CN101711774A - 松木层孔菌多糖提取物在制备防治肿瘤转移药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从松木层孔菌Phellinus pini子实体制得的松木层孔菌多糖提取物在制备治疗抑制肿瘤转移药物方面的应用。本发明制得的松木层孔菌多糖提取物，具有明显的激活多形核白细胞，提高其杀伤肿瘤细胞的能力从而发挥抑制肿瘤转移及术后复发的作用。药理实验证实：松木层孔菌多糖提取物疗效显著，安全有效且未出现任何毒副反应。同时本发明的中药组合物可以被制备成任何一种抗肿瘤作用的制剂。

Description

松木层孔菌多糖提取物在制备防治肿瘤转移药物中的应用

技术领域

本发明属于中药提取技术领域，特别是涉及具有抑制肿瘤转移及复发的松木层孔菌多糖提取物及其制备方法与应用。

背景技术

真菌类多糖作为一类非特异性免疫功能增强剂，在临床上已广泛用于自身免疫性疾病及恶性肿瘤的预防和治疗，如香菇多糖、灵芝多糖、云芝多糖、巴西蘑菇多糖等抗肿瘤作用已得到临床上广泛验证。桑黄(多孔菌科，木层孔菌属Phellinus中真菌)作为中药材在我国最早记载于《本草纲目》，其子实体入药，味微苦，能利五脏、软坚、排毒；止血、活血；多用于和胃止泻、淋病、崩漏带下、脾虚泄泻等症。上世纪70年代日本人证明桑黄有较好的抗肿瘤效果，后来又证实其抗肿瘤活性优于云芝多糖等多种真菌类药物，因此在日韩两国得到广泛重视。在我国，桑黄被研究和使用较少，但桑黄所属的木层孔菌属(Phellinus)的植物种类较多，资源分布较广，具有广阔的研究和应用前景。现将国内外对多孔菌科木层孔菌属(Phellinus)中相关种类的形态分类、资源鉴定、化学成分及真菌多糖抗肿瘤等研究综述如下：

1.形态及生物学特征

桑黄是一类具有重要药用价值的大型真菌，为多孔菌科，木层孔菌属类真菌。子实体通常生长于桑属植物上，并为黄褐色而得名。桑黄，又被称为桑臣、桑耳、胡孙眼、桑黄菇。但由于桑黄所属的木层孔菌属(phellinus)中的许多种外形较相似，因此，研究应用的种类有多种。目前国内对桑黄的研究大多集中在火木层孔菌Phellinusigniarius，少数在鲍氏层孔菌Phellinus baumii；日本、韩国对裂蹄木层孔菌Phellinuslinteus进行了大量研究。木层孔菌属据记载全世界有251种左右，中国发现有62种。除上述3种外，尚有对该属真菌松木层孔菌Phellinus pini的少数的研究报道。现将上述种类特征简述如下：

1.1火木层孔菌Phellinus igniarius，也称为针层孔菌子实体为多年生，中等至较大，马蹄形至扁半球型，木质。菌盖直径3～12cm，初期有微细绒毛，浅褐色，以后光滑，变暗灰黑或黑色，老时龟裂，无皮壳，有同心环棱，边缘钝圆，浅咖啡色，下侧无子实层。菌肉深咖啡色，硬木质，管孔多层，与菌肉同色，老的管孔中充满白色菌丝，菌孔面绣褐色，圆形每毫米4～5个。刚毛基部膨大，顶端渐尖。孢子无色，光滑，近球形，(4.5～6)μm×(4～5)μm。寄生在柳，桦，杨，花揪，山楂等阔叶树的树桩，树干或倒木上。集中分布在黑龙江省东部乌苏里江与兴凯湖之间，西北地区陕西与甘肃交界的“子午岭”自然保护区，东北的长白山林区、哈尔滨与吉林市之间的老爷岭、张广才岭少有出产。另外，西南各省区亦出产少量的桑树桑黄。一般着生在树龄大的(10年以上)、具有粗皮的桑树树干基部豁口处，环境荫蔽、潮湿。目前，已开始人工栽培。

1.2鲍氏层孔菌Phellinus baumii子实体为多年生，无柄，单生，新鲜时硬木栓质，干燥后变为木质，可达到长10cm，宽7cm，厚5cm。菌盖通常为蹄形或半圆形，上表面初期有微细绒毛，后期光滑并有不规则龟裂，初期为黄褐色，后变为黑褐色至栗褐色，有同心环沟。菌肉褐色，硬木栓质。子实层中通常有大量的锥形刚毛存在，黑褐色，厚壁。孢子广椭圆形(3.3～4.5)μm×(2.4～3.5)μm，黄色，厚壁，光滑。天然寄主主要为丁香属植物，偶尔也生长在白腊树属、李属等植物上。在我国中南地区及韩国主要生于桑属植物上，在日本寄主为丁香属、桑属。

1.3裂蹄木层孔菌Phellinus linteus子实体为多年生，中等至较大。菌盖直径2～17cm，厚1.5～7cm，半圆形或马蹄形，深褐色至黑色，有同心纹和环棱，初期有细绒毛，后变光滑和龟裂，硬而木质化，下侧无子实层。菌肉淡黄色或浅咖啡色。菌管同菌肉色相似，多层，但层次不明显，老年的菌管层充满白色菌丝体，每层厚2～5mm，管口同色，圆形，每毫米6～8个。孢子黄褐色，光滑，近球形。寄生于杨、栎、漆、丁香、女贞、忍冬、桦槭等树木的枯木及立木和树干上。分布广泛。

