CN104017098A - 一种从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，该方法包括原料预处理、反复碱提、浓缩、醇沉分离、除蛋白、透析、浓缩、烘干处理和活性测定的工艺过程。粉碎的香菇废菌棒基质，经过反复碱液煎提，可获取得率14%～40%的粗多糖，粗多糖具有明显抗氧化和抗肿瘤活性。本发明技术操作简单，设备投入少，工业化推广可行，不仅实现了变“废”为“宝”，大大降低了香菇多糖制备的成本，而且获得的香菇多糖具有抗氧化和抗肿瘤活性，添加或不添加其他组分可制成胶囊、口服液、片剂等多种剂型的保健食品或作为食品添加剂使用，为废弃香菇菌棒综合利用和减少排污开辟了一条有效途径。

Description

一种从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法

技术领域

本发明涉及到一种从香菇栽培废菌棒直接提取活性香菇多糖的方法，属于农副产物综合利用的技术领域。

背景技术

香菇是世界著名食药兼用真菌。我国是世界第一大香菇生产国。香菇风味独特，营养丰富，并具有抗癌、抗病毒、抗衰老等药用价值，深得国内外广大消费者的喜爱。大量研究表明，香菇多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗感染、降血脂、抗氧化等多种生物活性，广泛应用于医药、食品、饲料等行业。作为癌症病人术后配合治疗药品，国内外均已临床应用；作为保健食品，制备成胶囊、口服液、饮料等商品形式开发应用，国内文献报道和申报的专利较多。

国内申报的香菇多糖制备技术发明专利，主要集中于从香菇子实体（包括菇柄、菇脚等加工下脚料）、发酵菌丝体和发酵液提取多糖。由于香菇子实体价格贵；从发酵菌丝体和发酵液提取多糖需要工业化发酵罐培养，存在着工序复杂和成本较高等问题。香菇栽培结束后的废弃菌棒基质，仍含有大量健壮菌丝体，蕴含着丰富的多糖类物质。而从废菌棒直接提取多糖，原料供应广泛，成本低，可以变废为宝，具有巨大的经济价值和明显的生态意义。

申请号为200810019454.8（公开号：CN101215591A）的发明专利公开了一种菇后香菇菌棒制备香菇多糖的方法，该发明采用的是香菇菌棒经过木霉菌处理后，加入到液体培养基中，发酵培养香菇菌丝体，再从菌丝体提取香菇多糖，而不是从废弃香菇菌棒直接提取多糖。该发明存在着操作工序复杂，需要投资发酵罐进行菌丝体的发酵培养，生产成本高；且香菇废菌棒经过木霉菌的转化，存在着潜在的生物安全性问题，不适合工业化生产利用。申请号为200810050633.8（公开号CN101265303A）的申报专利公开了一种以废弃香菇培养基为原料提取香菇多糖的方法，该发明采用的是水提法直接从香菇废菌棒基质提取多糖，粗多糖的得率较低（4.78%），且没有测定提取粗多糖的生物活性，提取到的香菇多糖是否具有生物活性未知，其推广应用受到限制。其他香菇多糖制备技术，均是从香菇子实体、菌丝体和发酵液为原料提取，存在着成本价格高等问题，且不具有生态效益。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术粗多糖得率低、工序复杂及成本价格高的问题，提供一种从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，采用反复优化的碱提法提取，粗多糖得率和提取率更高，且提取得到的多糖具有明显的生物活性。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，步骤如下：

（1）原料预处理得到香菇废菌棒基质粉末；

（2）将香菇废菌棒基质粉末进行反复碱提得到浸提液；

（3）将浸提液浓缩得到粗提浓缩液；

（4）对粗提浓缩液进行醇沉分离得到粗多糖沉淀；

（5）对粗多糖沉淀除蛋白和透析之后得到多糖溶液；

（6）对多糖溶液进行浓缩、烘干处理得到香菇活性多糖；

其中所述步骤（2）的反复碱提是在60～100℃温度下，采用0.5 mol/L的NaOH溶液进行热回流浸提3小时，浸提时碱液的用量为香菇废菌棒基质粉末的10～30倍；然后离心或过滤分离上清液和沉淀，沉淀再采用香菇废菌棒基质粉末5～15倍用量的碱液重复浸提2次，合并3次浸提液；

