KR20040090374A - 표고버섯 자실체로부터 베타-글루칸을 함유하는 수용성다당체의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표고버섯 자실체로부터 베타-글루칸(β-glucan)을 함유하는 수용성 다당체를 추출 및 정제하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 표고버섯의 자실체를 분쇄하고, 알카리 용액을 이용하여 항암, 항종양 및 면역활성을 증가시키는 것으로 알려져 있는 베타-글루칸을 포함하는 수용성 다당체를 단시간 내에 고효율로 추출 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

표고버섯 자실체로부터 베타-글루칸을 함유하는 수용성 다당체의 생산 방법{Preparation method of water soluble polysaccharide comprising β-glucan from Korean oak mushroom}

본 발명은 표고버섯 자실체로부터 항암, 항종양 및 면역활성을 증가시키는 것으로 알려져 있는 베타-글루칸을 함유하는 수용성 다당체를 추출 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

항암작용이 있는 것으로 알려진 버섯에 있어 항암성분(抗癌成分)은 주로 균사체(菌絲體)보다는 자실체(子實體)에 다양하게 많이 존재하며, 균사체와 배양기질(培養基質)속에도 다소 존재하는 것으로 밝혀져 있다. 버섯에서 분리된 항종양활성물질(抗腫瘍活性物質)중에서 가장 잘 알려져 있는 물질은 베타디글루칸 (β-D-glucan)류로서, 이 물질은 베타글루칸(β-glucan), 헤테로베타글루칸(hetero-β-glucan), 산성(酸性)베타글루칸, 불용성(不溶性)베타글루칸, 갈락토베타글루칸 (galacto-β-glucan), 베타글루칸프로테인(β-glucan-protein), 헤테로베타글루칸프로테인(hetero-β-glucan-protein), 글루코만난(glucomannan), 알파만노베타글루칸(α-manno-β-glucan), 만난프로테인(mannan-protein), 키트로베타글루칸 (chitro-β-glucan), 슈가프로테인(sugar-protein), 키틴(chitin), 글루코키틴 (gluco-chitin) 등을 포함하고 있다. 이 외의 항종양물질로 헤테로폴리사카라이드 (heteropolysaccharide), 셀루로오스(cellulose 섬유소 纖維素), 핵산(核酸), 렉틴(lectin), 리그닌(lignin 목질소 木質素), 게르마늄(Ge), 스테로이드 등이 알려져 있다.

버섯에서 글루칸의 합성기작(合成機作)은 배양기질로부터 흡수된 영양을 단백질로 합성하고 이것을 다시 포도당으로 환원시켜 2종의 서로 다른 포도당이 합성되어 형성되는 것으로 추정하고 있다.

버섯의 항암작용은 β-글루칸이 그 활성에 크게 관여한다는 사실은 많은 연구학자에 의하여 발표되어 익히 알려져 있다. 다당체의 일종인 β-글루칸은, 인간의 정상적인 세포 조직의 면역기능을 활성화시켜 암세포의 증식과 재발을 방지하고, 면역세포의 기능을 활발하게 하는 인터페론, 인터루킨의 생성을 촉진시켜 암에 직접적으로 작용하여 암세포만 죽이고 몸의 면역을 강화시켜 간접적으로 암세포를 없앨 수 있다. 또한, β-글루칸은 암세포주변의 대식세포(암세포 등 이물질을 잡아먹는 면역세포: T세포와 B세포)를 활성화시켜 암의 진행을 막으며, 항암 및 제암효과가 크고, 혈당 및 혈압강하 작용과 면역력 증가 작용을 하며, 주요 질병에 대한 예방 및 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

표고버섯(Lentinus edodes)은 담자균류 주름버섯목 느타리과에 속하며, 한국·일본·중국·타이완 등지에 주로 분포한다. 균저는 지름 10 cm로 납작한 반구형이나 생장하면 점점 편평하게 펼쳐지고 표면은 흑갈색으로 불규칙하게 갈라진 금이 있고 뒷면에는 많은 주름이 있다. 또한, 밤나무, 떡갈나무, 돌참나무 등 수목 줄기에 기생하지만 보통 인공재배가 성행한다.