1.4松木层孔菌Phellinus pini子实体形态较大，马蹄形，贝壳形，吊钟形，有的扁平，木质。菌盖直径3～20cm，半圆形，表面深褐色，有明显同心环棱，稍开裂、边缘锐，有金黄色绒毛，其下侧无子实层。菌肉咖啡色，菌管同色，多层。菌管口多角形至迷路状，管壁厚，每毫米1～3个；圆形，每毫米3～5个。子实层中有褐色刚毛。孢子淡褐色，光滑，近球形或椭圆形。生于云杉、落叶松、松等针叶树活立木上。分布广泛。

2.主要化学成分研究

2.1多糖类物质

2.1.1So等火木层孔菌Phellinus igniarius液体发酵的菌丝中提取得到一种具有抗肿瘤活性的糖蛋白。Kim等则从液体发酵液中提取得到胞内和胞外蛋白聚糖，经过分离纯化后得到相对分子质量大约在134000～560000的4种物质PIEPDG，PIEPAG，PIIPDG，PIIPAG。其中PIEPDG包含79.0％的总糖和7.2％的蛋白质，总糖部分仅由葡萄糖组成；PIEPAG包含56.7％的总糖和40.8％的蛋白质，总糖部分由葡萄糖、果糖、肌醇构成；PIIPDG包含64.8％的总糖和17.4％的蛋白质，总糖部分由葡萄糖和肌醇构成；PIIPAG包含56.9％的总糖和41.5％的蛋白质，总糖部分由葡萄糖和肌醇构成。日本学者Kim等在研究多种担子菌抗癌多糖时发现，云芝和灵芝的多糖主要是β-1-3和1，6-D-葡萄糖，而鲍氏层孔菌Phellinus baumii多糖除葡萄糖外，还有半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和墨角藻糖等，因此鲍氏层孔菌的抗癌多糖要比其他多糖担子菌的抗癌多糖复杂。不同的学者还从鲍氏层孔菌中发现了多种不同的抗癌多糖，其中为β-1-3-葡聚糖在C-6有葡萄糖分支的抗癌效果最好。Lee等研究发现鲍氏层孔菌中具有免疫调解功能的糖肽的联结型，丝氨酸和苏氨酸存在于联结部。王稳航首次从松木层孔菌Phellinus pini子实体中分离制备3种多糖，并对其抗氧化性进行了研究。结果表明：水提多糖(PSI)、碱提多糖(PSII)、磺化多糖(PSIII)均为β构型，单糖组成以葡萄糖为主(87.43％～90.17％)，其次为甘露糖、半乳糖、木糖、核糖。3种多糖分子量分别为230kDa、29kDa、27kDa，均与少量蛋白结合，形成多糖肽，蛋白质含量分别为18.69％、6.72％、2.56％。

2.1.2多糖分离纯化

有报道，通过对鲍氏层孔菌Phellinus baumii中多糖分离纯化，对桑黄多糖依次采用乙醇分级醇沉、超滤、离子交换层析和凝胶过滤等分离纯化方法得到一个均一组分PBF1-A。分级醇沉将桑黄多糖初步分为两个部分PBF1和PBF2，得率分别为43％和49％；然后对PBF1进行超滤，多糖纯度达到76％，回收率为86％；将超滤后的滞留液采用离子交换层析，然后脱盐、浓缩，再经凝胶过滤得到均一组分PBF1-A。桑黄多糖均一组分PBF1-A极易溶于水，是一种蛋白糖，其多糖含量为96.6(±0.5)％，蛋白质含量为3.04(±0.05)％，比旋度为-4.6°，分子量大于2000KDa；用三氟乙酸对PBF1-A进行完全酸水解，可知PBF1-A的单糖残基由葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖和岩藻糖组成，摩尔比分别占75.09％、9.11％、7.32％、4.39％和4.10％；红外光谱和核磁共振谱表明PBF1-A主要含有β-吡喃葡聚糖，此外含有甘露糖，与酸水解结果一致。

刘安军等采用超声波+复合酶法预处理对Phellinus linteus子实体水溶多糖进行提取，并对提取多糖成分差异进行初步分析。采用超声波技术预处理的子实体，利用正交实验研究了料液比、时间、功率各因素对多糖得率的影响；在超声波优化结果基础上，进行纤维素酶+木瓜蛋白酶法处理，研究了纤维素酶用量、处理时间、木瓜蛋白酶用量、处理时间各因素对多糖得率的影响。研究表明采用超声波+复合酶法预处理方法提取多糖，与传统的热水提取法相比，极大提高了提取效率，为Phellinus linteus多糖的产业化打下了基础。杨全等采用正交试验法，对影响桑黄菌丝体多糖的提取工艺因素进行了研究。以煎煮液中水溶性多糖的含量为对照，用苯酚-硫酸法对煎煮液中的桑黄多糖进行含量测定。结果桑黄菌丝体多糖的最佳提取工艺为：用50倍量水，温度为90℃，煎煮2h/次，共2次。用此工艺提取水溶性多糖简单、易行，方法重现性好，适合于工业化生产来提取多糖。

Kim等对产自韩国的桑黄子实体用热水提取、过滤、乙醇沉淀、透析和冷冻干燥等方法提取出水溶性聚糖，并通过二乙氨基乙基纤维素阴离子交换色谱收集酸性成分，进一步通过超滤，透析，凝胶柱色谱纯化，得到相对分子质量为150×10³的酸性蛋白多糖，其中糖占72.2％，蛋白占22.3％。Song等对桑黄菌丝体培养通过热水提取得到粗产物，并进一步通过乙醇沉淀、二乙氨基乙基纤维素阴离子交换色谱柱和凝胶渗透色谱柱层析的提纯，用凝胶渗透高效液相色谱法分析，得到相对分子质量为153×10³的蛋白多糖，其中蛋白占13.2％，糖占82.5％。Tomoyuki等对桑黄菌丝体先后采用乙醇提取，热水提取，4％NaOH溶液提取，24％NaOH溶液提取，将得到的5种产物比较，发现24％NaOH溶液提取物经醇沉后产品为相对分子质量(1000～2000)×10³的蛋白多糖，其抑瘤率达到81.2％。

