CN102977221A - 一种薏仁多糖的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种薏仁多糖的制备方法，步骤如下：先将薏仁粉碎、过筛后，经脱脂、水浴提取、离心、酶解、浓缩、醇沉、真空冷冻干燥沉淀得薏仁粗多糖；再将制得的薏仁粗多糖溶解得薏仁粗多糖溶液，经过脱蛋白、脱色、透析和离子交换柱层析得薏仁纯化多糖，再经过真空冷冻干燥得白色粉末，即为薏仁多糖。本发明制备方法是通过水提醇沉法提取得到薏仁粗多糖，再经过脱蛋白，脱色，透析和离子交换柱层析得薏仁纯化多糖，再经过真空冷冻干燥得白色粉末薏仁多糖，制备方法方法简单，薏仁多糖的利率高。
Description
技术领域
本发明属于营养与免疫领域，涉及多糖的提取，尤其是一种薏仁多糖的制备方法与应用。
背景技术
薏米（Coix）别名薏苡仁、米仁、薏珠子、菩提子、芑实、解蠡等，广泛地种植于亚洲、非洲和地中海周边的温暖地区。喜生于湿润地区，但能耐涝耐旱。薏米的干燥成熟种仁叫做薏仁，薏仁质坚实，断面白色，粉性，气微，味微甜，薏仁通过烘烤或加工成薏米粉食用。薏米的种仁能入药治病。李时珍在《本草纲目》中记载：薏仁能“健脾益胃，补肺清热，去风渗湿。炊饭食，治冷气。煎饮，利小便热淋。”它含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物和多种氨基酸、维生素、无机盐，其中主要的功能性成分是脂肪和糖类。在传统的中药中作为一种利尿剂、抗炎药物、抗癌药物、镇痛剂和一种营养物。研究表明薏仁中含有大量脂肪酸包括棕榈酸、硬脂酸、十八碳二烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等，其中含有的寡聚糖具有DPPH自由基清除能力和脂质抗氧化能力。薏仁组份已被证实具有降血糖，提高免疫力等作用。
多糖是一类天然大分子化合物，由10个以上单糖基通过苷键连接而成。通常多糖由几百个或几千个单糖聚合而成，是多分散分子，没有明确的分子量，只能有一个平均分子量，其性质已完全不同于单糖，多糖具有明显的种属特异性，结构规则庞大，有宏观（颗粒大小）不均一性，是一类高分子多聚物，具有复杂的生物活性和功能，其中部分多糖具有抗肿瘤机制表现在多糖能够直接抑制肿瘤细胞生长；多糖抑制肿瘤细胞的蛋白质和核酸合成；多糖诱导肿瘤细胞凋亡。
通过检索，未发现与本专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本应用的目的在于克服现有技术的不足，提供一种原料来源广泛、价格低廉、方法简单的薏仁多糖的制备方法，同时也提供了由该制备方法制备得到的薏仁多糖的应用。
本发明实现目的的技术方案是：
一种薏仁多糖的制备方法，其特征在于：步骤如下：
⑴薏仁粗多糖的提取：
将薏仁粉碎、过筛后，分别用乙酸乙酯和石油醚脱脂后，按料液比g：g为1:20-30加入蒸馏水中并调节pH到5.2，85-95℃水浴提取3-5h；提取后趁热，取上清液冷却，酶解去淀粉，然后在3,000r/min下离心9-11min，得上清液；上清液浓缩后，加入2-4倍浓缩液体积的95%冰乙醇沉淀过夜，得沉淀，沉淀经真空冷冻干燥，得薏仁粗多糖；
⑵薏仁粗多糖的纯化：将步骤⑴中制得的薏仁粗多糖加水溶解，得薏仁粗多糖溶液，经过脱蛋白、脱色、透析和离子交换柱层析得薏仁纯化多糖，再经过真空冷冻干燥得白色粉末，即为薏仁多糖。
而且，所述步骤⑴中酶解去淀粉的具体步骤如下：
按酶：上清液的比例为20IU/g加淀粉酶到上清液中，水浴温度60℃、pH7.0去淀粉直到碘检不变色；然后按酶：上清液的比例为18IU/g加糖化酶，在水浴温度50℃~60℃，pH6.5条件下处理0.5-1.5h；100℃水浴条件下灭酶8-11min。
而且，所述步骤⑵中脱蛋白的具体步骤如下：
向薏仁粗多糖溶液中加入1/3粗多糖溶液体积的Sevage试剂，剧烈震荡30min，3,000r/min离心15min，除去变形蛋白沉淀，水相重复上述操作至没有变性蛋白沉淀产生。
而且，所述步骤⑵中脱色的具体步骤如下：
使用浓氨水调节脱蛋白后的薏仁粗多糖溶液pH至pH8.0，再滴加质量百分数30%H2O2至浅黄色，于50℃水浴保温2h。
而且，所述步骤⑵中的透析的条件为：用截留相对分子质量为8,000-14,000的透析袋流水透析2d。
而且，所述步骤⑵中的离子交换柱材料为DEAE-52纤维素柱材料。
如上所述的薏仁多糖的制备方法所制备得到的薏仁多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
如上所述的薏仁多糖的制备方法所制备得到的薏仁多糖在制备诱导细胞凋亡药物中的应用。