표고버섯의 성분을 보면 마른 표고버섯은 72 %가 식용부분으로, 식용부분 100 g 당 수분 13 g, 지방 1.8 g, 탄수화물 54 g, 조섬유 7.8 g, 회분 4.9 g, 칼슘 124 mg, 인 415 mg, 철 25.3 mg, 비타민 B1 0.07 mg, 비타민 B2 1.13 mg, 니코틴 산 18.9 mg을 함유하고 있으며, 신선한 표고버섯은 수분 85 ∼90 %를 함유하는 외에 고형물 중에는 조단백질 19 %, 조지방 4 %, 가용성무기질소물질 67 %, 조섬유 7 %, 회분 3 %가 함유되어 있다. 상기와 같이 표고버섯은 비타민 B1과 B2, 칼슘과 인을 가장 많이 함유하고 있으며, 산소 운반역할을 하며 혈액중의 헤모글로빈을 생성하는 철분도 다량 포함하고 있다. 또한, 표고버섯에는 목이버섯 다음으로 식이섬유가 많이 들어 있어 변비예방에 도움을 준다. 표고버섯 중에 함유되어 있는 에르고스테롤(ergosterol) 은 햇볕의 자외선에 쬐면 모두 비타민 D2로 변한다.

표고버섯의 약리활성으로는 표고버섯에는 혈중지질을 내리는 작용이 있는데, 이는 에리타데닌(eritadenine)이라는 특수성분이 혈액중의 콜레스테롤을 제거하기 때문이며, 이로 인한 고혈압 예방 효과를 기대할 수 있다. 또한, 저칼로리 식품이며, 탄수화물 헤미셀룰로스의 섬유소가 위와 소장의 기능을 정상화시켜 비만증, 당뇨병, 심장병, 간장질환 등에 예방효과가 있다.

최근에는 표고버섯의 성분으로 항암, 항종양의 효능이 있는 다당체 물질인 렌티난(lentinan)이 발견되어 암 환자의 연명효과가 있는 것으로 입증되면서, 암치료에 많은 도움을 주게 되었다. 또한, 표고버섯에 함유되어 있는 멜라닌이라는 색소성분은 뇌중심부에 작용하여 자율신경을 안정시켜 주는 효과가 있다고 한다.

상기와 같이, 표고버섯에는 다양한 생리활성성분이 함유되어 있는 바, 이러한 물질을 추출하여 이용하려는 시도가 이루어지고 있다. 일반적으로, 표고버섯 추출물은 식용음료의 제조에 사용하거나(한국공개특허 1999-24836), 화장료로 사용(한국공개특허 2001-0111340)하기도 한다.

그런데, 종래에는 버섯 종류의 균사체 또는 자실체로부터 베타-글루칸을 비롯한 유용물질을 추출 정제함에 있어, 소량의 양만으로 열수 추출, 알코올 등의 물질을 이용한 추출이 시도되었고, 크로마토그래피와 같은 방법을 이용하여 최종적으로 정제하는 공정을 이용하였다.

그러나, 이러한 종래의 표고버섯 추출물은 물, 다가 알코올 등을 추출용매로사용하여 표고버섯 중의 일반성분을 무작위로 추출하여 얻어지는 것으로, 활성 성분 및 기타 성분들에 대한 추출효율이 낮아 식품 및 화장품 등의 제조에 이용하는 데는 한계가 있다. 또한, 알코올과 같은 고가의 유기용매의 처리에 의하여 제조단가의 상승 및 환경오염을 가져올 수도 있다.

또한, 상기와 같은 방법을 이용할 경우 과정의 복잡성과 정제시간이 길어지는 등의 많은 문제점을 포함하고 있어 유용물질의 대량생산에는 적합하지 못하다.

따라서 표고버섯으로부터 유용물질을 대량생산하기 위하여 공정을 단순화하고, 효율성을 증가시킴으로써 베타-글루칸(렌티난)을 함유하는 유용물질의 대량생산이 가능할 것으로 판단된다.