Kim等将桑黄子实体中提取多糖的组成进行分析，相对分子质量为150×10³的蛋白多糖，通过HPLC法测定其单糖组成包括甘露糖、半乳糖、葡萄糖等，推测己糖构成主链，戊糖构成侧链；通过氨基酸分析仪测得蛋白部分含丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸等17种氨基酸，红外及核磁共振谱都显示其为一种包含α键和β键的含有(1，6)分支的(1，3)聚糖。Kim等从桑黄子实体中提取到相对分子质量为73×10³的蛋白多糖，确定含葡萄糖和甘露糖为主的5种单糖，氨基酸主要为天冬氨酸。

Song等将桑黄菌丝体中提取的相对分子质量为153×10³的蛋白多糖，经过完全酸水解、乙酰化反应，进而通过气相色谱得出其所含单糖包括甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖。HPLC法分析其蛋白部分含谷氨酸和天冬氨酸为主的10种氨基酸，并发现三氟乙酸部分酸降解导致的相对分子质量减小和高碘酸钠氧化反应导致的分子结构变化都能显著地降低其活性，结果表明，此化合物保持完整结构对活性是至关重要的。Tomoyuki等通过GLC-MS分析桑黄菌丝体提取的多糖，确定所含单糖包括葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、半乳糖，其中葡萄糖占绝大部分，氨基酸分析仪测定氨基酸组成为亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸；核磁共振谱证实其含α-1，3葡聚糖链。Hwang等通过气相色谱分析桑黄菌丝体提取到的多糖，得到包括甘露糖、半乳糖、葡萄糖为主的7种单糖；Lee等从桑黄菌丝体中分离出多个糖组分，相对分子质量分布在(9～15)×10³，包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖等5种单糖，也检测出糖醛酸与氨基酸；后又发现桑黄中具有免疫调节功能的糖肽中含O-型连接，丝氨酸和苏氨酸存在于连结部位。

2.2吡喃酮及苯并吡喃酮类成分

莫顺燕等从火木层孔菌Phellinus igniarius子实体中分离得到桑黄素A、桑黄素B、桑黄素C、桑黄素D、桑黄素E、桑黄素F。

2.3黄酮类成分

莫顺燕等从火木层孔菌Phellinus igniarius子实体中首次分离得到柚皮素，樱花亭，二氢莰非素，7-甲氧基二氢莰非素，北美圣草素以及桑黄黄酮A和桑黄黄酮B。

2.4酚及有机酸类化合物

火木层孔菌Phellinus igniarius中含有落叶松蕈酸、脂肪酸(主要为C₂₂、C₂₄的饱和脂肪酸)、草酸、三萜酸等有机酸。此后，莫顺燕等又从其子实体分离得到hispolon、原儿茶醛、丁香酸、原儿茶酸和咖啡酸。

2.5甾体类成分

刘金荣等火木层孔菌Phellinus igniarius子实体中分离得到麦角甾醇；之后，莫顺燕等也从其子实体中分离得到另一种甾类成分异麦角甾酮。

2.6香豆素类成分

莫顺燕等从火木层孔菌Phellinus igniarius子实体中首次分离得到香豆素(苯并吡喃-2-酮)及莨菪亭(7-羟基-6-甲氧基苯并吡喃-2-酮)。

2.7色素类成分

Kirk等则从火木层孔菌Phellinus igniarius成熟的子实体中分离得到一种酚类色素；Malama等、Kurchenko等都从火木层孔菌Phellinus igniarius中分离得到黑色素。

2.8其他成分

据报道火木层孔菌Phellinus igniarius还含有阿魏酸二十八醇酯、C₂₃、C₂₅的饱和烃、氨基酸(主要为甘氨酸、天门冬氨酸)以及木糖氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、酯酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、乳糖酶、纤维素酶等多种酶。

