CN101225422A - 一种从丹参中提取多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从丹参中提取多糖的方法，该方法是：将丹参经超微粉碎脱脂处理后，用纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶中的一种或多种在pH4～6、40～80℃下水解0.5～1.5小时，然后在频率为59KHz的超声波下处理0.5～1.5小时，过滤，最后用乙醇沉淀滤液中的多糖。本发明方法在提取真菌多糖的工艺的基础上调整了酶的种类和用量，以及酶处理和超声波提取的工艺条件，实现了低耗能、高效地提取丹参多糖的目的。
Description
技术领域
本发明涉及多糖类化合物的制备，具体涉及中药材丹参中多糖的提取。
背景技术
丹参(Salviamiltiorrhiza Bge.)是著名的活血化瘀药，临床广泛用于冠心病、心绞痛、心肌梗塞和脑血管疾病的治疗。人们在对丹参的化学成分进行药理筛选过程中，发现丹参根中提取到的多糖用于氨基核苷诱导的实验性肾病模型和四氯化碳引发的肝损伤模型，经口服和肌注，能减少尿蛋白的排泄，抑制血清胆固醇和脂质过氧化物浓度的提高，改善血清白蛋白与球蛋白的比值(A/G)，并能降低肝损伤引起的ALT升高。
关于丹参多糖提取工艺的研究较少，大多停留于传统的水提醇沉法。《紫花丹参多糖的提取工艺研究》一文公开了一种提取丹参多糖的方法，该方法为水提醇沉法，具体步骤是：取粉碎后的丹参10g，加20～40倍水并于95℃下浸提2～4h，然后5000r/min离心10min，取上清液，重复上述过程一次，合并上清液，在40℃以下浓缩至原体积1/4，加入3倍体积80～100％的乙醇，过夜；离心，取沉淀物，60℃烘干，即可。该方法的多糖得率较低，为1.7-2.1％。
酶处理法相对于上述方法具有反应温和、得率高、成本低廉、操作简单等优点，已用到真菌多糖的提取中，如郑静等人发表的《超声波法和超声波酶法提取灵芝多糖的条件研究》公开了利用超声波结合纤维素酶提取灵芝多糖的方法：1、将灵芝子实体粉用3倍体积浓度为80％乙醇85℃回流6小时脱低聚糖，滤出溶剂，将滤渣烘干；2、按1∶20(W∶V)的料液比，2％酶量，在pH6.0，50℃下酶解20分钟；3、在55℃超声提取15分钟；4、将提取液经过滤、离心、浓缩和乙醇沉淀得粗多糖。该方法提取灵芝多糖得率高、周期短，粗提取物中多糖含量高达57.62％。但灵芝为真菌，灵芝多糖多存于子实体细胞壁内，其子实体的主要构成成分是纤维素、半纤维素和木质素，而丹参具有较强韧的硬壁组织，与灵芝有较大的不同，套用上述方法的工艺难以取得好的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从丹参中提取多糖的方法。
本发明实现上述目的的技术方案是：
一种从丹参中提取多糖的方法，该方法由以下步骤组成：
(1)粉碎：将丹参粉碎至粒径为10～100μm的微粉；
(2)脱脂：将丹参微粉用8～12倍体积的浓度大于或等于90％乙醇回流1～3小时，过滤，取滤渣挥干溶剂后备用；
(3)酶处理：将脱脂处理后的丹参微粉加到10～15倍体积的水中，再加入酶，然后用碱将pH值调节至4～6，在40～80℃下保温0.5～1.5小时；所述的酶可以是纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶中的一种，用量为丹参重量0.5％～1.5％，也可以纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶中的两种以上，每种酶的用量为丹参重量0.5％～1.5％，最好是纤维素酶和木瓜蛋白酶，每种酶的用量均为丹参重量的1.5％；
(4)超声提取：在频率为59kHz的超声波下处理0.5～1.5小时，过滤，收集滤液；
(5)醇沉：加入乙醇使其在滤液中的浓度至80～90％，沉淀出丹参多糖固体，60～80℃真空干燥。
上述方法中，将脱脂处理后的丹参微粉浸泡于10～15倍体积的酶溶液在pH5.5、60℃下水解60分钟，可以取得最佳的酶解效果。
本发明方法，步骤(3)将脱脂处理后的丹参微粉加到10～15倍体积的水中，再加入酶后，所得到的溶液为酸性，可采用熟知的方法营造pH值为4～6的水解环境，如加入氢氧化钠、氢氧化钾、三乙醇胺等碱。
本发明方法的原理是：利用超微粉碎技术，将丹参超微粉碎后，可以提高丹参中有效成分的溶出率。利用酶处理丹参，反应条件温和，不会破坏丹参多糖结构，然后利用超声波的空化作用加速多糖的溶出，另外超声波的次级效应如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速多糖的扩散释放并充分与溶剂混合，有利于提取；超声波辅助提取具有提取时间短，溶剂用量少，提取率高，有利于进一步的精制提纯等优点，且无需加热，适合于提取热敏物质。
虽然用酶处理和超声波提取真菌多糖已是本领域常用的手段，但由于丹参组分和结构与真菌有较大区别，采用与提取真菌多糖相同的工艺来提取丹参多糖，效果明显欠佳。本发明选用了对丹参硬壁组织有较好降解作用的酶，并优化了各种酶的搭配和用量，使其能充分降解丹参中的纤维素、木质素和各种蛋白质，同时还调整了超声波提取的条件，加速多糖的溶出，丹参多糖的提取率可达5～11％。
下面将通过动物实验来说明本发明方法提取的丹参多糖的药物活性及其效果。
一、丹参多糖的保肝作用实验
(一)四氯化碳模型
1.实验材料：
(1)动物：昆明种小鼠70只，20±2g，雌雄各半，购自广州中医药大学实验动物中心，饲料颗粒由南方医科大学实验动物中心提供。
(2)试剂：四氯化碳(分析纯)，广州化学试剂厂(批号980402584)；ALT、AST试剂盒，购自南京建成生物工程研究所(批号20061223)。