所述步骤（5）的除蛋白是将离心后的粗多糖沉淀溶解在蒸馏水或者0.5 mol/L的NaOH溶液中，得到粗多糖溶液，然后加入粗多糖溶液1/3体积的氯仿和正丁醇溶剂，搅拌或振动处理30 min，采用离心机离心分离，收集水相部分； 

所述步骤（5）的透析是将除蛋白离心收集的水相部分装入透析袋，将透析袋口扎紧置于蒸馏水中透析3天，每12小时更换蒸馏水一次，工业化生产可采用一定孔径的超滤膜超滤处理。

所述步骤（5）除蛋白过程中氯仿和正丁醇溶剂的体积比为5：1。

所述步骤（5）除蛋白过程中离心机转速为4000～7500 r/min，离心时间10～20 min。

所述步骤（5）透析袋的分子量为8000～14000 Dal，透析袋使用前，先用50%的乙醇溶液煮沸1 h，再用50%乙醇溶液、0.01 mol/L NaHCO₃与0.001 mol/L EDTA溶液依次清洗，最后用蒸馏水冲洗干净。

所述步骤（1）的原料预处理过程是将废弃香菇菌棒先烘干至水分含量为3%～5%，然后粉碎至颗粒度80～100目，得到香菇废菌棒基质粉末。

所述步骤（3）的对浸提液的浓缩过程，是将浸提液进行真空浓缩或减压蒸馏，使浸提液浓缩至原体积的1/3，得到香菇废基质多糖的粗提浓缩液，真空浓缩的真空度为0.075～0.095MPa，减压蒸馏时蒸馏系统的压力降至1.3～2.0KPa，两种浓缩过程的温度都保持在65～85℃，减压蒸馏的方法进行浓缩与一般的现有的方法相同。

所述步骤（4）的醇沉分离，是往香菇废基质多糖的粗提浓缩液中加入食品医药级的95%乙醇或无水乙醇，使乙醇的终浓度为65%～75%；室温或4℃静置沉淀8～24小时后进行离心分离得到粗多糖沉淀，其中离心机转速为4000～7500 r/min，离心时间10～20 min，如果不再进行进一步的除蛋白和透析等纯化处理，则将沉淀在50～80℃烘箱中烘干至水分含量为3%～5%，获得粗多糖。离心后沉淀也可以经过真空干燥、冷冻干燥等处理，得到含水量为3%～5%的粗多糖。干燥操作与一般的现有的方法相同。该步骤获得的粗多糖含有氢氧化钠及其他杂质，一般不要直接生产利用，可进行一次透析或超滤处理，。

所述步骤（6）对多糖溶液的浓缩，是将透析后的多糖溶液直接进行真空浓缩或减压蒸馏，得到浓缩后的多糖，真空浓缩的真空度为0.075～0.095MPa，减压蒸馏时蒸馏系统的压力降至1.3～2.0KPa，两种浓缩过程的温度都为65～85℃，减压蒸馏的方法进行浓缩与一般的现有的方法相同。

所述步骤（6）的烘干，是指将浓缩后的多糖在50～80℃烘箱中烘干至水分含量为3%～5%，获得多糖产品，浓缩后的多糖也可以经过真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等处理，得到含水量为3%～5%的多糖，干燥操作与一般的现有的方法相同。

对多糖产品活性测定，是指经过除蛋白和透析得到的多糖进行抗氧化活性和抗肿瘤活性测定。抗氧化活性采用邻二氮菲法测定多糖的清除羟基自由基的能力；抗肿瘤活性采用MTT法测定多糖对不同癌细胞生长的抑制能力。

