CN105777924B - 一种桑黄子实体抗癌活性多糖pbpp及其制备方法 - Google Patents

一种桑黄子实体抗癌活性多糖pbpp及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桑黄子实体抗癌活性多糖PBPP及其制备方法。将桑黄子实体粉用超声波辅助热水提取出粗多糖，经乙醇沉淀后，用DEAE离子交换层析分离出酸性多糖组分，然后依次用丙烯葡聚糖凝胶S‑100、S‑200和S‑400层析纯化，收集洗脱峰对应的洗脱液，减压浓缩，冷冻真空干燥获得所述产物。本发明多糖PBPP及其方法，纯度均一，对正常细胞的生长无不良影响，对人宫颈癌细胞HELA和人胃癌细胞SGC‑7901的生长均有明显抑制作用，可用于抗癌产品的开发。

Description

一种桑黄子实体抗癌活性多糖PBPP及其制备方法
技术领域
本发明涉及了一种多糖的制备方法，尤其是涉及了一种桑黄子实体抗癌活性多糖PBPP及其制备方法。
背景技术
多糖(polysaccharide)是由10个以上单糖通过糖苷键连接聚合而成的高分子碳水化合物，分别作为结构成分、储藏养分、特殊的活性成分，在自然界广泛分布。天然活性多糖由于其独特的药理作用和较小的毒副作用，展现出广阔的研究和应用前景。
桑黄(Phellinus baumii)是一种具有多种药理作用的真菌子实体，因寄生于桑树而得名。中医认为桑黄能利五脏、软坚、排毒、止血等，现代医药学研究发现桑黄具有抗癌、抗炎症、抗氧化、降血糖、免疫调节、抗血管生成、护肝等多种药理作用，但其药用机理尚不清楚，这阻碍了其药用价值的进一步提高。分离纯化桑黄抗癌活性成分，对于推进桑黄药用新产品开发及其价值提升等，均具有积极意义。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种桑黄子实体抗癌活性多糖PBPP及其制备方法，采用回流提取、DEAE-Sepharose离子交换层析柱分离和Sephacryl S-100、S-200、S-400层析柱纯化制备获得桑黄子实体抗癌活性多糖PBPP。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1)选取生长于桑树上的桑黄子实体，自然晾干后，切片，于45℃烘箱中烘干至恒重，高速粉碎机粉碎后过80-100目筛，得到桑黄子实体粉；
2)采用超声波辅助热水法从桑黄子实体粉末中提取出粗多糖。
3)将粗多糖用乙醇进行沉淀。
4)通过DEAE-Sepharose离子交换层析柱洗脱分离，得到酸性多糖组分。
5)依次通过Sephacryl S-100层析柱、Sephacryl S-200层析柱和Sephacryl S-400层析柱纯化洗脱后，收集洗脱峰的洗脱液，得到多糖组分取名为PBPP。
所述步骤2)采用超声波辅助热水法从桑黄子实体粉末中提取出粗多糖的具体方法为：
2.1)将烘干的桑黄子实体粉末按料液质量体积比为0.04g/mL加入双蒸水，超声波处理35min后，于100℃下提取4.35h后抽滤，获得残渣和滤液。
2.2)残渣再重复上述步骤2.1)一次，再次获得残渣和滤液。
2.3)合并步骤2.1)和步骤2.2)得到的滤液，在45℃下减压浓缩至原体积的1/4，得到从桑黄子实体中提取出粗多糖液。
所述步骤3)用乙醇进行沉淀的具体方法为：往粗多糖液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇质量浓度达到80％，置4℃冰箱过夜，10000rpm离心10min，获得乙醇沉淀后的多糖。
所述步骤4)通过DEAE-Sepharose离子交换层析柱洗脱分离的具体方法为：将乙醇沉淀后的多糖用双蒸水溶解配制成10mg/mL溶液，10000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上DEAE-Sepharose离子交换层析柱，用0.1M NaCl溶液以2.5-3.5mL/min流速洗脱，洗脱时采用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩，-80℃下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分。
所述步骤5)通过Sephacryl S-100层析柱纯化的具体方法为：将酸性多糖组分用双蒸水溶解配制成5mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，上Sephacryl S-100层析柱，用双蒸水以0.5-0.7mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩成浓度为5mg/mL的多糖溶液。
所述步骤5)通过Sephacryl S-200层析柱纯化的具体方法为：将所述通过Sephacryl S-100层析柱纯化后的多糖溶液，上Sephacryl S-200层析柱，用双蒸水以0.3-0.5mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩成浓度为5mg/mL的多糖溶液。
所述步骤5)通过Sephacryl S-400层析柱分离纯化的具体方法为：将所述通过Sephacryl S-200层析柱纯化后的多糖溶液，上Sephacryl S-400层析柱，用双蒸水以0.3-0.5mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩，-80℃下真空冷冻干燥，得到高纯度的多糖组分，取名为PBPP。
所述的减压均通过减压泵进行减压。
进一步地，本发明各个实施例实验制备获得的多糖组分PBPP采用高效液相色谱系统和折光检测器检测，检测结果纯度高。
本发明具有的有益效果是：
本发明制备的桑黄子实体抗癌活性多糖PBPP，纯度高，对人宫颈癌细胞HELA和人胃癌细胞SGC-7901的增殖均表现出显著的抑制作用，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖均无抑制作用，可用于抗癌产品的开发，这对于提升桑黄子实体的应用价值很有帮助。
附图说明
表1是PBPP对癌细胞增殖的影响。
表2是PBPP对正常细胞增殖的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明的以下各个实施例均采用以下方式先获得桑黄子实体粉末：
选取生长于桑树上的多年桑黄子实体，自然晾干后，切片，于45℃烘箱中烘干至恒重，高速粉碎机粉碎后过80-100目筛，得到桑黄子实体粉末。
实施例1：
取过80目筛的按上述方法获得的桑黄子实体粉末，按料液质量体积比为0.04g/mL加入双蒸水，超声波处理35min后，于100℃下提取4.35h后抽滤，重复1次，合并两次抽滤得到的滤液，在45℃下减压浓缩至原体积的1/4，提取出粗多糖；
往粗多糖液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到80％，置4℃冰箱过夜，10000rpm离心10min，得到沉淀多糖。
将沉淀多糖用双蒸水溶解配制成10mg/mL溶液，10000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上DEAE-Sepharose离子交换层析柱，用0.1M NaCl溶液以3.0mL/min流速洗脱，洗脱时采用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩，-80℃下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分。
将酸性多糖组分用双蒸水溶解配制成5mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，上SephacrylS-100层析柱，用双蒸水以0.5mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩成浓度为5mg/mL的多糖溶液。