而且，所述薏仁多糖的作用浓度为300μg/mL。
本发明的优点和有益效果为：
1、本发明制备方法是通过水提醇沉法提取得到薏仁粗多糖，再经过脱蛋白，脱色，透析和离子交换柱层析得薏仁纯化多糖，再经过真空冷冻干燥得白色粉末薏仁多糖，制备方法方法简单，薏仁多糖的利率高。
2、本发明制备方法使用的薏仁，价格低廉、来源广泛，不仅扩大了薏仁的使用范围、为以后薏仁的研究提供了依据，提高了农副产品的应用价值，而且对研究多糖类物质抗肿瘤具有积极的意义。
3、本发明制备方法制备得到的薏仁多糖处理人非小细胞肺癌细胞A549细胞实验表明薏仁多糖能够A549细胞产生凋亡小体，造成S期阻滞，通过Annexin V-FITC和PI染色发现薏仁多糖造成A549细胞凋亡率显著上升，通过单细胞凝胶电泳实验发现处理后的A549产生典型的凋亡型彗星图案，同时薏仁多糖使细胞内的caspase-3、caspase-9基因和相应蛋白的相对表达量上调，从而表明薏仁多糖能够诱导人非小细胞肺癌细胞A549细胞凋亡。因此，制备得到的薏仁多糖可以应用于制备抗肿瘤药物中，同时，也可以应用于制备诱导细胞凋亡药物中。
附图说明
图1为本发明电子扫描显微镜观察细胞形态图，其中，图1-1为正常细胞，图1-2为处理后细胞；
图2为本发明流式细胞仪检测细胞周期图；其中，图2-1为正常细胞，图2-1为处理后细胞；
图3为本发明Annexin V-FITC检测细胞凋亡率图；其中，图3-1为正常细胞，图3-2为处理后细胞；
图4为本发明激光共聚焦显微镜检测彗星实验图；其中，图4-1为正常细胞，图4-2为处理后细胞；
图5为本发明RP-PCR检测caspase-3和caspase-9基因的相对表达量图；
图6为本发明Western blotting检测caspase-3和caspase-9蛋白的相对表达量图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明的主要思想为：以薏仁为原料，通过水提醇沉法提取薏仁粗多糖，再经过纯化得到薏仁多糖，将所得到的薏仁多糖作用于非小细胞肺癌细胞A549细胞，观察薏仁多糖诱导A549细胞凋亡作用。
本发明利用薏仁多糖处理人非小细胞肺癌细胞A549细胞实验表明薏仁多糖能够A549细胞产生凋亡小体，造成S期阻滞，通过Annexin V-FITC和PI染色发现薏仁多糖造成A549细胞凋亡率显著上升，通过单细胞凝胶电泳实验发现处理后的A549产生典型的凋亡型彗星图案，同时薏仁多糖使细胞内的caspase-3、caspase-9基因和相应蛋白的相对表达量上调，从而表明薏仁多糖能够诱导人非小细胞肺癌细胞A549细胞凋亡。
一、一种薏仁多糖的制备方法，步骤如下：
1、薏仁粗多糖提取
（1）挑选籽粒饱满、色泽洁白、无虫蛀、无霉斑的薏仁置于超微粉碎机中，粉碎过40目筛；
（2）使用乙酸乙酯（料液比为1:10，g:g）在80℃条件下采用索氏提取法脱脂8h和石油醚（料液比为1:10，g:g）在70℃条件下采用索氏提取法脱脂6h，置于三角瓶中，将脱脂后的薏仁粉末按料液比为1:20-30（g:g）加入蒸馏水中并用盐酸调节pH到5.2，于水浴锅中90℃提取4h；
（3）酶解：提取后趁热离心，取上清液冷却，按20IU/g加淀粉酶到提取液中水浴温度60℃，pH 7.0去淀粉直到碘液检测不变色；接着按18IU/g加糖化酶，水浴温度50~60℃，pH 6.5处理1h，得酶解液；
（4）将酶解液于100℃水浴条件下灭酶10min，然后在3000r/min下离心10min，得上清液，上清液用旋转蒸发仪60-70℃浓缩后，再加入3倍浓缩液体积的95%冰乙醇，醇沉过夜，3000r/min离心15min后得沉淀，经真空冷冻干燥，得薏仁粗多糖。
2、薏仁多糖纯化
（1）脱蛋白：将得到的薏仁粗多糖粉末溶解在蒸馏水中，加入1/3体积的Sevage试剂（氯仿:正丁醇的体积比为4:1），剧烈震荡30min，3000r/min离心15min，用分液漏斗出去有机相与水相之间的变形蛋白沉淀，水相重复上述操作，至没有变形蛋白沉淀产生。将水相浓缩后，用3倍体积95%冰乙醇醇沉，离心，蒸馏水溶解。
（2）脱色：薏仁多糖水溶液以浓氨水调至pH 8.0滴加30%H2O2至浅黄色，于50℃水浴保温2h。
（3）透析：用截留相对分子质量为8000～14000的透析袋流水透析2d。透析后将薏仁多糖浓缩，真空冷冻干燥。
