CN103694367A - 一种具有抗氧化活性文蛤多糖的提取及应用方法 - Google Patents
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Abstract
一种文蛤多糖的分离纯化方法,涉及生物分离纯化技术领域。本发明主要采用文蛤软体匀浆,加酶辅助热水浸提,悬蒸浓缩,乙醇沉淀获得文蛤多糖粗品,然后sevage法脱蛋白,再采用DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析、Superdex200凝胶过滤柱层析对文蛤多糖逐级分离纯化,纯化获得的文蛤多糖为两种单一多糖,纯度达90%以上。使获得的文蛤多糖精品能用于药品、化工、保健营养品及化妆品的原料或添加剂。也为文蛤多糖的进一步研究提供了基础。
Description
技术领域
本发明属海洋生物技术领域,提供了一种具有抗氧化活性文蛤多糖的酶法提取和分离纯化方法,所形成的文蛤多糖可用于抗氧化功能的保健品的制备。
背景技术
文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)属软体动物门、双壳纲、真瓣鳃目、帘蛤科、文蛤属,是我国滩涂传统养殖的主要贝类之一。文蛤多糖主要存在于文蛤内脏中,目前尚未被广泛研究和应用。现代科学研究表明,文蛤多糖具有清热利湿、化痰、散结、抗肿瘤的功效,而且还能够发挥降糖、降血脂,抗突变、抗衰老等多种生理功能。在降糖功能方面,有研究认为,文蛤多糖能够增加胰岛素的敏感性并改善胰岛素抵抗,促进外周组织对葡萄糖的利用, 提高机体对胰岛素的敏感性 [文蛤多糖对小鼠调节血糖和抗应激功能的影响.中国现代应用药学杂志, 2007, 24( 2)]。而在抑制癌细胞方面,文蛤糖肽MGP0501对体外培养的人肺癌细胞株(A549)、卵巢癌细胞株(HO8910)、宫颈癌细胞株(Hela)、鼻咽癌细胞株(KB)、肝癌细胞株(SMMC-7721)生长均有很强的抑制作用[抗肿瘤文蛤糖肽(MGP0405)的分离纯化及性质研究.中国天然药物, 2006,4(3)]。
自20世纪60年代起,从海洋中寻找天然活性物质成为研究热点。本发明以文蛤作为研究对象,开展了文蛤多糖的提取和分离研究,为系统开展文蛤多糖的活性研究奠定基础。
根据相关研究,文蛤中粗多糖含量一般在5~8%,但受品种、产地、大小、季节以及原料的新鲜程度影响,其多糖含量相差较大。文蛤多糖一般采取水提法,利用超声波辅助可以提高收率,减少提取时间,尹华等对此进行了研究,先将文蛤软体破碎后,加入1:20的水,然后超声波提取2次,每次30分钟,其多糖得率在1.0~4.7%[文蛤提取物中多糖的含量测定.中国海洋药物杂志,2006,25(1) ]。由于文蛤多糖与在组织中与蛋白、脂肪等成分紧密结合,仅仅依靠物理方法进行提取还不能够充分使多糖溶出,而且提取的多糖纯度低,含有大分子蛋白质等杂质,使后续分离较为困难。基于上述原因,本发明提出了文蛤多糖的酶法提取工艺,旨在利用蛋白酶的水解作用使与多糖紧密结合的蛋白分开,形成较低分子量的肽类,避免在后续醇沉操作中与多糖共沉淀。
文蛤多糖具有复杂的的生物活性与功能, 但对其抗氧化作用尚没有进行深入研究。机体在生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种活性氧自由基 ( ROS ) ,在正常情况下, 机体内的处于动态平衡中,但是一旦该平衡被打破,就会对机体造成损害,从而引发一系列相关疾病,目前研究认为,ROS易损伤组织,引起各种疾病,包括肿瘤、衰老、心脑系统损伤,与神经系统及糖尿病并发症等很多疾病的发生有密切的关系。外源性补充抗氧化物质,能够部分消除体内产生的ROS,起到抗衰老、提高免疫、预防疾病的效果。因而具有抗氧化作用的生物活性物质的研究日益受到关注。大量研究表明多糖具有清除多种活性氧 ( Reactive oxygen species,ROS ) 的抗氧化作用,其可能的机制在于多糖具有捕捉脂质过氧化链式反应中产生的ROS作用,减少脂质过氧化反应链的长度,阻断或减缓脂质过氧化的进程。也有研究认为,多糖分子能够促进体内抗氧化酶(如 SOD、 CAT、 GSH- Px等)的生成、释放,或直接可作用于抗氧化酶,提高体内原有抗氧化酶的活性,间接发挥抗氧化作用。