本发明的有益效果：1、直接从香菇栽培的废菌棒基质提取多糖，原料来源丰富。2、碱法提取技术工序少，操作简单，需要的设备均为常见的生物活性物质提取加工设备，利于工业化推广应用。3、从不同出菇茬数的废菌棒提取，粗多糖得率14%-40%（多糖含量测定采用蒽酮-硫酸法），粗多糖纯度超过20%，提取率在6%～10%左右。4、粗多糖经过除蛋白和透析（或超滤）纯化后，具有较强的清除羟基自由基的能力，表明具有显著的抗氧化活性。采用邻二氮菲法测定废菌棒粗多糖抗氧化活性，12 mg/mL粗多糖溶液对羟基自由基的清除率达43.7%。5、粗多糖经过除蛋白和透析（或超滤）纯化后，对Hepg2肝癌细胞和MG63成骨肉瘤细胞等肿瘤细胞生长的抑制率较高，表明具有一定的抗肿瘤活性。采用MTT法测定废菌棒粗多糖抗肿瘤活性：400μg/mL浓度下，对Hepg2肝癌细胞和MG63成骨肉瘤细胞的抑制率分别为13.53%和17.93%。6、得到的粗多糖或经过除蛋白和透析（或超滤）纯化处理后的多糖物质，添加或不添加其他组分可制成胶囊、口服液、片剂等多种剂型的保健食品，或作为食品添加剂使用。7、直接从废弃香菇菌棒提取香菇活性多糖，为香菇产业的综合利用和减少排污开辟了一条有效途径。

具体实施方式

实施例1

本实施例的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，步骤如下：

（1）原料预处理：将废弃香菇菌棒先烘干至水分含量为3%，然后粉碎至颗粒度80目，得到香菇废菌棒基质粉末；

（2）反复碱提：将香菇废菌棒基质粉末在60℃温度下，采用0.5 mol/L的NaOH溶液进行热回流浸提3小时，浸提时碱液的用量为香菇废菌棒基质粉末的10倍，然后离心或过滤分离上清液和沉淀，沉淀再采用香菇废菌棒基质粉末5倍用量的碱液重复浸提2次，合并3次浸提液，得到粗提浓缩液；

（3）浓缩：将浸提液进行真空浓缩，使浸提液浓缩至原体积的1/3，得到香菇废基质多糖的粗提浓缩液，真空浓缩的真空度为0.075MPa，温度为85℃；

（4）醇沉分离：往香菇废基质多糖的粗提浓缩液中加入食品医药级的95%乙醇，使乙醇的终浓度为65%；室温静置沉淀8小时后进行离心分离得到粗多糖沉淀，其中离心机转速为4000 r/min，离心时间20 min，得到粗多糖沉淀；

（5）除蛋白：将离心后的粗多糖沉淀溶解在蒸馏水中，得到粗多糖溶液，然后加入粗多糖溶液1/3体积的氯仿和正丁醇溶剂（体积比为5：1），搅拌30 min，采用离心机离心分离，收集水相部分，其中离心机转速为4000 r/min，离心时间20 min；

（6）透析：将除蛋白离心收集的水相部分装入透析袋，将透析袋口扎紧置于蒸馏水中透析3天，每12小时更换蒸馏水一次，其中透析袋的分子量为8000 Dal，透析袋使用前，先用50%的乙醇溶液煮沸1 h，再用50%乙醇溶液、0.01 mol/L NaHCO₃与0.001 mol/L EDTA溶液依次清洗，最后用蒸馏水冲洗干净；

（7）对多糖溶液浓缩：将透析后的多糖溶液直接进行真空浓缩或减压蒸馏，得到浓缩后的多糖，真空浓缩的真空度为0.075MPa，温度为85℃；

（8）烘干：将浓缩后的多糖在50℃烘箱中烘干至水分含量为3%～5%，获得多糖产品，提取率为6%。

（9）对多糖产品活性测定，对经过除蛋白和透析得到的多糖进行抗氧化活性和抗肿瘤活性测定，抗氧化活性采用邻二氮菲法测定多糖的清除羟基自由基的能力，12 mg/mL粗多糖溶液对羟基自由基的清除率达42.7%，抗肿瘤活性采用MTT法测定多糖对不同癌细胞生长的抑制能力，400μg/mL浓度下，对Hepg2肝癌细胞和MG63成骨肉瘤细胞的抑制率分别为12.68%和16.74%。

