由重量百分含量99%以上的多糖组成；所述多糖由半乳糖、甘露糖、岩藻糖、3-O-甲基-半乳糖和葡萄糖组成，其中，半乳糖、甘露糖、岩藻糖、3-O-甲基-半乳糖和葡萄糖的摩尔比为5.8-6.7:3.5-4.3:2.6-3.5:1.6-2.5:0.7-1.2；
所述半乳糖为α-半乳糖，所述甘露糖为α-甘露糖，所述岩藻糖为α-岩藻糖，所述3-O-甲基-半乳糖为3-O-甲基-α-半乳糖，所述葡萄糖为α-葡萄糖；
所述α-半乳糖为α-D-半乳糖，所述α-甘露糖为α-D-甘露糖，所述α-岩藻糖为α-L-岩藻糖，所述3-O-甲基-α-半乳糖为3-O-甲基-α-D-半乳糖，所述α-葡萄糖为α-D-葡萄糖；
所述多糖的结构单元中主链结构为(1→6)连接的3-O-甲基-α-D-半乳糖残基、(1→6)连接的α-D-半乳糖残基和(1→6)连接的α-D-甘露糖残基；在主链上连续的四个(1→6)连接的α-D-甘露糖残基的C-2位上分别被三个α-L-岩藻糖端基和一个α-D-葡萄糖端基取代；
所述桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖的重均分子量为20.8KDa-23.6KDa。
2.根据权利要求1所述的桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖在制备具有抗氧化功能、增强免疫力功能和/或抗肿瘤功能的功能品中的应用，所述功能品包括添加剂、动物饲料、食品、保健品、药品中的一种或多种，所述抗肿瘤功能中肿瘤为肝癌、乳腺癌、结肠癌中的一种或多种。
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