(3)药品：复方鳖甲软肝片：内蒙古福瑞科技股份有限公司(批号20060303)；联苯双酯：广州星群(药业)股份有限公司(批号DF40030)；丹参多糖由实施例20方法制备。
2.方法与结果：
(1)分组：小鼠随机分7组：正常组、模型组、丹参多糖高、中、低剂量组、联苯双酯组、复方鳖甲软肝片组，各组给药剂量如下：丹参多糖高剂量组：丹参多糖成人剂量4倍、丹参多糖中剂量组：丹参多糖成人剂量2倍、丹参多糖低剂量组：丹参多糖成人剂量、联苯双酯组：成人每日剂量、复方鳖甲软肝片组：成人每日剂量，正常组及模型组给予0.5ml/只生理盐水。
(2)方法：各组连续灌胃给药7天，于末次给药后1h，除正常组外，其余各组均0.12％CCL4花生油溶液0.4mL/只。24h后，所有小鼠采用摘眼球法取血，分离血清，低温保存，一次性同试剂同人操作进行。并将肝组织置于10％的福尔马林液中保存。病理切片：取肝组织，石蜡包埋，切片，常规HE染色，观察肝细胞变性、坏死情况。
(3)结果：从表1中可见，模型组小鼠血清ALT和AST两种转氨酶活性均明显高于正常组(P＜0.01)，提示模型建立成功。与模型组比较，丹参多糖各剂量组血清ALT和AST显著降低(P＜0.05)。丹参多糖各剂量组与复方鳖甲软肝片组相比，血清ALT和AST无显著性差异(P＞0.05)。但丹参多糖各剂量组降低血清ALT和AST效果不如联苯双酯组(P＜0.05)。本实验结果表明，丹参多糖能明显降低CCl4引起的大鼠ALT、AST的增高。所致大鼠肝脏病变明显减轻，说明丹参多糖对四氯化碳性肝损害有一定的保护作用。
表1丹参多糖对CCl4模型小鼠肝损伤的影响
| 组别 | 例数 | ALT(U/L) | AST(U/L) |
| 丹参多糖高剂量组 | 10 | 166.02±20.13## | 174.78±19.12## |
| 丹参多糖中剂量组 | 10 | 170.16±17.80## | 198.87±19.78## |
| 丹参多糖低剂量组 | 10 | 213.92±26.42## | 225.24±17.61## |
| 复方鳖甲软肝片组 | 10 | 161.21±16.13## | 177.83±19.30## |
| 联苯双酯组 | 10 | 136.09±15.31## | 156.27±20.15## |
| 模型组 | 10 | 271.44±39.37* | 321.35±28.69* |
| 正常组 | 10 | 58.10±12.63 | 86.54±13.70 |
##P＜0.01与模型组比较，*P＜0.01与正常组比较
(二)D-半乳糖模型
1.材料：
(1)动物：昆明种小鼠70只，20±2g，雌雄各半，购自广州中医药大学实验动物中心，饲料颗粒由南方医科大学实验动物中心提供。
(2)试剂：D-氨基半乳糖(D-GLAN)，广州威佳科技有限公司；ALT、AST试剂盒，购自南京建成生物工程研究所(批号20061223)。
(3)药品：复方鳖甲软肝片：内蒙古福瑞科技股份有限公司(批号20060303)；联苯双酯：广州星群(药业)股份有限公司(批号DF40030)；丹参多糖由实施例20方法制备。
2.方法与结果：
(1)分组：小鼠随机分7组：正常组、模型组、丹参多糖高、中、低剂量组、联苯双酯组、复方鳖甲软肝片组，各组给药剂量如下：丹参多糖高剂量组：丹参多糖成人剂量2倍、丹参多糖中剂量组：丹参多糖成人剂量1.5倍、丹参多糖低剂量组：丹参多糖成人剂量、联苯双酯组：成人每日剂量、复方鳖甲软肝片组：成人每日剂量，正常组及模型组给予0.5ml/只生理盐水。
(2)方法：各组连续灌胃给药7天，于末次给药后1h，除正常组外，其余各组均腹腔注射D-氨基半乳糖(800mg/kg)。禁食24h后，所有小鼠采用摘眼球法取血，分离血清，低温保存，一次性同试剂同人操作进行。并将肝组织置于10％的福尔马林液中保存。
病理切片：取肝组织，石蜡包埋，切片，常规HE染色，观察肝细胞变性、坏死情况。
将肝组织损伤程度分为4级：0级(-)，肝组织结构正常，无明显变性，坏死及炎症细胞浸润；1级(+)，肝小叶结构尚正常，可见明显的混浊肿胀，气球样变或脂肪变性，散在点状坏死；2级(++)，肝小叶结构不清，可见明显的灶状坏死，伴有炎症细胞浸润；3级(+++)，肝小叶结构不清、可见明显的片状坏死，伴有炎症细胞浸润。
(3)结果：从表2中可见，模型组小鼠血清ALT和AST两种转氨酶活性均明显高于正常组(P＜0.01)，提示模型建立成功。丹参多糖各剂量组与模型组比较，血清ALT和AST显著降低(P＜0.05)。丹参多糖各剂量组与联苯双酯组及复方鳖甲软肝片组相比，血清ALT和AST降低无显著性差异(P＞0.05)。实验结果证实丹参多糖对D-GLAN所致的急性肝细胞损伤具有降酶保肝作用。
表2丹参多糖对D-Glan模型小鼠肝损伤的影响
| 组别 | 例数 | ALT(U/L) | AST(U/L) |
| 丹参多糖高剂量组 | 10 | 155.16±21.61## | 159.81±18.71## |
| 丹参多糖中剂量组 | 10 | 186.57±17.92## | 183.75±20.12## |
| 丹参多糖低剂量组 | 10 | 173.59±29.29## | 196.95±14.71## |
| 复方鳖甲软肝片组 | 10 | 151.91±30.96## | 182.64±20.70## |
| 联苯双酯组 | 10 | 139.51±26.03## | 169.02±13.03## |
| 模型组 | 10 | 257.98±31.42* | 277.77±32.48* |
| 正常组 | 10 | 78.97±13.30 | 112.51±11.85 |
##P＜0.01与模型组比较，*P＜0.01与正常组比较
二、丹参多糖对小鼠免疫功能和小鼠体液免疫功能实验
(一)丹参多糖对小鼠免疫功能的影响：
1实验材料：