实施例2

本实施例的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，步骤如下：

（1）原料预处理：将废弃香菇菌棒先烘干至水分含量为5%，然后粉碎至颗粒度100目，得到香菇废菌棒基质粉末；

（2）反复碱提：将香菇废菌棒基质粉末在100℃温度下，采用0.5 mol/L的NaOH溶液进行热回流浸提3小时，浸提时碱液的用量为香菇废菌棒基质粉末的30倍，然后离心或过滤分离上清液和沉淀，沉淀再采用香菇废菌棒基质粉末15倍用量的碱液重复浸提2次，合并3次浸提液，得到粗提浓缩液；

（3）浓缩：将浸提液进行减压蒸馏，使浸提液浓缩至原体积的1/3，得到香菇废基质多糖的粗提浓缩液，减压蒸馏时蒸馏系统的压力降至1.3KPa，温度为65℃；

（4）醇沉分离：往香菇废基质多糖的粗提浓缩液中无水乙醇，使乙醇的终浓度为75%， 4℃静置沉淀24小时后进行离心分离得到粗多糖沉淀，其中离心机转速为7500 r/min，离心时间10 min，得到粗多糖沉淀；

（5）除蛋白：将离心后的粗多糖沉淀溶解在0.5 mol/L的NaOH溶液中，得到粗多糖溶液，然后加入粗多糖溶液1/3体积的氯仿和正丁醇溶剂（体积比为5：1），振动处理30 min，采用离心机离心分离，收集水相部分，其中离心机转速为7500 r/min，离心时间10 min；

（6）透析：将除蛋白离心收集的水相部分装入透析袋，将透析袋口扎紧置于蒸馏水中透析3天，每12小时更换蒸馏水一次，工业化生产可采用一定孔径的超滤膜超滤处理得到多糖溶液，其中透析袋的分子量为14000 Dal，透析袋使用前，先用50%的乙醇溶液煮沸1 h，再用50%乙醇溶液、0.01 mol/L NaHCO₃与0.001 mol/L EDTA溶液依次清洗，最后用蒸馏水冲洗干净；

（7）对多糖溶液浓缩：将透析后的多糖溶液直接进行减压蒸馏，得到浓缩后的多糖，减压蒸馏时蒸馏系统的压力降至2.0KPa，温度为65℃；

（8）烘干：将浓缩后的多糖在80℃烘箱中烘干至水分含量为3%～5%，获得多糖产品，提取率为10%；

（9）对多糖产品活性测定，对经过除蛋白和透析得到的多糖进行抗氧化活性和抗肿瘤活性测定，抗氧化活性采用邻二氮菲法测定多糖的清除羟基自由基的能力，12 mg/mL粗多糖溶液对羟基自由基的清除率达43.2%，抗肿瘤活性采用MTT法测定多糖对不同癌细胞生长的抑制能力，400μg/mL浓度下，对Hepg2肝癌细胞和MG63成骨肉瘤细胞的抑制率分别为13.25%和17.52%。

实施例3

本实施例的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，步骤如下：

（1）原料预处理：将废弃香菇菌棒先烘干至水分含量为4%，然后粉碎至颗粒度90目，得到香菇废菌棒基质粉末；

（2）反复碱提：将香菇废菌棒基质粉末在70℃温度下，采用0.5 mol/L的NaOH溶液进行热回流浸提3小时，浸提时碱液的用量为香菇废菌棒基质粉末的20倍，然后离心分离上清液和沉淀，沉淀再采用香菇废菌棒基质粉末10倍用量的碱液重复浸提2次，合并3次浸提液，得到粗提浓缩液；