将通过Sephacryl S-100层析柱纯化后得到的多糖溶液，上Sephacryl S-200层析柱，用双蒸水以0.4mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩成浓度为5mg/mL的多糖溶液。
将通过Sephacryl S-200层析柱纯化后得到的多糖溶液，上Sephacryl S-400 层析柱，用双蒸水以0.3mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩，-80℃下真空冷冻干燥，得到均一的多糖组分PBPP。
经检测，PBPP在浓度为0.4mg/mL时，对人宫颈癌细胞HELA和人胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制率分别为83.30％和95.18％。对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7的生长均无不良影响。
实施例2：
取过90目筛的按上述方法获得的桑黄子实体粉末，按料液质量体积比为0.04g/mL加入双蒸水，超声波处理35min后，于100℃下提取4.35h后抽滤，重复1次，合并两次抽滤得到的滤液，在45℃下减压浓缩至原体积的1/4，提取出粗多糖；
往粗多糖液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到80％，置4℃冰箱过夜，10000rpm离心10min，得到沉淀多糖。
将沉淀多糖用双蒸水溶解配制成10mg/mL溶液，10000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上DEAE-Sepharose离子交换层析柱，用0.1M NaCl溶液以2.5mL/min流速洗脱，洗脱时采用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩，-80℃下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分。
将酸性多糖组分用双蒸水溶解配制成5mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，上SephacrylS-100层析柱，用双蒸水以0.7mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩成浓度为5mg/mL的多糖溶液。
将通过Sephacryl S-100层析柱纯化后得到的多糖溶液，上Sephacryl S-200层析柱，用双蒸水以0.3mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩成浓度为5mg/mL的多糖溶液。
将通过Sephacryl S-200层析柱纯化后得到的多糖溶液，上Sephacryl S-400层析柱，用双蒸水以0.4mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩，-80℃下真空冷冻干燥，得到均一的多糖组分PBPP。
经检测，PBPP在浓度为0.4mg/mL时，对人宫颈癌细胞HELA和人胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制率分别为82.98％和96.08％。对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7的生长均无不良影响。
实施例3：
取过100目筛的按上述方法获得的桑黄子实体粉末，按料液质量体积比为0.04g/mL加入双蒸水，超声波处理35min后，于100℃下提取4.35h后抽滤，重复1次，合并两次抽滤得到的滤液，在45℃下减压浓缩至原体积的1/4，提取出粗多糖；
往粗多糖液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到80％，置4℃冰箱过夜，10000rpm离心10min，得到沉淀多糖。
将沉淀多糖用双蒸水溶解配制成10mg/mL溶液，10000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上DEAE-Sepharose离子交换层析柱，用0.1M NaCl溶液以3.5mL/min流速洗脱，洗脱时采用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩，-80℃下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分。
将酸性多糖组分用双蒸水溶解配制成5mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，上SephacrylS-100层析柱，用双蒸水以0.6mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩成浓度为5mg/mL的多糖溶液。
将通过Sephacryl S-100层析柱纯化后得到的多糖溶液，上Sephacryl S-200层析柱，用双蒸水以0.5mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩成浓度为5mg/mL的多糖溶液。
将通过Sephacryl S-200层析柱纯化后得到的多糖溶液，上Sephacryl S-400层析柱，用双蒸水以0.5mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩，-80℃下真空冷冻干燥，得到均一的多糖组分PBPP。
经检测，PBPP在浓度为0.4mg/mL时，对人宫颈癌细胞HELA和人胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制率分别为83.95％和95.79％。对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7的生长均无不良影响。
本发明各个实施例制备获得的多糖组分PBPP的上述检测均采用配有TOSOHBIOSEP G4000SWXL糖类分析柱的Waters525型高效液相色谱系统，以Waters 2410示差折光检测器检测，呈现单一对称峰；采用UV2450紫外分光光度仪于200-400nm波长范围内进行扫描，不含有蛋白质和核酸等杂质。
此外进一步地，通过CCK-8法检测PBPP对人宫颈癌细胞HELA和人胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制作用(如表1所示)，在不同浓度为0.1-0.4mg/mL时，相对于对照组的增殖抑制率分别为58.46-83.74％和65.88-95.56％。
表1
浓度(mg/mL) HELA增殖抑制率/％ SGC-7901增殖抑制率/％
0(对照组) 0 0
0.1 58.46 65.88
0.2 69.30 93.88
0.4 83.74 95.56
PBPP对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖均无抑制作用(如表2所示)，在浓度为0.1-0.4mg/mL时，相对于对照组的增殖活力分别为100.29-118.04和142.82-169.66。
表2
浓度(mg/mL) HEK293增殖活力 RAW264.7增殖活力
0(对照组) 100 100
0.1 118.04 147.57
0.2 110.22 169.66
0.4 100.29 142.82
由此可见，本发明制备的多糖PBPP具有抗癌活性，制备纯度高，对于提升桑黄子实体具有很大的应用价值。