昆明小鼠，南方医科大学实验动物中心提供。丹参多糖由实施例20方法制备；复方鳖甲软肝片、生脉口服液购自南方大药房。白细胞稀释液：按冰醋酸2ml蒸馏水98ml、1％亚甲蓝2滴比例用前配制。
2实验方法与结果：
(1)分组及方法：昆明小鼠，雌雄各半，每只(15±2)g，随机分为6组，每组10只，即正常组、丹参多糖高、中、低剂量组、复方鳖甲软肝片组、生脉口服液组。用蒸馏水溶解或稀释药物，每组小鼠灌胃0.5ml/只/天。丹参多糖高、中、低剂量组小鼠灌胃丹参多糖剂量分别为2.15、0.65、0.22mg/只；生脉口服液和复方鳖甲软肝片的用量按成人用量的0.0026换算；正常组同时以蒸馏水灌胃0.5ml/只。每日1次，连续7d，于第8d处死动物。动物眼眶取血20μL加于380μL白细胞稀释液中，镜下计数白细胞。摘取小鼠的胸腺和脾脏，用滤纸吸干残血后，称重(mg)，分别除以小鼠体重(g)，得到胸腺指数和脾脏指数。
上述各项指标均计算均数(
)与标准差(SD)，用统计软件SPSS11.0进行数据分析，各组间比较用LSD法。结果见表3，表4。
(2)结果：与正常组相比，丹参多糖、复方鳖甲软肝片组对外周白细胞的影响无显著性差异；生脉口服液对小鼠外周白细胞增殖的影响有统计学意义(p＜0.05，见表3)。丹参多糖各剂量组和生脉组能够有效抑制小鼠胸腺的萎缩(p＜0.05见表4)，但无明显量效关系；丹参多糖各剂量组和生脉口服液组对于小鼠脾脏有促进增殖的作用(p＜0.05，见表4)。本实验结果表明，丹参多糖有增强小鼠免疫功能的作用。
表3丹参多糖对外周白细胞的影响
| 组别 | 外周白细胞计数 |
| 正常组 | 0.716±0.164×105 |
| 丹参多糖高剂量组 | 1.178±0.578×105* |
| 丹参多糖中剂量组 | 1.164±0.202×105* |
| 丹参多糖剂低量组 | 1.106±0.383×105* |
| 复方鳖甲软肝片 | 1.140±0.534×105* |
| 生脉口服液 | 1.648±1.390×105** |
*P＜0.05，**P＜0.01与正常组比较：
表4丹参多糖对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响
| 组别 | 胸腺指数(mg/g) | 脾脏指数(mg/g) |
| 正常组 | 1.106±0.662 | 2.484±0.652 |
| 丹参多糖高剂量组 | 1.418±0.565* | 3.632±0.834* |
| 丹参多糖中剂量组 | 1.392±0.978* | 3.566±0.662* |
| 丹参多糖低剂量组 | 1.292±0.584* | 3.604±1.269** |
| 复方鳖甲软肝片 | 1.127±0.648 | 2.850±0.735 |
| 生脉口服液 | 1.588±0.915** | 4.182±1.095* |
*P＜0.05，**P＜0.01与正常组比较
(二)丹参多糖对小鼠体液免疫功能的影响(半数溶血值测定法)
1、原理：
用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体(溶血素)，与SRBC一起孵育，在补体参与下，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。
2、实验材料
721分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC、补体(豚鼠血清)、都氏试剂(碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL)、生理盐水；KM种小鼠由南方医科大学实验动物中心提供。丹参多糖由实施例20方法制备。复方鳖甲软肝片、生脉口服液购自南方大药房。
3、方法与结果
方法：KM种小鼠60只，18～22g，雌雄各半，随机分6组，每组10只：即正常对照组、丹参多糖高、中、低剂量组、复方鳖甲软肝片组，生脉口服液组。用蒸馏水溶解或稀释药物，每组小鼠灌胃0.5ml/只/天。丹参多糖高、中、低剂量组小鼠灌胃丹参多糖剂量分别为2.15、0.65、0.22mg/只；生脉口服液和复方鳖甲软肝片的用量按成人用量的0.0026换算；正常组同时以蒸馏水灌胃0.5ml/只。每日一次，连续7天。在实验第3天以20％SRBC0.2ml免疫小鼠，每只鼠腹腔注射0.2ml，继续给药至第7天。末次给药后24h，摘眼球取血，室温放置1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，3000r/min离心10min，收集血清。取血清用NS稀释200倍。取稀释血清1ml置试管内，加10％SRBC 0.5ml，1∶10补体1ml。置37℃水浴中保温30min，然后将管移入冰浴中终止反应；2000r/min离心10min，取上清液1ml加都氏剂3ml，混匀放置10min，540nm处检测吸收度。另取10％SRBC 0.25ml，加都氏剂3.75ml，同法测吸收度，作为SRBC半数溶血值。小鼠血清溶血素抗体含量以样品半数溶血值(HC50)表示。
半数溶血值(HC50)＝[样品吸收度值/SRBC半数溶血值]×稀释倍数(200)
上述指标计算均数
与标准差(SD)，用统计软件SPSS11.0进行数据分析，各组间比较用LSD法。结果见表5。
结果：与正常组相比，丹参多糖高、中、低剂量组，复方鳖甲软肝片组对小鼠体液免疫均有增强作用，差异有显著性(p＜0.05，见表)。本实验结果表明，丹参多糖有增强小鼠体液免疫的作用。
表5丹参多糖对小鼠半数溶血值(HC50)的影响
| 组别 | HC50 |
| 正常组 | 82.19±4.50* |
| 丹参多糖高剂量组 | 102.35±6.60* |
| 丹参多糖中剂量组 | 93.27±3.51* |