3.药理作用研究

3.1多糖的抗肿瘤作用研究

3.1.1多糖的抗癌活性

桑黄的抗癌功能最早被日本学者Ikekawa等发现，桑黄野生子实体的提取物对小鼠肉瘤S₁₈₀的抑制率为96.7％。研究还表明具有抗癌作用的物质是桑黄子实体中的多糖。温克等比较了口服桑黄(phellinus linteus)等4种药用真菌对S₁₈₀肉瘤和胃癌的抑制作用。桑黄在剂量为0.5g/kg体重时，对小鼠S₁₈₀肉瘤和胃癌的抑制率分别为46.07％和43.09％。刘海燕等研究桑黄粗多糖的抗肿瘤作用及对荷瘤小鼠免疫功能的影响，发现桑黄粗多糖高、中、低剂量组对小鼠S₁₈₀肉瘤均有抑制作用，能明显提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬指数与吞噬率、外周血淋巴细胞转化率及血清溶血素水平，并能提高血清中细胞因子TNF-α含量。张敏等观察桑黄多糖对荷瘤小鼠的抑瘤效应并探讨其作用机理，建立小鼠肝癌(H-2)、肉瘤(S₁₈₀)和肺癌(Lewis)模型，测定桑黄多糖对小鼠肿瘤的抑制作用，结果表明桑黄对H-2、S₁₈₀和Lewis肺癌均表现出较好的抑瘤作用，激活巨噬细胞、增强其吞噬功能、诱导巨噬细胞产生和分泌肿瘤坏死因子是桑黄抗肿瘤作用的重要机制之一。王清等采用体外抑瘤实验研究，人工栽培的桑黄子实体水提物(PSW)对肝癌细胞(HepG-2)、乳腺癌细胞(MCF-7)生长的抑制作用，PSW对HepG-2、MCF-7有很好的抑制作用，对环磷酰胺诱发的微核率和精子畸形率有着显著的抑制作用(P＜0.01)，并能明显增强小鼠血清和肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低丙二醛(MDA)含量。杨全等研究桑黄菌丝体多糖对小鼠S₁₈₀实体瘤、腹水瘤的生长抑制作用和对荷瘤小鼠免疫调节作用。饲喂桑黄菌丝体多糖的荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数显著增加；3个剂量的桑黄菌丝体多糖对S180实体瘤的抑瘤率分别为31.88％，46.25％，53.13％；并且可以显著延长腹水型荷瘤小鼠的存活时间。从而得出桑黄菌丝体多糖具有较强的抗肿瘤作用和免疫调节活性。对鲍氏层孔菌Phellinus baumii的抗癌功能最早被日本学者Tetsuro Ikekaw等发现，研究表明鲍氏层孔菌野生子实体的提取物对小鼠肉瘤S₁₈₀的抑制率为96.7％。研究还表明具有抗癌作用的物质是鲍氏层孔菌子实体中的多糖。Naruse等和Chung等用鲍氏层孔菌人工培养菌丝的提取物做抗癌试验，并证实菌丝提取物对小鼠肉瘤S₁₈₀同样具有明显的抑制作用。Kong等还发现鲍氏层孔菌的多糖对肿瘤的生长和转移均有抑制作用。

3.1.2多糖抗肿瘤作用的机制研究

Cho等研究了桑黄提取物对过氧化氢诱导的WB-F344鼠肝上皮细胞凋变的抑制作用。他们将此细胞与提取物(5μg/ml与25μg/ml)孵育24h，然后再与提取物和H₂O₂(500μmol/L)共孵育1h，该提取物抑制了H₂O₂引起的缝隙连接介导的细胞间通讯中断(GJ IC)并阻断了H₂O₂引起的缝隙连接蛋白的高磷酸化作用。另外，H₂O₂激活了细胞中p38激酶、细胞外信号控制蛋白激酶(ERK)1/2和c-Jun氮终止激酶。而桑黄提取物可以使ERK1/2和p38MAP灭活，证明桑黄提取物可以通过灭活ERK1/2和p38MAP防止阻断GJ IC来发挥抗肿瘤作用。Song等用两种不同的体外生物测定方法证明了桑黄提取物有抗氧化作用，即对稳定自由基和羟基的清除作用，并和维生素C作了比较。抗血管生成作用是一种重要的治疗肿瘤方法，研究者也用鸡胚绒毛尿囊膜测定法检测桑黄提取物并证明其有强烈的抗血管生成作用。此外，研究者还证实了桑黄提取物对黄嘌呤氧化酶的强烈抑制作用，以上实验证实了桑黄提取物可能的抗肿瘤作用。经实验发现，桑黄提取物中所含成分包括多糖、小分子糖、蛋白、黄酮等，为确定其中活性成分，研究者通过一系列分离纯化工艺，进一步研究多糖的作用机制。增殖及表达。后来他们又发现桑黄蛋白多糖通过对小鼠脊髓树突状细胞(DC)的作用增加IL-12的产量，以及IL-2的分泌和同种T细胞的增殖。另外，在给予蛋白多糖前使用抗TLR2或抗TLR4的抗体可以显著降低其对DC的活性，证明两者可能都是桑黄蛋白多糖的受体。桑黄蛋白多糖对DC的促成熟作用可以直接激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，如ERK1/2，p38，及转录因子NK-κB p65。同样，预先使用NK-κB p65，ERK1/2，p38的信号通道抑制剂可以抑制桑黄蛋白多糖对DC上表面分子的增量调节。由此可以认为，桑黄蛋白多糖可以通过TLR2和(或)TLR4介导的NK-κB，ERK和p38MAPKs信号通道来诱导DC表型和功能型的成熟。肿瘤的产生与体内多种信号的调节有关。Shon等分别用直接致突变物4-硝基-o-苯二胺NPD、叠氮化钠和间接致突变物2-氨基芴及苯并芘证明桑黄多糖通过激活还原性辅酶II和谷胱甘肽S-转移酶的活性并通过提高谷胱甘肽的水平来发挥抗突变及抗肿瘤作用。Li等通过细胞计数分析桑黄蛋白多糖对SW480人结肠癌细胞增殖和集落形成的抑制作用结果，发现桑黄蛋白多糖增加了G₁和G₂期的细胞凋亡；蛋白质印迹表明蛋白多糖引起的细胞凋亡与Bc1-2的减少，细胞色素C的释放增加以及细胞周期蛋白B1的表达减少有关。该结果表明桑黄蛋白多糖通过对特定肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻断作用起到抗肿瘤效果。Kim等后又经研究证实，桑黄蛋白多糖与脂多糖在对B细胞的作用形式上相似，但蛋白多糖不受多黏菌素的抑制，这点不同于脂多糖；该蛋白多糖增加了巨噬细胞中的细胞因子产生和NO的释放，加速了NO敏感B16黑素瘤细胞的凋亡。Han等同样证实桑黄提取到的酸性蛋白多糖通过两种机制抑制肿瘤转移，一是作为免疫增强剂，二是作为肿瘤细胞附着的直接抑制剂。刘海燕等，研究桑黄粗多糖的抗肿瘤作用及对荷瘤小鼠免疫功能的影响。通过体外培养肉瘤细胞，接种健康小鼠，建立荷瘤小鼠模型方法。将小鼠随机分组，①蒸馏水组②桑黄粗多糖高、中、低剂量组。观察计算抑瘤率、腹腔巨噬细胞吞噬指数及吞噬率、外周血淋巴细胞转化率、血清溶血素水平、以及血清中细胞因子TNF-a、IL-4含量。结果显示桑黄粗多糖高、中、低剂量组对小鼠肉瘤均有抑制作用，能明显提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬指数与吞噬率、外周血淋巴细胞转化率及血清溶血素水平，并能提高血清中细胞因子一含量，对血清中细胞因子含量的影响作用不显著。得出结论：桑黄粗多糖具有抗肿瘤以及增强荷瘤小鼠免疫功能的作用。还有研究认为，桑黄多糖可以增强免疫力、刺激淋巴B细胞生长、抑制血小板聚合降低尿激酶型血纤维蛋白溶酶原催化剂的活力等机理来抑制肿瘤细胞生长和防止癌细胞转移。