本发明在获得纯化文蛤多糖的基础上,研究发现文蛤多糖具有较强的外源抗氧化活性,这也是文蛤多糖具有降糖、提升免疫等活性的一个重要理论依据。而同时,在应用研究领域,可以利用文蛤多糖或者含有文蛤多糖的提取物、产物开发成为具有抗氧化活性的功能产品。
发明内容
本发明提供了一种文蛤多糖的提取分离方法及产品应用开发的方向。为提高文蛤多糖的提取、分离效率,本发明提出了酶法辅助提取工艺,利用蛋白酶的水解作用,分离出粗多糖,在此基础上,通过乙醇沉淀、离子交换、凝胶过滤进行文蛤多糖的纯化。纯化的文蛤多糖可用于药品、保健食品及化妆品的原料或添加剂。本发明还利用抗氧化模型,发现了文蛤多糖具有体外抗氧化活性,可作为抗氧化功能食品、药品进行开发。
本发明通过如下的技术方案实现:
1. 打浆:取新鲜的文蛤软体加3-5倍质量的去离子水,利用高速组织破碎机等均质设备进行打浆,使软体得到充分破碎。
2. 酶法提取:加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶或者中的一种或几种,加酶量0.5~2.5 %(以新鲜文蛤软体质量计),在40-60℃,或商品蛋白酶推荐的适宜水解温度下,搅拌水解2-6 h,离心取上清液。
3. 浓缩:通过超滤浓缩,使用陶瓷膜或卷式膜组件(截留分子量在5000Da-15000Da)进行截留,截留相为文蛤多糖组分,分离出的低分子组分含有大量的肽类、氨基酸等组分,可作为副产物文蛤多肽进行开发。截留液进行真空旋转蒸发浓缩,浓缩至原料液的1/8~1/15。也可以不进行膜过滤,直接进行真空旋转蒸发浓缩。
4. 醇沉:取浓缩液,加入3-5倍体积的乙醇(乙醇终浓度在85%以上),4 ℃静置4-10 h,离心收集沉淀物,用无水乙醇洗涤2-3次,挥干乙醇,得到文蛤多糖粗品。
5. 脱蛋白:将多糖粗品用适量的去离子水复溶,按体积比1:1加入sevage试剂(正丁醇:氯仿=1:4),剧烈振荡1 h,静置或离心,取上层清液,然后减压浓缩去除溶剂,再离心获得文蛤多糖溶液。
6. 离子交换柱层析:使用DEAE-52纤维素柱对上述文蛤多糖粗品进行纯化,上样后先采用去离子水平衡,再分别用0.1、0.3 mol/L NaCl洗脱2-3个柱体积,收集0.1mol/L NaCl的洗脱峰,为文蛤多糖的目标组分。对收集的组分进行减压浓缩,供进一步纯化。
7.凝胶过滤:上述组分浓缩后,采用Superdex 200凝胶过滤柱纯化,上样后用2-3倍柱体积的去离子水进行洗脱,得到两个多糖峰D21和D22组分,分别予以收集、浓缩、干燥,获得文蛤纯化多糖。
本发明工艺具有以下优点:(1)采用高压均质进行软体预处理,有利于文蛤多糖的溶出。(2)利用酶法进行辅助提取,可以显著提高多糖收率,提高粗多糖的纯度,并可以降低后续脱除蛋白的工作强度。(3)本发明在提取多糖的同时,可以回收蛤类软体中的蛋白成分,获得副产物文蛤多肽。(4)本发明工艺提供了一种相对操作简单的蛋白纯化方法,其纯化的蛋白为后续的活性评价提供了基础,也为文蛤多糖用于药品、功能食品、日化产品创造了条件。
附图说明
图1 文蛤多糖酶法提取及纯化示意图。
图2 文蛤多糖的DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析图谱。
图3 文蛤多糖的Superdex 200凝胶过滤柱层析图谱。
图4 文蛤多糖的抗氧化活性。
具体实施方式
实施例1 文蛤多糖的酶法提取
一、方案一
1. 打浆:取新鲜的文蛤软体加5倍质量的去离子水,利用高速组织破碎机等均质设备进行打浆,使软体得到充分破碎。
2. 酶法提取:加入胰蛋白酶,加酶量2.5 %,在40℃下搅拌水解5 h,离心取上清液。
3. 浓缩:将离心上清液用真空旋转蒸发的方式浓缩至原体积的1/10。
4. 醇沉:取浓缩液,加入3倍体积的无水乙醇,4 ℃静置8 h,离心收集沉淀物,用无水乙醇洗涤2次,挥干乙醇,得到文蛤多糖粗品。多糖得率为90 mg/g干重。