| 丹参多糖剂低量组 | 97.52±4.86* |
| 生脉口服液 | 87.55±6.24 |
| 复方鳖甲软肝片 | 95.13±9.37* |
*P＜0.05与正常组比较
三、丹参多糖抗免疫性肝损伤实验
(一)C57小鼠免疫性肝损伤模型
1.实验材料
(1)动物：C57小鼠，70只，4-6周龄，体重14-16g，雌雄各半(中山大学实验动物中心提供)，实验期间的颗粒饲料由南方医科大学实验动物中心提供。SD大鼠肝脏由别人赠送，均为正常老鼠肝脏。
实验环境：动物房保持通风、干燥、室温22-25℃，湿度50-70％，自由饮水、鼠料定量饲养。
(2)试剂：弗式完全佐剂，购于sigma公司，规格：F5881-10ml、ALT试剂盒购于南京建成生物工程研究所，批号：20061016、AST试剂盒购于南京建成生物工程研究所，批号：20061016、N0试剂盒购于南京建成生物工程研究所，批号：20061205、TNF-α试剂盒购于RD公司批号：EIA05897、丹参多糖由实施例20方法制备，用时蒸馏水溶解稀释、复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司)批准文号：国药准字：Z19991011、联苯双酯滴丸(广州星群药业股份有限公司)批准文号：国药准字：H44023176
主要仪器：721B型分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)、酶标仪(sigma公司)、DK-8AD型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)、离心机(Thermo)
2.方法与结果
(1)实验方法：取SD大鼠肝组织，用4℃预冷的生理盐水反复冲洗，洗去浮血，用滤纸擦干称重。再用生理盐水配成10％肝组织匀浆，按照1∶1比例将10％肝组织匀浆与弗式完全佐剂混合制成乳化剂。除正常组外C57小鼠皮下注射，每次0.1ml，每周两次，共8次，一月左右形成免疫性肝损伤模型。将实验动物随机分为7组：正常组、模型组、丹参多糖高、中、低剂量组、联苯双酯组、复方鳖甲软肝片组，每组10只。造模同时开始按既定方案灌胃直到动物处死前一天，正常组给予同等剂量生理盐水。造模结束后所有小鼠禁食12h，称重后采血，脱椎处死取肝脏、脾脏、胸腺称重计算脏器系数，肝左叶标本常规固定包埋切片HE染色，剩余肝脏超低温冰箱冻存以做肝组织匀浆。血液3000转10分钟离心取血清超低温冰箱冻存以备下一步检测所需。
指标测定：(1)光镜标本：石蜡包埋，常规切片，HE染色。(2)ALT、AST、NO用小鼠血清(1∶5稀释)按试剂盒说明检测。(3)冻存肝脏化冻后生理盐水洗去浮血，用生理盐水配成10％肝组织匀浆，3500转10分钟离心取上清液，10倍稀释。ELISA法按试剂盒说明检测TNF-α。
(2)统计处理方法：上述各项指标均计算均数(
)与标准差(S)，用统计软件SPSS11.0进行方差分析。
(3)结果：
①肝功(血清中ALT、AST)的变化及比较
由表6可见，模型组明显高于正常组(P＜0.01)，说明模型建立成功。丹参多糖高、中、低剂量组与模型组比较可显著降血清中的ALT和AST含量(P＜0.01)，以丹参多糖中、低剂量组效果较为明显。
②N0、TNF-α的变化及比较
由表7可见，模型组明显高于正常组(P＜0.01)，说明模型建立成功。丹参多糖高、中、低剂量组与模型组比较可显著降血清中的N0及组织中TNF-α含量(P＜0.01)，以丹参多糖中剂量组效果较为明显。
③脏器系数的变化及比较
由表8可见，模型组肝脏、脾脏系数明显高于正常组(P＜0.01)，胸腺系数明显低于正常组(P＜0.01)，说明模型建立成功。丹参多糖高、中、低剂量组与模型组比较可显著改变肝脏、脾脏、胸腺系数(P＜0.05)。
④肝组织病理变化
模型组肝细胞损害，伴炎性细胞浸润和局灶性肝细胞坏死，甚至汇管区和肝小叶内广泛炎性细胞浸润，伴广泛的肝细胞坏死。正常组肝细胞、汇管区、胆管区未见异常，说明模型建立成功。丹参多糖高、中、低剂量组与正常组比较有不同程度肝细胞肿大、炎症细胞浸润等肝损伤病变，但与模型组比较损伤程度明显减轻。
综上所述，丹参多糖高、中、低剂量组对C57小鼠免疫性肝损伤均有明显保护作用。
表6丹参多糖对免疫性肝损伤C57小鼠肝功能的影响
| 组别 | 动物数 | ALT(U/L) | AST(U/L) |
| 正常组 | 10 | 32.70±3.93 | 124.60±9.52 |
| 模型组 | 10 | 72.30±4.30* | 219.90±12.69* |
| 丹参多糖高剂量组 | 10 | 61.10±4.43# | 192.50±10.86# |
| 丹参多糖中剂量组 | 10 | 56.20±4.31# | 168.90±8.69# |
| 丹参多糖低剂量组 | 10 | 50.70±5.31# | 162.60±10.21# |
| 复方鳖甲软肝片组 | 10 | 51.70±8.30# | 167.60±17.79# |
| 联苯双酯组 | 10 | 45.70±5.07# | 132.50±12.02# |
#P＜0.01与模型组比较，*P＜0.01与正常组比较
表7丹参多糖对免疫性肝损伤C57小鼠NO、TNF-α
的影响
| 组别 | 动物数 | NO(μmol/L) | TNF-α(pg/ml) |
| 正常组 | 10 | 44.30±7.34 | 245.20±76.79 |
| 模型组 | 10 | 136.20±9.96* | 674.52±155.81* |
| 丹参多糖高剂量组 | 10 | 100.97±9.32# | 345.55±87.11# |
| 丹参多糖中剂量组 | 10 | 98.36±9.12# | 368.14±80.95# |