3.2提高机体免疫能力

张万国研究火木层孔菌Phellinus igniarius对人外周血单核细胞(PMNCs)产生γ-干扰素(IFN-γ)的影响。试验表明，桑黄对PMNCs分泌IFN-γ有直接诱导作用，而IFN-γ具有明显的抗肿瘤活性，能抑制前癌基因表达，阻止肿瘤细胞从G0期进入G1期，抑制肿瘤细胞的增殖；还能诱导T细胞辅助抗体产生，增强细胞毒T细胞和N K细胞对肿瘤的杀伤作用；IFN-γ还作用于巨噬细胞、T细胞、B细胞等调节机体的免疫机能。桑黄所具有的诱生γ-干扰素的能力，有利发现其子实体水提取物具有诱生IFN-γ的能力，有利于其发挥调节机体免疫力、抑制肿瘤细胞增殖的作用。0h等用裂蹄木层孔菌Phellinuslinteus水提物制成的口服制剂每天1次，每次200mg/kg，4w后发现WEPL具有诱导产生γ-干扰素(IFN-γ)和促进淋巴T细胞生长达到抗肿瘤作用。还有报道裂蹄木层孔菌Phellinus linteus具有多种药理作用，对机体免疫力呈双向调节作用，可提高癌症患者的免疫力，同时也能改善糖尿病患者和自身免疫性疾病患者的免疫机能异常状况；抑制肿瘤细胞增殖与转移，发挥抗癌作用。研究发现鲍氏层孔菌Phellinus baumii的多糖对体液细胞具有免疫调节功能。Chung等还证明鲍氏层孔菌的多糖片段能够使小鼠产生对肉瘤的体液免疫反应。Song等指出鲍氏层孔菌的多糖进一步研究也发现其免疫调节功能，并对调节B淋巴细胞的多糖进行了纯化，对其物理和化学特性进行了研究。0h等指出鲍氏层孔菌多糖的免疫调节功能与其对B淋巴细胞的功能调节有关。

3.3抗氧化性研究

王稳航将从松木层孔菌Phellinus pini子实体中分离制备3种多糖，进行抗氧化性研究。结果表明PSII和PSIII的抗氧化效果最好。两种多糖在浓度为1.25mg/mL时，对超氧阴离子自由基的清除率均达到90％以上，在12mg/mL时，羟自由基清除率分别达到81.25％和85.37％，在浓度为10.6mg/mL时，丙二醛生成抑制率均达到65％左右。因此PSII和PSIII可作为优良的抗氧化剂应用于食品和保健品领域。

综上所述，国内外在对木层孔菌属(Phellinus)中火木层孔菌Phellinusigniarius、鲍氏层孔菌Phellinus baumii、裂蹄木层孔菌Phellinus linteus的研究较多，对其抗癌、增强免疫等作用给予肯定。然而对于同属真菌松木层孔菌Phellinuspini的研究报道却很少。仅见松木层孔菌在《中国大型真菌》和《中国大型真菌原色图鉴》中记载其对小白鼠肉瘤和艾氏腹水癌的抑制率均高达100％及王稳航从松木层孔菌Phellinus pini子实体中分离制备3种多糖，进行抗氧化性研究的报道。特别是关于从松木层孔菌Phellinus pini中提取的松木层孔菌多糖的抗肿瘤以及抑制肿瘤肺转移和肝转移的方面作用，未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供松木层孔菌多糖提取物在制备防治肿瘤转移及术后复发药物方面的应用，其中的松木层孔菌为松木层孔菌Phellinus pini子实体。该活性成分具有激活多形核白细胞，提高其杀伤肿瘤细胞的能力从而发挥抑制肿瘤转移及术后复发的作用。

本发明所采用的松木层孔菌Phellinus pini为多孔菌科，木层孔菌属真菌。子实体形态较大，马蹄形，贝壳形，吊钟形，有的扁平，木质。菌盖直径3～20cm，半圆形，表面深褐色，有明显同心环棱，稍开裂边缘锐，有金黄色绒毛，其下侧无子实层。菌肉咖啡色，菌管同色，多层。菌管口多角形至迷路状，管壁厚，每毫米1～3个；圆形，每毫米3～5个。子实层中有褐色刚毛。孢子淡褐色，光滑，近球形或椭圆形。