（3）浓缩：将浸提液进行真空浓缩或减压蒸馏，使浸提液浓缩至原体积的1/3，得到香菇废基质多糖的粗提浓缩液，真空浓缩的真空度为0.08MPa，温度为70℃。

（4）醇沉分离：往香菇废基质多糖的粗提浓缩液中加入食品医药级的95%乙醇，使乙醇的终浓度为70%；室温静置沉淀10小时后进行离心分离得到粗多糖沉淀，其中离心机转速为5000 r/min，离心时间15 min；

（5）除蛋白：将离心后的粗多糖沉淀溶解在蒸馏水中，得到粗多糖溶液，然后加入粗多糖溶液1/3体积的氯仿和正丁醇溶剂（体积比为5：1），搅拌30 min，采用离心机离心分离，收集水相部分，其中离心机转速为6000 r/min，离心时间15 min；

（6）透析：将除蛋白离心收集的水相部分装入透析袋，将透析袋口扎紧置于蒸馏水中透析3天，每12小时更换蒸馏水一次，工业化生产可采用一定孔径的超滤膜超滤处理得到多糖溶液，其中透析袋的分子量为10000 Dal，透析袋使用前，先用50%的乙醇溶液煮沸1 h，再用50%乙醇溶液、0.01 mol/L NaHCO₃与0.001 mol/L EDTA溶液依次清洗，最后用蒸馏水冲洗干净；

（7）对多糖溶液浓缩：将透析后的多糖溶液直接进行真空浓缩或减压蒸馏，得到浓缩后的多糖，真空浓缩的真空度为0.08MPa，温度为70℃；

（8）烘干：将浓缩后的多糖在经过真空干燥得到含水量为3%～5%的多糖，收率为8%左右；

（9）对多糖产品活性测定，对经过除蛋白和透析得到的多糖进行抗氧化活性和抗肿瘤活性测定，抗氧化活性采用邻二氮菲法测定多糖的清除羟基自由基的能力，12 mg/mL粗多糖溶液对羟基自由基的清除率达43.3%，抗肿瘤活性采用MTT法测定多糖对不同癌细胞生长的抑制能力，400μg/mL浓度下，对Hepg2肝癌细胞和MG63成骨肉瘤细胞的抑制率分别为12.98%和17.26%。

实施例4

本实施例的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，步骤如下：

（1）原料预处理：将废弃香菇菌棒先烘干至水分含量为3.5%，然后粉碎至颗粒度95目，得到香菇废菌棒基质粉末；

（2）反复碱提：将香菇废菌棒基质粉末在80℃温度下，采用0.5 mol/L的NaOH溶液进行热回流浸提3小时，浸提时碱液的用量为香菇废菌棒基质粉末的20倍，然后离心或过滤分离上清液和沉淀，沉淀再采用香菇废菌棒基质粉末8倍用量的碱液重复浸提2次，合并3次浸提液，得到粗提浓缩液；

（3）浓缩：将浸提液进行减压蒸馏，使浸提液浓缩至原体积的1/3，得到香菇废基质多糖的粗提浓缩液，减压蒸馏时蒸馏系统的压力降至1.5KPa，温度为85℃；

（4）醇沉分离：往香菇废基质多糖的粗提浓缩液中加入食品医药级的95%乙醇，使乙醇的终浓度为72%； 4℃静置沉淀20小时后进行离心分离得到粗多糖沉淀，其中离心机转速为5000 r/min，离心时间18 min；

（5）除蛋白：将离心后的粗多糖沉淀溶解在0.5 mol/L的NaOH溶液中，得到粗多糖溶液，然后加入粗多糖溶液1/3体积的氯仿和正丁醇溶剂（体积比为5：1），振动处理30 min，采用离心机离心分离，收集水相部分，其中离心机转速为5500 r/min，离心时间12 min；