二、方案二
1. 打浆:取新鲜的文蛤软体加3倍质量的去离子水,利用高速组织破碎机等均质设备进行打浆,使软体得到充分破碎。
2. 酶法提取:加入木瓜蛋白酶,加酶量0.5 %,在60℃下搅拌水解2 h,离心取上清液。
3. 浓缩:将离心上清液用真空旋转蒸发的方式浓缩至原体积的1/15。
4. 醇沉:取浓缩液,加入4倍体积的95%乙醇,4 ℃静置6 h,离心收集沉淀物,用无水乙醇洗涤3次,挥干乙醇,得到文蛤多糖粗品。多糖得率为85 mg/g干重。
实施例2 柱层析分离纯化文蛤多糖
采用DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析阶段洗脱文蛤粗多糖
以0,0.1和0.3mol/L NaCl为洗脱液进行阶段洗脱,上样30 mg/mL的文蛤粗多糖溶液4 mL,流速2 mL/min,各浓度NaCl溶液各洗脱3个柱体积,收集糖含量最多的用0.1mol/L NaCl洗脱的洗脱组分D2,收集组分D2。
采用Superdex 200凝胶过滤柱层析阶段洗脱文蛤粗多糖
将收集的组分D2浓缩至浓度约15 mg/mL,以去离子水作为洗脱液,上样量0.5 mL,流速0.3 mL/min,用Superdex 200凝胶过滤柱进行进一步分离纯化,得到两个多糖峰D21和D22组分,分别经过色谱柱法检测为单一峰,为文蛤多糖纯品。
实施例3 文蛤多糖的抗氧化活性
对分离得到的文蛤多糖进行体外抗氧化活性检测,将文蛤多糖配成5、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/ml的浓度,然后利用抗氧化模型进行体外抗氧化活性检测,检测指标有DPPH清除率、超氧离子清除率、羟自由基清除率、总还原能力。
实施例4文蛤多糖抗氧化口服液的制备
对得到的文蛤多糖组分D21、D22进行酵母脱腥法脱腥,加入酵母量为2 %,发酵30 min。最终以多糖浓度1mg/ml,蜂蜜7%,柠檬酸0.15%一起121 ℃灭菌15 min得到文蛤多糖口服液。该口服液具有良好的抗氧化能力。
Claims (2)
1.一种文蛤多糖的提取方法,其特征在于该方法以文蛤软体为原料匀浆,加酶辅助热水浸提、浓缩、乙醇沉淀得到文蛤多糖粗品,再经过sevage法脱去蛋白后,依次通过阴离子交换柱和凝胶过滤柱进行分离纯化,最终得到文蛤多糖精品,其纯度达到90%以上;具体步骤为:
①加酶辅助水浸提:将文蛤软体匀浆,加5倍质量的去离子水混合,加入胰蛋白酶,加酶量为底物质量的2%,50-55 ℃浸提4-5 h,离心分离取上清;
②浓缩、醇沉:将上清液浓缩至原来的1/10,加入3倍体积的无水乙醇,4 ℃静置过夜,离心收集沉淀物,用无水乙醇洗涤,挥干乙醇;
③Sevage法脱蛋白,冻干:将上述(2)中得到的多糖粗品用水复溶,按体积比1:1加入sevage试剂,振荡1 h,用分液漏斗静置去除上层有机试剂及中间固体,然后旋转蒸发去除残余有机试剂,冻干得文蛤多糖粗品;
④阴离子交换柱纯化:将文蛤多糖粗品溶于水,过0.22 μm滤膜,然后用DEAE-52纤维素柱对文蛤多糖粗品进行纯化,采用去离子水进行平衡,分别用0、0.1、0.3mol/L NaCl进行阶段洗脱,每个浓度溶液洗脱2-3个柱体积,流速2 mL/min,每个浓度各洗脱得到一个峰,收集D2组分;
⑤凝胶过滤柱纯化:将收集的D2组分浓缩,采用Superdex 200凝胶过滤柱进行进一步纯化,用去离子水2.5倍柱体积进行洗脱,流速为0.3 mL/min,得到两个多糖峰D21和D22组分,为文蛤多糖纯品;
⑥冷冻干燥:将D21和D22组分进行冷冻干燥,制备文蛤多糖精品,D21组分呈白色疏松絮状,D22组分呈白色粉末状。
2.根据权利要求1所述的方法取得的文蛤多糖精品在保健品方面的应用方法,其特征为:添加文蛤多糖精品D21、D22中的一种或两种至终浓度为1-10mg/ml,配以蜂蜜、柠檬酸中的一种或两种作为辅料,即可得具有抗氧化作用的文蛤多糖口服液。
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