本发明的另一个目的是提供一种松木层孔菌多糖提取物的制备方法。

本发明所述的松木层孔菌多糖提取物，采用如下的步骤提取制得：

(1)水提：将松木层孔菌子实体粉碎，过40目筛，取粉末样品，用1∶5～20重量份数比蒸馏水加热提取2～3次，合并滤液；浓缩；

(2)醇沉：在浓缩液中加85～95％乙醇，以终浓度80％乙醇沉淀多糖，醇沉12～48h，抽滤得沉淀物；

(3)干燥：将沉淀物在40～60℃干燥，得多糖粉末。

本发明优选的提取工艺如下：

(1)水提：将松木层孔菌子实体粉碎，过40目筛，取粉末分别以1∶20蒸馏水90℃加热提取2次，每次2h，合并滤液。(2)醇沉：在浓缩液中加95％乙醇，以终浓度80％乙醇沉淀多糖，醇沉24h。抽滤得沉淀。(3)干燥：将沉淀物在40～60℃干燥，得松木层孔菌多糖粉末。

本发明进一步公开了含有松木层孔菌多糖提取物的组合物，其特征在于它是由松木层孔菌子实体制得的松木层孔菌多糖提取物及药学上可接受的药用载体组成。可制成口服制剂或注射剂。例如将药物组合物可以按照常规药物配制技术，将多糖粉末作为活性成分与可药用载体紧密混合来制备本发明的药物组合物，该载体可以依据想要的用于给药的形式(例如口服或胃肠外如肌内的)采用广泛多样的制剂形式。在制备口服剂型的组合物时，任何常用药物介质均可以使用。因此对于口服液体制剂如混悬液、酏剂和溶液剂，合适的载体和添加剂包括水、乙二醇、油、乙醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、着色剂等等；对于口服固体制剂如散剂、胶囊剂、小胶囊、软胶囊和片剂，合适的载体和添加剂包括淀粉、蔗糖、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等等。因为易于给药，片剂和胶囊剂代表最方便的口服单元剂量形式，该类情况下明显使用固体药用载体。如果需要，片剂可以通过标准技术包糖衣或肠溶衣。对于肠胃外投药，载体通常包含无菌水，也可以包括例如为了达到如助溶目的或为了防腐使用的其他成分。也可以制备注射用混悬液，该类情况下可以使用适当的液体载体、悬浮剂等。本文的药物组合物每剂量单位例如片、胶囊、散剂、注射剂等等应包含必需释放如上所述的有效剂量的有效成分量。本文的药物组合物每剂量单位例如片、胶囊、散剂、注射剂、栓剂等等应包含约0.01～1000mg，优选约1～1000mg，更优选约10～500mg并且可以以约0.001～20.0mg/kg/day的剂量给药，优选约0.001～5.0mg/kg/day、更优选约0.01～0.5mg/kg/day。然而，剂量可以依据受试者的需要、所治疗疾病的严重度和使用的化合物改变。每日给药或周期后增量可以使用。

优选这些组合物在单元剂量形式中，用于口服、肠胃外、鼻内、舌下或直肠给药、或者用于吸入或喷射给药，该单元剂量形式例如片剂、丸剂、口服液、胶囊剂、散剂、颗粒剂、无菌注射液或液体喷雾剂、滴剂、针剂、自动注射器装置或栓剂。或者，组合物可以将主要的活性成份与可药用载体例如普通压片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶、以及其他药用稀释剂例如水混合，以形成包含本发明设计的组合物。液体形式中的新颖的本发明组合物可以合并用于口服或注射给药，该液体形式包括水溶液、适当的增香的糖浆剂、水或油混悬液和含有食用油例如棉花子油、芝麻油、椰子油或花生油的增香的乳剂、以及酏剂和相似的药用载体。用于水混悬液的适当的分散剂或悬浮剂包括合成和天然的胶，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、藻酸盐、右旋糖酐、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯酮或明胶。例如，对于片剂或胶囊形式的口服给药，有效药物成分可以与口服、无毒的可药用惰性载体如乙醇、丙三醇、水等等组合。此外，当希望或需要时，合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂也可以并入混合物中。合适的粘合剂包括，不限于淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜料、天然和合成的胶如阿拉伯胶、西黄蓍胶或油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等等。崩解剂包括，不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄单胞菌胶等等。

优选组合物的日剂量在宽范围每成人每天0.01～1,000mg变化。口服给药，药物组合物优选以片剂形式给药，其包含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250和500mg的有效成分，用于所治疗患者症状的剂量调整。药物有效量通常以每天约0.001mg/kg～约5mg/kg体重的剂量水平供给，优选的范围为每天约0.01～约1mg/kg体重。组合物也可以按每天1～4次的方案给药。

本领域的技术人员可以容易地确定理想给药剂量，并且这些给药剂量将随着具体使用的提取物、给药模式、制剂的浓度、给药模式以及疾病病症的进展而改变。另外与所治疗的具体患者相关的因素，包括患者年龄、体重、饮食和给药时间会导致需要调整剂量。

本发明进一步公开了松木层孔菌多糖提取物在激活多形核白细胞，提高其杀伤肿瘤细胞的能力从而发挥抑制肿瘤转移及术后复发方面所具有的积极效果。下面通过具体的药理实验加以进一步的说明：

松木层孔菌多糖促进多形核白细胞对体外培养肿瘤细胞杀伤作用的研究

一、大鼠多形核白细胞分离

取12月龄大鼠一只，乙醚麻醉，心脏取血3mL，加入肝素抗凝的试管中，加到等量Ficoll上层，1800rpm离心20分钟后取PMN层，台盼兰计数活细胞数占总细胞数95％以上，调整多形核白细胞数至1×10⁴个/mL，备用。

