CN104027363A - 一种从松木层孔菌中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从松木层孔菌中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，所述方法包括：取松木层孔菌子实体，剪碎后用超临界萃取仪进行CO₂超临界萃取脱脂，取萃余物40～50℃热风干燥2～3h后粉碎，加入质量为萃余物质量15～30倍的70～95%（v/v）甲醇或乙醇水溶液，微波沸腾提取20～40min，过滤或离心去渣，取上清液真空浓缩，冷冻或真空干燥，即得所述α-葡萄糖苷酶抑制剂。本发明的有益效果主要体现在：松木层孔菌作为民间药用真菌已有较长的应用历史，毒副作用较小、安全性高；本发明方法不涉及有毒有害溶剂，安全性高，制得α-糖苷酶抑制剂活性高，十分有利于后续医药保健食品的开发。

Description

一种从松木层孔菌中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法

（一）技术领域

本发明涉及一种从松木层孔菌中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法。

（二）背景技术

药用真菌是一类具有较高药用价值的高等真菌，普遍具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗病毒和增强免疫力等几种或多种功效。

糖尿病是一种慢性、多发性内分泌紊乱疾病，与癌症、心血管疾病一起被视为世界性三大疾病。糖尿病患者长期高血糖状态可引起微血管和大血管以及神经损害，导致眼、肾、心血管、神经系统等功能障碍，产生多种并发症。最近几十年随着人类营养过剩、工作压力过大，以及人口老龄化等因素不断加剧，糖尿病发生率快速攀升。根据世界著名医学杂志Lancet统计，全球糖尿病人数目前有近4亿！这还不包括数量更多的糖耐量减低症潜在人群。而我国的糖尿病患者人数近1亿，居世界首位，已经跨入糖尿病高患病率国家行列，糖尿病年治疗费用达1700多亿元人民币！在临床上根据发病机制不同，糖尿病主要分为Ⅰ型（胰岛素依赖型）和Ⅱ型糖尿病（非胰岛素依赖型），其中后者占总数的90%左右。

α-葡萄糖苷酶抑制剂（alpha-glucosidase inhibitors），如德国拜耳研发的阿卡波糖（Acarbose，商品名：拜糖苹）、米格列醇（Miglitol，商品名：奥恬苹）和日本武田制药的伏格列波糖（Voglibose，商品名：倍欣）是目前使用最普遍的抗Ⅱ型糖尿病临床口服药，目标是控制血糖在合理的水平，并预防和治疗并发症。在生产上，除阿卡波糖为生物发酵法合成外，米格列醇和伏格列波糖普遍采用化学修饰或化学合成法。

上述用于治疗Ⅱ型糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制药物虽然控制血糖作用肯定，但需长期服药，且出现较多不良反应，如导致低血糖、乳酸性中毒、胃肠道反应和耐药性等，在使用具有一定的局限性。而且国内应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要是进口或专利期药，价格相对较贵，对多数长期服药的糖尿病患者经济压力较大。

我国是最早认识和利用食药真菌的国家之一，目前已临床药用的有灵芝、茯苓、猪苓、猴头、雷丸和冬虫夏草等二十余种，真菌代谢产物具有多种结构类型和多种生理活性，是寻找新的天然药物的重要来源。但是目前对食药用菌的大量药理研究主要集中在其水溶性多糖（尤其是β-葡聚糖）的增强免疫和抗肿瘤方面，对其产品开发也大多集中于此。而对其中的醇提物（三萜、皂甙和酚类等小分子物质）的深入研究和产品开发要少的多。

目前已有在食药用菌抗糖尿病、降血糖和α-糖苷酶抑制方面主要集中于桦褐孔菌（Inonotus obliquus）多糖方面。如1999年日本的Mizuno T等人研究发现，桦褐孔菌的菌丝和菌核中的多糖有降低血糖的作用，水溶性和非水溶性多糖对糖尿病小鼠都有降血糖作用，活性成分主要是β-葡聚糖、杂多糖和蛋白复合物。2005年，韩国的Yang B.K.等人研究发现相比对照组，糖尿病小鼠口服桦褐孔菌菌丝体可减少23.1%的血糖浓度。2006年，韩国的Cha,Jae-Young等人发现桦褐孔菌发酵物可降低糖尿病小鼠的血糖水平。Mizuno T等从桦褐孔菌菌核和菌丝体中提取和部分纯化得到含蛋白的多糖。实验表明可溶和不可溶性多糖均有降血糖的作用。其有效成分为β-葡聚糖、杂多糖及它们的蛋白质复合物。在我国，延边大学的张香花等人在2008年的研究表明桦褐孔菌提取物对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的胰岛、肝和肾组织损伤病变有一定的保护和修复作用。2008年，江南大学的孙军恩研究发现桦褐孔菌发酵菌粉及其多糖提取物具有良好的降血糖、降血脂和抗氧化能力。而且桦褐孔菌发酵菌粉及其多糖组分可能降糖机理包括修复糖尿病小鼠受损胰岛β细胞、促进胰岛素分泌、增加肝糖原含量和提高糖尿病小鼠抗氧化能力。