（4）离子交换柱层析：DEAE-52纤维素柱材料在蒸馏水中充分溶涨，用蒸馏水漂洗3次，0.5mol/LNaOH溶液浸泡1h，蒸馏水洗至中性，0.5mol/L HCl溶液浸泡1h，蒸馏水洗至中性，0.5mol/LNaOH溶液浸泡1h，蒸馏水洗至中性。装柱用蒸馏水平衡过夜，加样5mL以0.1mol/L NaCl溶液洗脱液洗脱（恒流泵流速：1.8-2.1r/min，5ml/管）。用苯酚-硫酸法检测多糖含量。将含有多糖的部分合并，上清液用旋转蒸发仪60-70℃浓缩，得到白色粉末即为薏仁多糖。
二、薏仁多糖诱导非小细胞肺癌细胞A549细胞凋亡作用
（1）将载玻片置于六孔板中，取200μL浓度为106个/mL对数期A549细胞接种于载玻片上，细胞贴壁后滴加1mL浓度为300μg/mL的薏仁多糖处理48h后，用PBS缓冲液漂洗。按一定方向轻轻摇动。清洗2次，每次5min。细胞清洗干净后，吸除PBS，加入2.5%的戊二醛（pH为7.2-7.4）固定液，置于4℃冰箱内固定1h。固定后用PBS再次清洗样品，浓度依次为30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇梯度脱水去除样品中水分，每次脱水时间5min。将样品进行自然干燥1.5h。15min，PBS洗三次，电子扫描显微镜观察下，A549细胞产生凋亡小体，结果见图1。
（2）取对数生长期的A549细胞，以4×105个/mL密度接种于六孔细胞培养板上。培养过夜后，300μg/mL的薏仁多糖处理，培养48h。胰酶消化，制成细胞悬液，800r/min离心6min，去上清，加1mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清。用300μL的PBS重悬细胞，将细胞逐滴加入700μL预冷的无水乙醇中，乙醇终浓度为70%，4℃避光固定过夜。800r/min离心10min，去上清，PBS清洗两次，重悬细胞于500μL含100U/ml RNaseA Inhibitor的PBS缓冲液中，避光37℃孵育30min，加2mg/mL PI至终浓度50μg/mL，避光孵育30min，过400目筛。
在流式细胞仪上计数细胞周期各期的细胞数目，结果发现薏仁多糖诱导A549细胞产生S期阻滞，结果见图2。
（3）A549细胞药物处理72h，把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。加入收集的细胞培养液，混匀，转移到离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重。取5-10万重悬的细胞，1000g离心5min，弃上清，加入195μL AnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温（20-25℃）避光孵育10min。可以使用铝箔进行避光。1000r/min离心5min，弃上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴，避光放置。
随即进行流式细胞仪检测，结果见图3。A549细胞凋亡率为17.05%
（4）分离制备单细胞悬液，将载玻片的磨砂面向上，40℃预热，将预热45℃的100μL的0.5%正常熔点琼脂糖（NMA）铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，再置4℃下10min使NMA凝固。将10μL细胞（约104个）和75μL的0.7%低溶点琼脂糖（LMA）（在37℃下水浴加热至少20min使之完全溶化）混合均匀。轻轻揭去盖玻片，迅速将含细胞的LMA滴到第1层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置4℃10min使第2层LMA凝固。第2层LMA凝固后，室温下移去盖玻片，滴加预热37℃的75μL的0.7%低溶点琼脂糖LMA，如上盖上盖玻片4℃下凝固。移去盖玻片，将玻片置于平皿中，倒入预冷的细胞裂解液，4℃裂解1~2h，取出载玻片用PBS漂洗。将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲，约覆过载玻片胶面0.25cm左右，室温放置20~60min。在电压25V，电泳20~30min。电泳后将载玻片置于平皿内。加入0.4mmol/L Tris-HCl（pH7.5）缓冲液，将载玻片没入，4℃中和三次，每次10min，弃去Tris-HCl缓冲液。每个载玻片加20μL的PI染液，盖上盖玻片，避光染色10min。激光共聚焦显微镜543nm波长的激发光观察。
观察结果：能够观察到典型的细胞凋亡型彗星图案，结果见图4。
（5）按总RNA提取试剂盒说明书抽提，参照Fermentas试剂盒说明书对总RNA进行反转录，向逆转录后的cDNA添加PCR反应体系按下列条件进行PCR。