二、肿瘤细胞培养

选取结肠癌细胞株(有市售)、肝癌细胞株HepG-2(有市售)、肺腺癌细胞株A549(有市售)和黑色素瘤细胞株A-375(有市售)，将传代的肿瘤细胞1×10³/孔，种于24孔板，培养24小时备用。

三、松木层孔菌多糖对多形核白细胞对培养肿瘤细胞杀伤作用的影响

将分离出的多形核白细胞以1×10⁴个/mL/孔接种于24孔板，分别加入松木层孔菌多糖(实施例1制备获得)使其终浓度分别为250ug/mL，125ug/mL，并作空白对照(只接种多形核白细胞，加入等量培养基)。作用2小时后，平板离心机离心，弃上清，用1mL全培养基重悬后加入预先培养有癌细胞的24孔板，即将经过药物作用的多形核白细胞与未经药物作用的癌细胞共培养，4小时后，倒置显微镜下观察，每孔随机取5个10＊10倍视野，照像并计数多形核白细胞在肿瘤细胞周围形成玫瑰花环样结构的比例。弃培养基，台盼兰染色，每孔随机取5个10＊10倍视野，照像，观察并计数癌细胞死亡比例。

结果如下：

(1)松木层孔菌多糖对多形核白细胞对结肠癌细胞杀伤作用的影响

药物(ug/mL实施例1)	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			松木层孔菌多糖250	72.88±14.36＊	43.01±8.26
松木层孔菌多糖125	34.64±6.93	28.25±5.99
			空白	18.43±3.75	5.39±1.08

(2)松木层孔菌多糖对多形核白细胞对肝癌细胞杀伤作用的影响

药物(ug/mL实施例1)	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			松木层孔菌多糖250	41.40±7.58＊	30.21±6.33
松木层孔菌多糖125	39.36±9.06＊	26.05±9.01
			空白	15.02±5.79	5.73±1.50

(3)松木层孔菌多糖对多形核白细胞对肺腺癌细胞杀伤作用的影响

药物(ug/mL实施例1)	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			松木层孔菌多糖250	50.08±12.70＊	39.09±8.24
松木层孔菌多糖125	47.23±8.67＊	29.12±6.19
			空白	18.67±4.36	5.16±1.96

(4)松木层孔菌多糖对多形核白细胞对黑色素瘤细胞杀伤作用的影响

药物(ug/mL实施例1)	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			松木层孔菌多糖250	40.77±5.03＊	32.88±11.92
松木层孔菌多糖125	37.61±2.35	19.13±9.95
			空白	17.40±3.08	6.51±1.78

^＊，与空白组比较差异有显著性。

小结：松木层孔菌多糖作用多形核白细胞2小时，可明显提高多形核白细胞玫瑰花环形成率及对肿瘤细胞的杀伤力。

松木层孔菌多糖对T739小鼠移植性肺腺癌生长及转移的抑制作用研究

体外实验显示松木层孔菌多糖能明显提高多形核白细胞对杀伤肿瘤细胞作用，为了进一步探讨其体内是否能抗移植性肿瘤生长及转移，我们采用LA795转移性肺腺癌模型T739小鼠对松木层孔菌多糖进行的体内抗肿瘤活性实验。

一、实验方法

1.药物：

采用本发明实施例1方法提供的松木层孔菌多糖。

阳性对照药：注射用环磷酰胺粉针剂。

2.动物及细胞株

实验动物采用SPF级近交T739小鼠，雌雄各半，体重(18.0±2.0)g，由中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心提供，实验动物合格证号为SCXK11-00-0005；瘤株为LA795小鼠肺腺癌瘤株，由中国协和医科大学基础医学研究所提供。

3.动物造模

取接种后第6-8天肿瘤生长良好的荷瘤鼠，拉断颈椎处死小鼠，在无菌条件下剥离肿瘤，选择新鲜无坏死的瘤组织剪碎置玻璃研磨器中，加适量生理盐水轻轻研磨制备成瘤细胞悬液，细胞筛过滤后加生理盐水稀释、计数，调配成细胞浓度为1×10⁷/mL的细胞悬液，在冰浴条件下每只0.2mL接种于健康小鼠右前肢腋窝皮下，接种浓度为2×10⁶/mL。

4.动物分组及给药：接种5天后的小鼠按瘤大小分为：

(1)模型组，生理盐水，每只0.2mL，腹腔注射给药；

(2)环磷酰胺组，按20mg/kg，腹腔注射给药；

(3)松木层孔菌多糖高剂量组，按200mg/kg，腹腔注射给药；

(4)松木层孔菌多糖低剂量组，按100mg/kg，腹腔注射给药

实验前将药物用蒸馏水配制成所需的浓度。环磷酰胺性质不稳定，于给药前用无菌生理盐水配制，振荡完全溶解后使用。每日给药1次。给药两周，于给药结束后次日颈部脱臼处死小鼠。

5.检测指标

5.1抑瘤率

于给药后第15天处死，解剖取其肺脏、肝脏、脾脏、肾脏，其中瘤组织及脾脏称重，分别按下列公式计算抑瘤率和脾指数：抑瘤率(％)＝[(1-给药组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100％]；脾指数＝脾重(mg)/体重(g)。将各组织于10％中性福尔马林保存。