Claims (2)

1.一种桑黄子实体抗癌活性多糖PBPP的制备方法，其特征在于：
1)选取生长于桑树上的桑黄子实体，自然晾干后，切片，于45℃烘箱中烘干至恒重，粉碎机粉碎后过80-100目筛，得到桑黄子实体粉末；
2)采用超声波辅助热水法从桑黄子实体粉末中提取出粗多糖；
3)将粗多糖用乙醇进行沉淀；
4)通过DEAE-Sepharose离子交换层析柱洗脱分离，得到酸性多糖组分；
5)依次通过Sephacryl S-100层析柱、Sephacryl S-200层析柱和Sephacryl S-400层析柱纯化洗脱后，收集洗脱峰的洗脱液，得到多糖组分取名为PBPP；
所述步骤2)采用超声波辅助热水法从桑黄子实体粉末中提取出粗多糖的具体方法为：
2.1)将烘干的桑黄子实体粉末按料液质量体积比为0.04g/mL加入双蒸水，超声波处理35min后，于100℃下提取4.35h后抽滤，获得残渣和滤液；
2.2)残渣再重复上述步骤2.1)一次，再次获得残渣和滤液；
2.3)合并步骤2.1)和步骤2.2)得到的滤液，在45℃下减压浓缩至原体积的1/4，得到粗多糖液；
所述步骤3)用乙醇进行沉淀的具体方法为：往粗多糖液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇质量浓度达到80％，置4℃冰箱过夜，10000rpm离心10min，获得乙醇沉淀后的多糖；
所述步骤4)通过DEAE-Sepharose离子交换层析柱洗脱分离的具体方法为：将乙醇沉淀后的多糖用双蒸水溶解配制成10mg/mL溶液，10000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上DEAE-Sepharose离子交换层析柱，用0.1M的NaCl溶液以2.5-3.5mL/min流速洗脱，洗脱时采用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩，-80℃下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分；
所述步骤5)通过Sephacryl S-100层析柱纯化的具体方法为：将酸性多糖组分用双蒸水溶解配制成5mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，上Sephacryl S-100层析柱，用双蒸水以0.5-0.7mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩成浓度为5mg/mL的多糖溶液；
所述步骤5)通过Sephacryl S-200层析柱纯化的具体方法为：将所述通过SephacrylS-100层析柱纯化后的多糖溶液，上Sephacryl S-200层析柱，用双蒸水以0.3-0.5mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩成浓度为5mg/mL的多糖溶液；
所述步骤5)通过Sephacryl S-400层析柱分离纯化的具体方法为：将所述通过Sephacryl S-200层析柱纯化后的多糖溶液，上Sephacryl S-400层析柱，用双蒸水以0.3-0.5mL/min流速洗脱，洗脱时用自动部分收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱峰的洗脱液，于45℃下减压浓缩，-80℃下真空冷冻干燥，得到高纯度的多糖组分，取名为PBPP。
2.一种桑黄子实体抗癌活性多糖PBPP，其特征在于：为采用权利要求1所述方法制备获得的多糖PBPP。
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