따라서, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결함으로써 유용물질의 대량생산이란 목적을 달성하기 위하여, 표고버섯 자실체를 재배농가로부터 구입하여 미세한 분말로 분쇄하고, 수산화나트륨(가성소다)을 이용하여 추출한 후 여과법을 이용한 불순물의 제거 공정을 거쳐 항암, 항종양, 면역활성 증강에 효과를 나타내는 것으로 알려진 자실체 내 고분자 물질의 생산을 위한 최적조건을 확립한 후, 추출된 물질이 상기 본 발명의 베타-글루칸을 함유하는 수용성 다당체임을 조사함으로, 상기 방법으로 베타-글루칸을 함유하는 수용성 다당체를 단시간에 고효율로 분리 정제할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 표고버섯 자실체로부터 항암, 항종양 및 면역활성을 증가시키는 것으로 알려져 있는 베타-글루칸을 함유하는 수용성 다당체를 단시간에 고효율로 추출 및 정제하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

도 1 은 본 발명의 표고버섯 자실체로부터 수용성 다당체를 분리하는 방법을 나타낸 도이며,

도 2 는 본 발명의 수용성 다당체의 1H 핵자기공명 스펙트럼을 분석한 결과에 관한 도이며,

도 3 은 본 발명의 수용성 다당체의 13C 핵자기공명 스펙트럼을 분석한 결과에 관한 도이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표고버섯(Lentinus edodes) 자실체로부터 항암, 항종양 및 면역활성을 증가시키는 베타-글루칸을 함유하는 수용성 다당체를 대량으로 신속하게 추출 및 정제하는 방법을 제공한다.

상기 표고버섯은 자연산 또는 인공배양산, 바람직하게는 인공배양산을 사용한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 표고버섯 자실체로부터 베타-글루칸을 함유하는 균체내 고분자 물질인 수용성 다당체를 대량으로 신속하게 추출 및 정제하는 방법은

(1)건조된 표고버섯 자실체로부터 알카리를 이용하여 추출물을 수득하는 1단계, (2)상기 추출물을 산용액으로 중화시키고 생성된 단백질 및 기타 불용성분의 침전을 제거하는 2단계, (3)탈염 및 농축시키는 3단계, (4)초한외여과 장치를 이용하여 재농축 및 불순물을 제거하여, 분자량 1 만 이상의 베타-글루칸을 함유하는 수용성 다당체 용액을 분리 정제하는 4단계, 상기에서 수득된 수용성 다당체 용액을 동결건조하는 5단계를 포함하는 분자량 1만 이상의 베타-글루칸을 함유하는 고분자의 수용성 다당체의 분리 정제 방법을 제공한다.

구체적으로, 제 1단계에서는, 표고버섯 자실체를 분쇄한 후, 분쇄된 자실체 중량의 1 내지 20 배의 1 % 내지 10 %의 알카리(최종농도), 바람직하게는 5 % 수산화나트륨 용액을 가해 추출기에서 실온으로 3 내지 15시간, 바람직하게는 10시간동안, 100 내지 300 rpm, 바람직하게는 200 rpm의 속도로 교반하면서 추출물(상등액)을 수득할 수 있다. 또한 알카리에 의한 추출과 동시에 80 내지 100 ℃, 바람직하게는 98 ℃의 열을 가하여 추출물을 수득할 수도 있다. 이 경우, 추출 효율을 극대화시킴과 동시에 알카리에 의해 가용화된 단백질을 침전시켜 제거할 수 있다. 이 때 생성된 침전물은 연속원심분리 장치를 이용하여, 13,000 내지 15,000 rpm으로 원심분리하여 제거할 수 있다.

제 2단계에서는, 상기로부터 얻어진 표고버섯 추출물을 100 내지 300 rpm, 바람직하게는 200 rpm의 속도로 교반하면서 서서히 염산, 질산, 황산과 같은 강산, 바람직하게는 염산용액을 첨가하여 수소이온농도를 pH 6.5 내지 8, 바람직하게는 pH 7로 조정한 후, 실온에서 3 내지 8시간, 바람직하게는 5시간 방치하여 중성 pH 하에서 생성되는 불용성분의 침전을 형성시키고, 80 내지 130 ℃, 바람직하게는 100 ℃에서 1 내지 2 시간, 바람직하게는 1 시간 가열하여 단백질을 응고시킨 후, 단백질 및 기타 불용성분을 연속원심분리 장치를 이용하여, 13,000 내지 15,000 rpm으로 원심분리하고, 여과장치를 이용하여 제거할 수 있다.