而小分子的酚类物质是指在苯环上具有一个或多个羟基的化合物，主要包括黄酮类、酚酸类等单体和鞣酸、单宁类等多聚物。酚类化合物具有抗氧化、抗癌、抗过敏、消炎、降血脂、抑制动脉硬化和抗衰老等多种功效，是近几十年来活性物质研究的热点之一，但其对α-糖苷酶的抑制作用和降血糖功能在近十余年才逐渐有报道。

在醇提物的酚类抗糖尿病方面，目前的研究报道还很少，如2009年，天津大学的卢雪明等人采用乙醇回流提取、梯度萃取得桦褐孔菌的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物，对其进行黄酮和多酚类化合物的含量测定，并测定了总还原力、清除DPPH自由基、抑制肝脂质过氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性四种体外模型对不同提取物活性的影响，结果显示乙酸乙酯和正丁醇提取物所含的黄酮和多酚类化合物较多且抗氧化和α-糖苷酶活性较好。2012年，陕西师范大学的张化朋研究发现桦褐孔菌的乙醇粗提物萃取组分对α-淀粉酶有抑制活性，而粗多糖对α-葡萄糖苷酶有抑制作用。

松木层孔菌（Phellinus pini）又名松针层孔菌、松白腐菌，隶属于担子菌门、伞菌纲，锈革孔菌目（Hymenochaetales），锈革孔菌科（Hymenochaetaceae），木层孔菌属（Phellinus）。松木层孔菌是一种能引起树材腐朽的白腐真菌，主要寄生于云杉、落叶松等针叶树活立木上,易引起木质部形成白色腐朽，对树木危害较大。已有研究表明松木层孔菌子实体多糖具有一定的抗病毒和抗氧化活性，其菌丝体多糖对小鼠离体淋巴细胞也有较显著的促增殖作用。

发明人前期研究发现松木层孔菌水提多糖具有一定抑制α-葡萄糖苷酶活性，半抑制浓度（IC50）为2.17mg/mL。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种从松木层孔菌中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，按照该方法，提取的α-葡萄糖苷酶抑制剂中总酚含量为12～20%，对α-葡萄糖苷酶的平均半抑制浓度（IC50）仅为0.081mg/mL，活性大为提高，是水提多糖活性的26.8倍。

本发明采用的技术方案是：

一种从松木层孔菌中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，所述方法包括：取松木层孔菌子实体，剪碎（至0.3～0.6cm³的小块为宜），用超临界萃取仪进行CO₂超临界萃取脱脂，超临界萃取条件：压强20～30MPa，温度30～50℃，静态萃取1～2h，动态放料0.3～0.6h；取萃余物40～50℃热风干燥2～3h后粉碎，加入质量为萃余物质量15～30倍的70～95%（v/v）甲醇或乙醇水溶液，微波沸腾提取20～40min，过滤或离心去渣，取上清液真空浓缩（≤45℃，0.08MPa以下），冷冻或真空干燥（真空干燥为≤45℃，0.08MPa以下），即得所述α-葡萄糖苷酶抑制剂。

优选的，所述微波提取时微波功率为500～600W。

发明人在十几种食药用菌子实体多种提取工艺探索比较和α-糖苷酶抑制活性筛选前提下，通过超临界脱脂，微波辅助甲醇浸提，真空浓缩、冷冻干燥或真空干燥等技术方法，建立了如上说的一种安全性高、活性强的松木层孔菌α-糖苷酶抑制剂的提取方法和工艺。本发明在脱脂时采用超临界CO₂脱脂，可以起到部分除杂的目的，相比常规的石油醚等有机溶剂浸提脱脂方法，具有无毒、提取条件适中、环境友好等特点。

本发明的有益效果主要体现在：松木层孔菌作为民间药用真菌已有较长的应用历史，毒副作用较小、安全性高；本发明方法不涉及有毒有害溶剂，安全性高，制得α-糖苷酶抑制剂活性高，十分有利于后续医药保健食品的开发。

（四）附图说明

图1为本发明松木层孔菌子实体提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性；

图2为阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例中松木层孔菌为野生来自东北林区，由浙江省医学科学院保健食品研究所吴学谦研究员鉴定。

糖苷酶抑制活性实验：在试管中依次加入1.2mL磷酸钾缓冲液（0.067mol/L磷酸钾缓冲液，pH=6.8）、50μL谷胱甘肽（1mg/mL），2μLα-葡萄糖苷酶（0.1U/mL）和一定体积的药用真菌α-糖苷酶抑制剂溶液，37℃保温10min。加入50μL PNPG，再于37℃保温10min后，加入10mL碳酸钠终止液，在400mn处测定吸光值。以不加抑制剂作为空白对照，以阿卡波糖为阳性对照。

α-葡萄糖苷酶活力单位定义：pH6.8，37℃条件下，每分钟释放1μmolPNP为一个活力单位。抑制剂活力单位定义：pH6.8，37℃条件下，使一个酶活力单位失活为一个抑制剂活力单位。样品对α-葡萄糖苷酶抑制率的计算公式为：抑制率%=（酶活力-抑制剂活力）/酶活力×100%。