5.2肿瘤转移

将福尔马林中保存的肺、肝脏、肾脏和做石蜡切片，常规HE染色，光学显微镜下观察各组肺、肝脏、肾脏内瘤栓与转移灶情况。

6.统计学处理

各组数据均采用SPSS10.0统计软件进行分析，组间比较使用方差分析。两两比较采用t检验。P＜0.05被认为有显著性差异。

二、实验结果

1.松木层孔菌多糖对荷瘤T739小鼠抑瘤率的影响

环磷酰胺组的瘤重与模型组相比具有显著性差异，抑瘤率分别可达52.08％；松木层孔菌多糖醇沉物3高剂量组，醇沉物4高剂量组对肿瘤生长的抑制作用较环磷酰胺差。

表2给药组对LA795转移性肺腺癌T739小鼠瘤重和抑瘤率的影响

组别	剂量(mg/kg/d)	抑瘤率(％)
			模型组	--
环磷酰胺组	20	52.08±15.87
			松木层孔菌多糖高剂量组	200	19.36±9.10
松木层孔菌多糖低剂量组	100	17.23±6.51

与模型组比较：^＊p＜0.05

2.松木层孔菌多糖对荷瘤T739小鼠肺脏，肝脏、肾脏肿瘤转移病理形态学观察结果

2.1肺组织病理形态变化

各组都有不同程度肺淤血和炎性浸润，其中：模型组和环磷酰胺组都有较多瘤栓与转移灶，但环磷酰胺组中数量更多面积更大。松木层孔菌多糖瘤栓与转移灶数量少且单个面积小，瘤栓极少，只发现散在的小转移灶，其中高剂量组少于低剂量组。

2.2肝脏病理形态变化

各组瘤栓与转移灶情况：模型组肝脏中瘤栓与转移灶数量多面积大，而环磷酰胺组数量最少，只发现极少量瘤栓。松木层孔菌多糖肝脏中瘤栓与转移灶数量较模型组少，其中低剂量组少于高剂量组。

2.3肾脏病理形态变化

各组肾脏结构未见明显异常。肾小球、肾小管及间质结构基本正常。毛细血管结构正常，管腔均匀，管壁可见内皮细胞分部完整。

3.结论

从对肺组织、肝组织和肾组织的损伤情况看，环磷酰胺组肺中瘤栓与转移灶比模型组还多，表明其促进了肿瘤的肺转移，而肝中瘤栓与转移灶则很少，表明其对肿瘤的肝转移有抑制作用。松木层孔菌多糖组肺脏组织和肝脏组织瘤栓和转移灶都很少，显示其具有明显的抑制肿瘤肺转移和肝转移的作用。

具体实施方式

实施例1

(1)水提：将松木层孔菌子实体粉碎，过40目筛，取粉末1000g，分别以1∶20蒸馏水，90℃加热提取2次，每次2h，合并滤液；浓缩：(2)醇沉：在浓缩液中加95％乙醇，以终浓度80％乙醇沉淀多糖，醇沉24h。抽滤得沉淀。(3)干燥：将沉淀物在60℃干燥，得松木层孔菌多糖粉末20g。

实施例2：

取松木层孔菌多糖粉末10g，葡萄糖50g水，补足至1000ml。制备方法：取处方量的多糖粉末，室温加入部分注射用水，搅匀后，加入葡萄糖，搅拌溶解，再补注射用水至1000ml，过滤，灌封，灭菌，即得5ml规格松木层孔菌多糖注射液。

实施例3：

取松木层孔菌多糖粉末10g，甘露醇100g，氯化钠90g，注射用水补足至1000ml。制备方法：取处方量的松木层孔菌多糖粉末，室温下溶于适量的注射用水中，搅拌溶解后，加入甘露醇，搅拌溶解，再补注射用水至1000ml，经6号垂熔滤器除菌滤过，将滤液立即在无菌条件下灌装，每支5ml，冷冻干燥后封口，即得松木层孔菌多糖冻干粉针。

实施例4：

取松木层孔菌多糖粉末15g。药用淀粉30.0g，硬脂酸镁2.5g，50％乙醇适量，制粒，整粒，烘干，装2#胶囊，每粒含松木层孔菌多糖0.1g。

实施例5：

取松木层孔菌多糖粉末50g，药用淀粉30.0g，糊精30.0g，50％乙醇适量，将上述原料充分搅拌混合制成颗粒，在60～70℃干燥2～4小时，制片，每片含松木层孔菌多糖0.5g。

实施例6

取松木层孔菌多糖粉末20g，加入0.32L的无菌去离子水稀释，(即20g多糖粉末制成约320ml)，冷藏24小时，离心去沉淀，最终清液加入木糖醇5g，冷藏过滤，获得澄明滤液，向清液中，再加入无菌去离子水至400ml，，装入无菌瓶中制成口服液，装量每支10ml。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。

Claims (6)

1.松木层孔菌多糖提取物在制备防治肿瘤转移药物方面的应用，其中的松木层孔菌为松木层孔菌Phellinus pini子实体。

2.松木层孔菌多糖提取物在制备激活多形核白细胞，提高杀伤肿瘤细胞能力药物方面的应用。

3.松木层孔菌多糖提取物在制备防治肿瘤术后复发药物方面的应用。

4.如权利要求1或2或3所述的松木层孔菌多糖提取物，采用如下的步骤提取制得：

(1)水提：将松木层孔菌子实体粉碎，过40目筛，取粉末样品，用1∶5～20重量份数比蒸馏水加热提取2～3次，合并滤液；浓缩；

(2)醇沉：在浓缩液中加85～95％乙醇，以终浓度80％乙醇沉淀多糖，醇沉12～48h，抽滤得沉淀物；

(3)干燥：将含沉淀物于40～60℃干燥，得多糖粉末。

5.一种含有松木层孔菌多糖提取物的组合物，其特征在于它是由松木层孔菌子实体制得的松木层孔菌多糖提取物及药学上可接受的药用载体组成。

6.如权利要求5所述的松木层孔菌多糖组合物，其特征在于将所述的组合物制成口服制剂或注射剂。