（6）透析：将除蛋白离心收集的水相部分装入透析袋，将透析袋口扎紧置于蒸馏水中透析3天，每12小时更换蒸馏水一次，工业化生产可采用一定孔径的超滤膜超滤处理得到多糖溶液，其中透析袋的分子量为12000 Dal，透析袋使用前，先用50%的乙醇溶液煮沸1 h，再用50%乙醇溶液、0.01 mol/L NaHCO₃与0.001 mol/L EDTA溶液依次清洗，最后用蒸馏水冲洗干净；

（7）对多糖溶液浓缩：将透析后的多糖溶液直接进行真空浓缩，得到浓缩后的多糖，真空浓缩的真空度为0.085MPa，温度为80℃；

（8）烘干：将浓缩后的多糖经过冷冻干燥处理，得到含水量为3%～5%的多糖，收率为8%左右；

（9）对多糖产品活性测定，对经过除蛋白和透析得到的多糖进行抗氧化活性和抗肿瘤活性测定，抗氧化活性采用邻二氮菲法测定多糖的清除羟基自由基的能力，12 mg/mL粗多糖溶液对羟基自由基的清除率达42.9%，抗肿瘤活性采用MTT法测定多糖对不同癌细胞生长的抑制能力，400μg/mL浓度下，对Hepg2肝癌细胞和MG63成骨肉瘤细胞的抑制率分别为13.75%和17.43%。

实施例5

本实施例的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，步骤如下：

（1）原料预处理：将废弃香菇菌棒先烘干至水分含量为4.5%，然后粉碎至颗粒度90目，得到香菇废菌棒基质粉末；

（2）反复碱提：将香菇废菌棒基质粉末在85℃温度下，采用0.5 mol/L的NaOH溶液进行热回流浸提3小时，浸提时碱液的用量为香菇废菌棒基质粉末的25倍，然后离心或过滤分离上清液和沉淀，沉淀再采用香菇废菌棒基质粉末12倍用量的碱液重复浸提2次，合并3次浸提液，得到粗提浓缩液；

（3）浓缩：将浸提液进行真空浓缩，使浸提液浓缩至原体积的1/3，得到香菇废基质多糖的粗提浓缩液，真空浓缩的真空度为0.09MPa，温度为70℃；

（4）醇沉分离：往香菇废基质多糖的粗提浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇的终浓度为70%；室温静置沉淀20小时后进行离心分离得到粗多糖沉淀，其中离心机转速为6500 r/min，离心时间18 min；

（5）除蛋白：将离心后的粗多糖沉淀溶解在蒸馏水中，得到粗多糖溶液，然后加入粗多糖溶液1/3体积的氯仿和正丁醇溶剂（体积比为5：1），搅拌30 min，采用离心机离心分离，收集水相部分，其中离心机转速为4500 r/min，离心时间16 min；

（6）透析：将除蛋白离心收集的水相部分装入透析袋，将透析袋口扎紧置于蒸馏水中透析3天，每12小时更换蒸馏水一次，工业化生产可采用一定孔径的超滤膜超滤处理得到多糖溶液，其中透析袋的分子量为13000 Dal，透析袋使用前，先用50%的乙醇溶液煮沸1 h，再用50%乙醇溶液、0.01 mol/L NaHCO₃与0.001 mol/L EDTA溶液依次清洗，最后用蒸馏水冲洗干净；

（7）对多糖溶液浓缩：将透析后的多糖溶液直接进行真空浓缩或减压蒸馏，得到浓缩后的多糖，真空浓缩的真空度为0.085MPa，温度为72℃；

（8）烘干：将浓缩后的多糖在60℃烘箱中烘干至水分含量为3%～5%，获得多糖产品； 

（9）对多糖产品活性测定，对经过除蛋白和透析得到的多糖进行抗氧化活性和抗肿瘤活性测定，抗氧化活性采用邻二氮菲法测定多糖的清除羟基自由基的能力，12 mg/mL粗多糖溶液对羟基自由基的清除率达43.4%，抗肿瘤活性采用MTT法测定多糖对不同癌细胞生长的抑制能力，400μg/mL浓度下，对Hepg2肝癌细胞和MG63成骨肉瘤细胞的抑制率分别为13.29%和17.15%。