| 丹参多糖低剂量组 | 10 | 82.46±9.23# | 555.84±66.07# |
| 联苯双酯组 | 10 | 71.24±9.48# | 288.35±115.99# |
| 复方鳖甲软肝片组 | 10 | 83.89±11.09# | 357.53±96.26# |
#P＜0.01与模型组比较，*P＜0.01与正常组比较
表8丹参多糖对免疫性肝损伤C57小鼠脏器系数
的影响
| 组别 | 动物数 | 肝脏系数 | 脾脏系数 | 胸腺系数 |
| 正常组 | 10 | 461.09±32.68 | 44.14±9.66 | 32.88±7.67 |
| 模型组 | 10 | 663.90±54.87* | 89.85±10.80* | 16.72±4.82* |
| 丹参多糖高剂量组 | 10 | 574.80±61.46## | 65.29±10.68## | 25.42±4.45# |
| 丹参多糖中剂量组 | 10 | 565.81±59.80# | 76.70±6.90# | 25.60±7.24# |
| 丹参多糖低剂量组 | 10 | 622.08±59.90# | 69.05±9.90## | 29.25±4.78## |
| 联苯双酯组 | 10 | 533.69±52.20## | 58.86±10.23## | 25.83±6.78# |
| 复方鳖甲软肝片组 | 10 | 560.11±28.42## | 76.88±7.01# | 25.92±6.61# |
#P＜0.05与模型组比较，##P＜0.01与模型组比较，*P＜0.01与正常组比较
(二)NIH小鼠免疫性肝损伤模型
1.实验材料
(1)动物：NIH小鼠，体重18～22g，70只，雌雄各半(南方医科大学实验动物中心提供)，实验期间的颗粒饲料由南方医科大学实验动物中心提供。
实验环境：动物房保持通风、干燥、室温22-25℃，湿度50-70％，自由饮水、鼠料定量饲养。
(2)试剂与仪器：
试剂：脂多糖，购于sigma公司、卡介苗冻干粉，购于中国药品生物制品检定所、ALT试剂盒购于南京建成生物工程研究所，批号：20061016、AST试剂盒购于南京建成生物工程研究所，批号：20061016、N0试剂盒购于南京建成生物工程研究所，批号：20061205、IL-1β试剂盒购于RD公司批号：EIA05935、丹参多糖由实施例20方法制备，用时蒸馏水溶解稀释、复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司)批准文号：国药准字：Z19991011、联苯双酯滴丸(广州星群药业股份有限公司)批准文号：国药准字：H44023176。
主要仪器：721B型分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)、酶标仪(sigma公司)、DK-8AD型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)、离心机(Thermo)
2.方法与结果
(1)实验方法：
采用卡介苗(BCG)加脂多糖(LPS)诱导小鼠免疫性肝损伤。小鼠尾静脉注射BCG浆液0.2ml/只(含菌量2.5×106单位)，致敏后10d，尾静脉注射LPS0.2ml/只(8.5μg)以诱导肝损伤，正常组小鼠尾静脉注射同等剂量生理盐水。将实验动物随机分为7组：正常组、模型组、丹参多糖高、中、低剂量组、联苯双酯组、复方鳖甲软肝片组，每组10只。造模同时开始按既定方案灌胃直到动物处死前一天，正常组给予同等剂量生理盐水。造模结束后小鼠禁食12h左右，称重后采血，脱椎处死取肝脏、脾脏、胸腺称重计算脏器系数，肝左叶标本常规固定包埋切片HE染色，剩余肝脏超低温冰箱冻存以做肝组织匀浆。血液3000转10分钟离心取血清超低温冰箱冻存以备下一步检测所需。
指标测定：(1)光镜标本：石蜡包埋，常规切片，HE染色。(2)ALT、AST、NO用小鼠血清(1∶2稀释)按试剂盒说明检测。(3)冻存肝脏化冻后生理盐水洗去浮血，用生理盐水配成10％肝组织匀浆，3500转10分钟离心取上清液，10倍稀释。ELISA法按试剂盒说明检测IL-1β。
(2)统计处理方法：上述各项指标均计算均数
与标准差(S)，用统计软件SPSS11.0进行方差分析。
(3)结果：
①肝功(血清中ALT、AST)的变化及比较
由表9可见，模型组明显高于正常组(P＜0.01)，说明模型建立成功。丹参多糖高、中、低剂量组与模型组比较可显著降血清中的ALT和AST含量(P＜0.01)，以丹参多糖中剂量组效果较为明显。
②NO、IL-1β的变化及比较
由表10可见，模型组明显高于正常组(P＜0.01)，说明模型建立成功。丹参多糖高、中、低剂量组与模型组比较可显著降血清中的N0及组织中IL-1β含量(P＜0.01)，以丹参多糖低剂量组效果较为明显。
③脏器系数的变化及比较
由表11可见，模型组肝脏、脾脏系数明显高于正常组(P＜0.01)，胸腺系数明显低于正常组(P＜0.01)，说明模型建立成功。丹参多糖高、中、低剂量组与模型组比较可显著改变肝脏、脾脏、胸腺系数(P＜0.05)。
④肝组织病理变化
模型组肝细胞损害，伴炎性细胞浸润和局灶性肝细胞坏死，甚至汇管区和肝小叶内广泛炎性细胞浸润，伴广泛的肝细胞坏死。正常组肝细胞、汇管区、胆管区未见异常，说明模型建立成功。丹参多糖高、中、低剂量组与正常组比较有不同程度肝细胞肿大、炎症细胞浸润等肝损伤病变，但与模型组比较损伤程度明显减轻。
综上所述，丹参多糖高、中、低剂量组对BCG加LPS诱导的小鼠免疫性肝损伤均有明显保护作用。
表9丹参多糖对免疫性肝损伤NIH小鼠肝功能
的影响
| 组别 | 动物数 | ALT(U/L) | AST(U/L) |
| 正常组 | 10 | 19.90±7.02 | 67.80±19.26 |