제 3단계에서는, 상기 제 2단계에서 중화처리된 표고버섯 추출액 중에 생성된 염, 바람직하게는 염화나트륨을 탈염장치를 이용하여 탈염 및 농축을 동시에 행하며, 탈염과정에서 먼저 추출액을 1/5 내지 1/2의 농도, 바람직하게는 1/3의 농도로 농축시키고, 농축된 추출물에 1 내지 5배 부피의 정제수를 첨가하여, 1 내지 10 회, 바람직하게는 5 회 상기의 탈염 및 농축과정을 반복하여 행함과 동시에 정제수로 추출액의 색소성분을 제거하는 세척효과도 얻을 수 있다.

제 4단계에서는 상기 제 3단계에서 탈염 및 농축된 표고버섯 추출액을 초한외여과 장치, 막여과장치 또는 탈염농축장치, 바람직하게는 초한외여과 장치를 이용하여 농축함과 동시에, 1만 달톤(D) 이하의 분자량을 가지는 저분자량의 당류와 무기물 등의 불순물이 제거된 고분자의 수용성 다당체 용액을 수득할 수 있다.

제 5단계에서는 상기에서 수득된 수용성 다당체 용액을 감압건조 또는 동결건조하여 분자량 1 만 이상의 베타-글루칸을 함유하는 고분자의 수용성 다당체를 제조할 수 있다(도 1참조).

상기 분리공정을 통하여 얻어진 수용성 다당체에 대하여, 가수분해 후 가스 크로마토크래피로 다당류 물질의 구성당 및 구성당의 비율을 조사하여, 그 존재를 확인하고 정량 할 수 있다. 또한, 상기 다당체의 구조를¹H 및¹³C 핵자기공명법을 이용하여, 대조군인 베타-글루칸 제품과 핵자기공명의 패턴을 비교하여 파형의 패턴이 동일함을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 제조방법들을 통한 결과, 항암, 항종양 및 면역활성을 증가시키는 것으로 알려진 베타-글루칸을 단시간에 다량으로 분리 정제함을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 다음과 같은 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 시료의 준비

본 발명의 실험에 사용하기 위한 표고버섯의 자실체는 강원도 춘천시 근교의 표고버섯 재배농가에서 생산된 건조 상태의 자실체를 구입하여 사용하였다.

실시예 2. 표고버섯 추출물 수득 단계

표고버섯 자실체 1 kg을 500 메쉬(mesh)의 크기로 분쇄한 시료에 5 % 수산화나트륨(최종농도)용액을 10 ℓ가해, 실온에서 10시간동안 200 rpm의 속도로 교반함과 동시에 98 ℃의 열을 가하면서 추출을 행하여 표고버섯 추출액(상등액)을 수득하였다. 이 때 생성된 침전물을 연속원심분리(Tomoe사, 일본)장치를 이용하여, 15,000 rpm에서 원심분리하였다.

실시예 3. 단백질 및 기타 불용성분 제거 단계

상기의 실시예 2에서 수득한 표고버섯 추출액을 200 rpm의 속도로 교반하면서 서서히 1N 염산 용액을 첨가하여 pH를 7로 조정한 후, 실온에서 5시간 방치하여 중성의 pH 하에서 생성되는 불용성분의 침전을 형성시킨 후, 100 ℃에서 1시간 가열하여 단백질을 응고시킨 후, 생성된 단백질 및 기타 불용성분의 침전을 연속원심분리(Tomoe사, 일본)장치를 이용하여, 15,000 rpm에서 원심분리하고, 여과장치(Pall사, 미국)를 이용하여 단시간에 단백질 및 기타 불용성분을 간단히 제거하였다.

실시예 4. 탈염 및 농축 단계

상기의 실시예 3에서 중화처리된 표고버섯 추출액에서 염산 및 수산화나트륨과의 화학반응에 의해 생성된 염화나트륨은 탈염농축장치(주식회사 엔비텍사)를 이용하여 제거하였다. 이 때 이 장치를 사용하여 탈염 및 농축을 동시에 행하였으며, 탈염과정에서 1/3의 농도로 추출액이 농축이 되면 다시 2배 부피의 정제수를 첨가하여 5회 상기 탈염 및 농축을 행함과 동시에 정제수로 추출액의 색소성분을 제거하는 세척효과도 얻었다.