总酚含量测定：采用福林酚法（Folin-Ciocalteu），取适量提取物用80%甲醇溶解，提取液加入200μl0.1N的福林酚试剂和2000μl超纯水，振荡后放置3min，再加入1000μl碳酸钠（20%，w/v）溶液，振荡后室温避光放置1h，765nm下测定吸光值，设蒸馏水为空白对照。结果以没食子酸的相当量计算。

实施例1：

松木层孔菌子实体→剪碎至0.4cm³左右的小块→称取50g→CO₂超临界脱脂（超临界萃取仪：美国Applied Separation公司，SFE-Prime），压力20MPa，温度40℃，静态萃取1h，动态放料0.5h→萃余物50℃热风干燥2h后粉碎→加入原料重量20倍的80%乙醇水溶液→微波沸腾提取20min（微波提取仪：上海新仪微波化学科技有限公司，MAS-Ⅱ，功率600W）→离心去渣→上清液真空浓缩（45℃，0.05MPa）至干→加100mL蒸馏水，此处加蒸馏水的目的一是为了洗涤转移上述的旋转蒸发干燥物（旋转蒸发干燥物会粘壁，而且也不可能干燥的很彻底，需要二次干燥），二是为了冰箱贮藏预冷冻，以方便后续冻干。→40℃、0.06MPa下真空干燥→松木层孔菌α-糖苷酶抑制剂（含总酚12.3%）→α-葡萄糖苷酶半抑制活性IC₅₀=0.075mg/mL。

采用上述方法，对所得的松木层孔菌子实体提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性与阿卡波糖的活性进行了比较实验，具体结果如图1和图2。

α-糖苷酶抑制活性实验表明，松木层孔菌提取物随浓度增高均呈量效关系。平均半抑制浓度IC₅₀为0.081mg/mL，是目前普遍使用的阳性对照品阿卡波糖（IC₅₀=4.2mg/mL）效果的51.9倍。

实施例2：

松木层孔菌子实体→剪碎至0.3cm³左右的小块→称取50g→CO₂超临界脱脂（超临界萃取仪：美国Applied Separation公司，SFE-Prime），压力30MPa，温度45℃，静态萃取1.5h，动态放料0.5h→萃余物45℃热风干燥3h后粉碎→加入原料重量30倍的95%乙醇水溶液→微波沸腾提取40min（微波提取仪：上海新仪微波化学科技有限公司，MAS-Ⅱ，功率600W）→离心去渣→上清液真空浓缩（40℃，0.05MPa）至干→加80mL蒸馏水→40℃、0.06MPa下真空干燥→松木层孔菌α-糖苷酶抑制剂（含总酚18.5%）→α-葡萄糖苷酶半抑制活性IC₅₀=0.057mg/mL。

实施例3：

松木层孔菌子实体→剪碎至0.4cm³左右的小块→称取50g→CO₂超临界脱脂（超临界萃取仪：美国Applied Separation公司，SFE-Prime），压力20MPa，温度40℃，静态萃取1h，动态放料0.5h→萃余物50℃热风干燥2h后粉碎→加入原料重量20倍的70%甲醇水溶液→微波沸腾提取20min（微波提取仪：上海新仪微波化学科技有限公司，MAS-Ⅱ，功率600W）→离心去渣→上清液真空浓缩（45℃，0.05MPa）至干→加90mL蒸馏水→冷冻→松木层孔菌α-糖苷酶抑制剂（含总酚13%）→α-葡萄糖苷酶半抑制活性IC₅₀=0.081mg/mL。

实施例4：

松木层孔菌子实体→剪碎至0.3cm³左右的小块→称取50g→CO₂超临界脱脂（超临界萃取仪：美国Applied Separation公司，SFE-Prime），压力30MPa，温度45℃，静态萃取1.5h，动态放料0.5h→萃余物50℃热风干燥2h后粉碎→加入原料重量20倍的80%甲醇水溶液→微波沸腾提取40min（微波提取仪：上海新仪微波化学科技有限公司，MAS-Ⅱ，功率600W）→离心去渣→上清液真空浓缩（40℃，0.05MPa）至干→加100mL蒸馏水→冷冻→松木层孔菌α-糖苷酶抑制剂（含总酚16.0%）→α-葡萄糖苷酶半抑制活性IC₅₀=0.069mg/mL。

Claims (2)

1.一种从松木层孔菌中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，所述方法包括：取松木层孔菌子实体，剪碎，CO₂超临界萃取脱脂预处理，超临界萃取条件：压强20～30MPa，温度30～50℃，静态萃取1～2h，动态放料0.3～0.6h；取萃余物40～50℃热风干燥2～3h后粉碎，加入萃余物质量15～30倍的70～95%甲醇或乙醇水溶液，微波沸腾提取20～40min，过滤或离心去渣，取上清液真空浓缩，冷冻或真空干燥，即得所述α-葡萄糖苷酶抑制剂。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述微波提取功率为500～600W。