| 模型组 | 10 | 47.90±22.21* | 105.10±34.97* |
| 丹参多糖高剂量组 | 10 | 28.70±7.90## | 76.60±11.51## |
| 丹参多糖中剂量组 | 10 | 25.70±9.76## | 75.10±18.37## |
| 丹参多糖低剂量组 | 10 | 27.90±10.28## | 72.40±17.10## |
| 复方鳖甲软肝片组 | 10 | 27.83±11.93## | 86.50±26.13# |
| 联苯双酯组 | 10 | 22.30±11.54## | 66.5±18.76## |
#P＜0.05，##P＜0.01与模型组比较，*P＜0.01与正常组比较
表10丹参多糖对免疫性肝损伤NIH小鼠NO、IL-1β
的影响
| 组别 | 动物数 | NO(μmol/L) | IL-1β(pg/ml) |
| 正常组 | 10 | 27.53±5.91 | 43.69±12.77 |
| 模型组 | 10 | 99.67±10.79* | 176.32±67.81* |
| 丹参多糖高剂量组 | 10 | 68.90±8.03# | 52.78±14.51# |
| 丹参多糖中剂量组 | 10 | 55.84±8.38# | 67.77±35.15# |
| 丹参多糖低剂量组 | 10 | 47.63±7.88# | 46.63±14.88# |
| 联苯双酯组 | 10 | 36.51±8.15# | 44.35±14.99# |
| 复方鳖甲软肝片组 | 10 | 48.69±6.81# | 56.27±21.71# |
#P＜0.01与模型组比较，*P＜0.01与正常组比较
表11丹参多糖对免疫性肝损伤NIH小鼠脏器系数
的影响
| 组别 | 动物数 | 肝脏系数 | 脾脏系数 | 胸腺系数 |
| 正常组 | 10 | 443.69±42.84 | 44.97±11.39 | 28.97±6.80 |
| 模型组 | 10 | 699.70±51.82* | 89.58±9.63* | 15.99±5.78* |
| 丹参多糖高剂量组 | 10 | 561.41±47.72## | 75.88±19.27## | 27.89±11.39# |
| 丹参多糖中剂量组 | 10 | 657.63±38.00# | 77.90.±10.99# | 27.50±9.92# |
| 丹参多糖低剂量组 | 10 | 654.40±48.83# | 75.50±11.91## | 28.66±16.00# |
| 联苯双酯组 | 10 | 508.43±72.36## | 64.57±6.93## | 27.76±4.69# |
| 复方鳖甲软肝片组 | 10 | 615.60±38.06## | 78.48±6.87# | 27.44±5.49# |
#P＜0.05与模型组比较，##P＜0.01与模型组比较，*P＜0.01与正常组比较
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明方法的效果。
实施例1
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为10μm的微粉，加入8升纯乙醇，回流提取1小时，过滤收集滤渣。加入10倍水，加入纤维素酶15克，用氢氧化钠调pH值到5.5，与滤渣混匀，60℃保温60分钟，超声处理60分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为90％，放置过夜，将沉淀60℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品71g。
实施例2
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为100μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入纤维素酶5克，用氢氧化钠调pH值到4.0，与滤渣混匀，80℃保温30分钟，超声处理90分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品70g。
实施例3
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为50μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入纤维素酶10克，用氢氧化钠调pH值到6.0，与滤渣混匀，40℃保温90分钟，超声处理30分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品54g。
实施例4
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为50μm的微粉，粉碎至粒径为50μm的微粉，加入10升乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入果胶酶10克，用氢氧化钠调pH值到4.5，与滤渣混匀，60℃保温60分钟，超声处理60分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品63g。
实施例5
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为80μm的微粉，加入10升95％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入果胶酶5克，用氢氧化钠调pH值到4.0，与滤渣混匀，40℃保温80分钟，超声处理30分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品71g。