实施例6

本实施例的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，步骤如下：

（1）原料预处理：将废弃香菇菌棒先烘干至水分含量为3%～5%，然后粉碎至颗粒度80～100目，得到香菇废菌棒基质粉末；

（2）反复碱提：将香菇废菌棒基质粉末在60～80℃温度下，采用0.5 mol/L的NaOH溶液进行热回流浸提3小时，浸提时碱液的用量为香菇废菌棒基质粉末的10～15倍，然后离心或过滤分离上清液和沉淀，沉淀再采用香菇废菌棒基质粉末5～10倍用量的碱液重复浸提2次，合并3次浸提液，得到粗提浓缩液；

（3）浓缩：将浸提液进行真空浓缩或减压蒸馏，使浸提液浓缩至原体积的1/3，得到香菇废基质多糖的粗提浓缩液，真空浓缩的真空度为0.075～0.08MPa，温度为65～70℃，减压蒸馏时蒸馏系统的压力降至1.3～2.0KPa。

（4）醇沉分离：往香菇废基质多糖的粗提浓缩液中加入食品医药级的95%乙醇或无水乙醇，使乙醇的终浓度为65%～70%；室温或4℃静置沉淀8～12小时后进行离心分离得到粗多糖沉淀，其中离心机转速为4000～7500 r/min，离心时间10～20 min，如果不再进行进一步的除蛋白和透析等纯化处理，则将沉淀在50～80℃烘箱中烘干至水分含量为3%～5%，获得粗多糖。离心后沉淀也可以经过真空干燥、冷冻干燥等处理，得到含水量为3%～5%的粗多糖。

（5）除蛋白：将离心后的粗多糖沉淀溶解在蒸馏水或者0.5 mol/L的NaOH溶液中，得到粗多糖溶液，然后加入粗多糖溶液1/3体积的氯仿和正丁醇溶剂（体积比为5：1），搅拌或振动处理30 min，采用离心机离心分离，收集水相部分，其中离心机转速为4000～7500 r/min，离心时间10～20 min；

（6）透析：将除蛋白离心收集的水相部分装入透析袋，将透析袋口扎紧置于蒸馏水中透析3天，每12小时更换蒸馏水一次，工业化生产可采用一定孔径的超滤膜超滤处理得到多糖溶液，其中透析袋的分子量为8000～10000 Dal，透析袋使用前，先用50%的乙醇溶液煮沸1 h，再用50%乙醇溶液、0.01 mol/L NaHCO₃与0.001 mol/L EDTA溶液依次清洗，最后用蒸馏水冲洗干净；

（7）对多糖溶液浓缩：将透析后的多糖溶液直接进行真空浓缩或减压蒸馏，得到浓缩后的多糖，真空浓缩的真空度为0.075～0.095MPa，温度为65～75℃，减压蒸馏时蒸馏系统的压力降至1.3～2.0KPa；

（8）烘干：将浓缩后的多糖在50～60℃烘箱中烘干至水分含量为3%～5%，获得多糖产品，浓缩后的多糖也可以经过真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等处理，得到含水量为3%～5%的多糖，收率为6%～10%左右；

（9）对多糖产品活性测定，对经过除蛋白和透析得到的多糖进行抗氧化活性和抗肿瘤活性测定，抗氧化活性采用邻二氮菲法测定多糖的清除羟基自由基的能力，抗肿瘤活性采用MTT法测定多糖对不同癌细胞生长的抑制能力。

术语解释：（1）香菇（Lentinula edodes）: 世界范围内，特别是在中国广泛栽培的一种食药兼用真菌；（2）香菇栽培废菌棒：香菇栽培结束不再进行出菇管理的废菌棒基质，仍含有大量健壮菌丝体；（3）多糖：由酮糖或醛糖通过糖苷键连接起来的一类天然大分子碳水化合物；（4）活性多糖：具有抗肿瘤、抗氧化（衰老）等生物活性的多糖；（5）粗多糖得率：提取到的粗多糖的质量占提取废菌棒原料质量的百分数；（6）多糖提取率：粗多糖得率乘以粗多糖纯度，为理论上原料中可提取到的多糖的百分率。   