PCR反应体系为：
PCR循环条件：93℃预变性3min后，进行35个循环（94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s），72℃延伸10min。
PCR结束后取5uL扩增产物溶液加入含0.05‰Goldview的2%琼脂糖凝胶中，并加Marker作参照。在1×TAE缓冲液中100V恒压电泳30min。caspase-3、caspase-9和β-actin引物序列见表1。
分析结果表明：使用300μg/mL薏仁多糖处理A549细胞增加了caspase-3和caspase-9基因的相对表达量，表达结果见图5。
表1引物序列表
（6）使用免疫印迹实验（Western blotting）测定薏仁多糖处理A549细胞后caspase-3和caspase-9蛋白的相对表达量。分析结果表明薏仁多糖处理增加了caspase-3和caspase-9两种蛋白的相对表达量，结果见图6。
薏仁多糖能够使A549细胞产生凋亡小体，造成S期阻滞，通过Annexin V-FITC和PI染色发现薏仁多糖造成A549细胞凋亡率显著上升，通过单细胞凝胶电泳实验发现处理后的A549产生典型的凋亡型彗星图案，同时薏仁多糖使细胞内的caspase-3、caspase-9基因和相应蛋白的相对表达量上调，从而表明薏仁多糖能够诱导人非小细胞肺癌细胞A549细胞凋亡。
因此，由上述薏仁多糖的制备方法所制备得到的薏仁多糖可以应用在制备抗肿瘤药物中及制备诱导细胞凋亡药物中。
Claims (9)
1.一种薏仁多糖的制备方法，其特征在于：步骤如下：
⑴薏仁粗多糖的提取：
将薏仁粉碎、过筛后，分别用乙酸乙酯和石油醚脱脂后，按料液比g：g为1:20-30加入蒸馏水中并调节pH到5.2，85-95℃水浴提取3-5h；提取后趁热，取上清液冷却，酶解去淀粉，然后在3,000r/min下离心9-11min，得上清液；上清液浓缩后，加入2-4倍浓缩液体积的95%冰乙醇沉淀过夜，得沉淀，沉淀经真空冷冻干燥，得薏仁粗多糖；
⑵薏仁粗多糖的纯化：将步骤⑴中制得的薏仁粗多糖加水溶解，得薏仁粗多糖溶液，经过脱蛋白、脱色、透析和离子交换柱层析得薏仁纯化多糖，再经过真空冷冻干燥得白色粉末，即为薏仁多糖。
2.根据权利要求1所述的薏仁多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴中酶解去淀粉的具体步骤如下：
按酶：上清液的比例为20IU/g加淀粉酶到上清液中，水浴温度60℃、pH7.0去淀粉直到碘检不变色；然后按酶：上清液的比例为18IU/g加糖化酶，在水浴温度50℃~60℃，pH6.5条件下处理0.5-1.5h；100℃水浴条件下灭酶8-11min。
3.根据权利要求1所述的薏仁多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中脱蛋白的具体步骤如下：
向薏仁粗多糖溶液中加入1/3粗多糖溶液体积的Sevage试剂，剧烈震荡30min，3,000r/min离心15min，除去变形蛋白沉淀，水相重复上述操作至没有变性蛋白沉淀产生。
4.根据权利要求1所述的薏仁多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中脱色的具体步骤如下：
使用浓氨水调节脱蛋白后的薏仁粗多糖溶液pH至pH8.0，再滴加质量百分数30%H2O2至浅黄色，于50℃水浴保温2h。
5.根据权利要求1所述的薏仁多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中的透析的条件为：用截留相对分子质量为8,000-14,000的透析袋流水透析2d。
6.根据权利要求1所述的薏仁多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中的离子交换柱材料为DEAE-52纤维素柱材料。
7.一种如权利要求1至6任一项所述的薏仁多糖的制备方法所制备得到的薏仁多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.一种如权利要求1至6任一项所述的薏仁多糖的制备方法所制备得到的薏仁多糖在制备诱导细胞凋亡药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的薏仁多糖在制备诱导细胞凋亡药物中的应用，其特征在于：所述薏仁多糖的作用浓度为300μg/mL。
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