实施例6
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为40μm的微粉，加入10升95％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入果胶酶1.5克，用氢氧化钠调pH值到6.0，与滤渣混匀，50℃保温40分钟，超声处理90分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品55g。
实施例7
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为10μm的微粉，加入12升90％乙醇，回流提取3小时，过滤收集滤渣。加入15倍水，加入木瓜蛋白酶10克，用氢氧化钠调pH值到4.5，与滤渣混匀，60℃保温60分钟，超声处理60分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为90％，放置过夜，将沉淀80℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品72g。
实施例8
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为100μm的微粉，加入10升95％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶5克，用氢氧化钠调pH值到4.0，与滤渣混匀，40℃保温80分钟，超声处理30分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品66g。
实施例9
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为20μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶1.5克，用氢氧化钾调pH值到6.0，与滤渣混匀，50℃保温40分钟，超声处理90分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品73g。
实施例10
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为100μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入纤维素酶15克，果胶酶10克，用氢氧化钾调pH值到5.5，与滤渣混匀，60℃保温60分钟，超声处理60分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品80g。
实施例11
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为30μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入纤维素酶15克，果胶酶15克，用氢氧化钾调pH值到4.0，与滤渣混匀，60℃保温60分钟，超声处理90分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品78g。
实施例12
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为20μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入纤维素酶10克，果胶酶15克，用氢氧化钾调pH值到6.0，与滤渣混匀，60℃保温60分钟，超声处理30分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品89g。
实施例13
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为10μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶15克，果胶酶15克，用氢氧化钾调pH值到5.5，与滤渣混匀，60℃保温60分钟，超声处理60分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品69g。
实施例14
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为50μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶15克，果胶酶10克，用氢氧化钾调pH值到4.0，与滤渣混匀，80℃保温30分钟，超声处理90分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品73g。
实施例15
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为50μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶10克，果胶酶15克，用三乙醇胺调pH值到6.0，与滤渣混匀，40℃保温90分钟，超声处理30分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品74g。
实施例16
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为10μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶15克，纤维素酶15克，用三乙醇胺调pH值到5.5，与滤渣混匀，60℃保温60分钟，超声处理60分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品108g。