Claims (9)

1.一种从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，其特征在于步骤如下：

（1）原料预处理得到香菇废菌棒基质粉末；

（2）将香菇废菌棒基质粉末进行反复碱提得到浸提液；

（3）将浸提液浓缩得到粗提浓缩液；

（4）对粗提浓缩液进行醇沉分离得到粗多糖沉淀；

（5）对粗多糖沉淀除蛋白和透析之后得到多糖溶液；

（6）对多糖溶液进行浓缩、烘干处理得到香菇活性多糖；

其中所述步骤（2）的反复碱提是在60～100℃温度下，采用0.5 mol/L的NaOH溶液进行热回流浸提3小时，浸提时碱液的用量为香菇废菌棒基质粉末的10～30倍；然后离心或过滤分离上清液和沉淀，沉淀再采用香菇废菌棒基质粉末5～15倍用量的碱液重复浸提2次，合并3次浸提液；

所述步骤（5）的除蛋白是将离心后的粗多糖沉淀溶解在蒸馏水或者0.5 mol/L的NaOH溶液中，得到粗多糖溶液，然后加入粗多糖溶液1/3体积的氯仿和正丁醇溶剂，搅拌或振动处理30 min，采用离心机离心分离，收集水相部分； 

所述步骤（5）的透析是将除蛋白离心收集的水相部分装入透析袋，将透析袋口扎紧置于蒸馏水中透析3天，每12小时更换蒸馏水一次。

2.根据权利要求1所述的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，其特征在于：所述步骤（5）除蛋白过程中氯仿和正丁醇溶剂的体积比为5：1。

3.根据权利要求1所述的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，其特征在于：所述步骤（5）中除蛋白过程中离心机转速为4000～7500 r/min，离心时间10～20 min。

4.根据权利要求1所述的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，其特征在于：所述步骤（5）中透析袋的分子量为8000～14000 Dal，透析袋使用前，先用50%的乙醇溶液煮沸1 h，再用50%乙醇溶液、0.01 mol/L NaHCO₃与0.001 mol/L EDTA溶液依次清洗，最后用蒸馏水冲洗干净。

5.根据权利要求1所述的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，其特征在于：所述步骤（1）的原料预处理过程是将废弃香菇菌棒先烘干至水分含量为3%～5%，然后粉碎至颗粒度80～100目，得到香菇废菌棒基质粉末。

6.根据权利要求1所述的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，其特征在于：所述步骤（3）的对浸提液的浓缩过程，是将浸提液进行真空浓缩或减压蒸馏，使浸提液浓缩至原体积的1/3，得到香菇废基质多糖的粗提浓缩液，真空浓缩的真空度为0.075～0.095MPa，减压蒸馏时蒸馏系统的压力降至1.3～2.0KPa，温度为65～85℃。

7.根据权利要求1所述的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，其特征在于：所述步骤（4）的醇沉分离，是往香菇废基质多糖的粗提浓缩液中加入食品医药级的95%乙醇或无水乙醇，使乙醇的终浓度为65%～75%；室温或4℃静置沉淀8～24小时后进行离心分离得到粗多糖沉淀，其中离心机转速为4000～7500 r/min，离心时间10～20 min。

8.根据权利要求1所述的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，其特征在于：所述步骤（6）对多糖溶液的浓缩，是将透析后的多糖溶液直接进行真空浓缩或减压蒸馏，得到浓缩后的多糖，真空浓缩的真空度为0.075～0.095MPa，减压蒸馏时蒸馏系统的压力降至1.3～2.0KPa，温度为65～85℃。

9.根据权利要求1所述的从香菇废菌棒直接提取香菇活性多糖的方法，其特征在于：所述步骤（6）的烘干，是指将浓缩后的多糖在50～80℃烘箱中烘干至水分含量为3%～5%，获得多糖产品。