实施例17
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为20μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶15克，纤维素酶10克，用三乙醇胺调pH值到4.0，与滤渣混匀，80℃保温30分钟，超声处理90分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品87g。
实施例18
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为30μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶10克，纤维素酶15克，用三乙醇胺调pH值到6.0，与滤渣混匀，40℃保温90分钟，超声处理30分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品87g。
实施例19
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为30μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶15克，纤维素酶15克，果胶酶15克，用三乙醇胺调pH值到5.5，与滤渣混匀，60℃保温60分钟，超声处理60分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品84g。
实施例20
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为10μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶15克，纤维素酶10克，果胶酶10克，用三乙醇胺调pH值到4.0，与滤渣混匀，80℃保温30分钟，超声处理90分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品102g。
实施例21
将丹参粗粉1Kg，粉碎至粒径为10μm的微粉，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶10克，纤维素酶15克，果胶酶15克，用三乙醇胺调pH值到6.0，与滤渣混匀，40℃保温90分钟，超声处理30分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品99g。
实施例22(比较例)
将丹参粗粉1Kg，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，用三乙醇胺调pH值到6.0，与滤渣混匀，40℃保温90分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品35g。
实施例23(比较例)
将丹参粗粉1Kg，加入10升90％乙醇，回流提取2小时，过滤收集滤渣。加入12倍水，用三乙醇胺调pH值到6.0，与滤渣混匀，40℃保温90分钟，超声处理30分钟，过滤，滤液为多糖提取液，提取液浓缩后加乙醇调节醇浓度为85％，放置过夜，将沉淀70℃真空干燥，粉碎得丹参多糖粗品42g。
Claims (5)
1.一种从丹参中提取多糖的方法，该方法由以下步骤组成：
(1)粉碎：将丹参粉碎至粒径为10～100μm的微粉；
(2)脱脂：将丹参微粉用8～12倍体积的浓度大于或等于90％的乙醇回流1～3小时，过滤，取滤渣挥干溶剂后备用；
(3)酶处理：将脱脂处理后的丹参微粉加到10～15倍体积的水中，再加入酶，然后用碱将pH值调节至4～6，在40～80℃下保温0.5～1.5小时；所述的酶是纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶中的一种，用量为丹参重量的0.5％～1.5％，或者是纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶中的两种以上，每种酶的用量为丹参重量的0.5％～1.5％；
(4)超声提取：在频率为59kHz的超声波下处理0.5～1.5小时，过滤，收集滤液；
(5)醇沉：加入乙醇使其在滤液中的浓度至80～90％，沉淀出丹参多糖，60～80℃真空干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于酶是纤维素酶和木瓜蛋白酶，每一种酶的用量均为丹参重量的1.5％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶处理步骤是将脱脂处理后的丹参微粉浸泡于10～15倍体积的酶溶液在pH5.5、60℃下水解60分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的超声提取的时间为60分钟。
5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于步骤(3)所述的碱是氢氧化钠、氢氧化钾或三乙醇胺。
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2008
- 2008-02-02 CN CNA2008100262494A patent/CN101225422A/zh active Pending
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Open date: 20080723 |