실시예 5. 재농축 및 불순물 제거 단계

상기의 실시예 4에서 탈염 및 농축되어진 표고버섯 추출액을 초한외여과 장치(Ultrafilter, 필러바이오텍사, 한외여과범위: 1만 달톤의 분자량)를 이용하여 추출액을 농축함과 동시에 1 만 이하의 분자량을 가지는 저분자의 당류와 무기물 등의 불순물을 제거하여, 1만 달톤(D) 이상의 분자량만을 갖는 베타-글루칸을 함유하는 수용성 다당체 용액을 수득하였다.

실시예 6. 동결건조 단계

상기 실시예 5에서 수득된 고분자의 수용성 다당체 용액을 동결건조기를 이용하여 -70 ℃의 초저온에서 동결건조하여 건조된 분자량 1 만 이상의 베타-글루칸을 함유하는 고분자 수용성 다당체 60 g을 제조하였다.

실험예 1. 수용성 다당체의 구성당 및 구성비율 조사

상기 실시예 5에서 수득한 수용성 다당체의 구성당 및 구성비율을 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저 상기 실시예 5에서 수득한 수용성 다당체 2 mg을 2N TFA(Trifluoro acetic acid)로 가수분해하고, 소듐 브라이드(NaB₄)로 환원시킨 다음, 무수초산으로 아세틸화시켜 애디톨 아세테이트(aditol acetate)로 만들어 가스 칼럼 크로마토그래피(gas column chromatography)를 실시하였다. 이때 조건은 칼럼 온도를 초기에 200 ℃로 2분간 유지한 후 1분 간격으로 4 ℃씩 온도를 증가시켜 최종온도가 250 ℃로 2분간 유지되게 하여 측정하였으며, 탐지기(detector)의 온도는 260 ℃, 주입기(injector)의 온도는 250 ℃로 유지하였다. 사용된 기기는 휴렛팩커드(HP 5890 GC) 모델을 사용하였으며 칼럼은 휴즈드 실리카 캐피러리 컬럼 에스피 2330(fused silica capillary column sp-2330, 0.32mm x 30m)를 사용하였다. 탄수화물은 페놀-설퓨릭 에시드 방법(Dubois et al., Anal. Chem.,28, p350)으로 측정하였고, 단백질의 경우는 브래드포드 분석 방법(Bradford, Anal. Biochem.,72, pp248-254)으로측정하였다.

실험결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 표고버섯 자실체로부터 추출된 수용성 다당체의 구성당 및 구성비율을 보면, 92.4%의 탄수화물과 2.03%의 조단백질로 구성되어 있으며 탄수화물의 구성당의 조성비를 확인한 결과, 글루코스가 61.8 %를 차지함을 확인할 수 있었다.

추출다당류	탄수화물(%)	단백질(%)	구성당(몰비 %)
표고버섯			글루코스	만노스	갈락토오스
	92.4	2.03	61.8	28.0	10.2

실험예 2. 표고버섯 자실체로부터 추출되어진 성분분석

상기의 실시예 5에서 수득된 수용성 다당체의 구성 성분을 분석하기 위하여 그 성분 분석을 한국화학시험연구원에 의뢰하여 행하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.

시험항목	단위	시험결과	시험방법
당질	%	92.4	식품공전
회분	%	4.39	식품공전
조단백	%	2.03	식품공전
조지방	%	0.75	식품공전
포도당,과당,사당	%	0	HPLC

실험예 3. 표고버섯 자실체로부터 수득된 베타-글루칸을 함유하는 수용성 다당체의 확인

상기 실시예 5의 표고버섯 자실체로부터 수득된 수용성 다당체를 확인 및 동정하기 위하여, 그 다당체의 구조를 1H 및 13C 핵자기공명법을 이용하여 시그마사(Sigma사, USA)의 보리로부터 정제되어진 베타-글루칸(β-glucan)을 대조군으로 하여 핵자기공명의 패턴을 비교한 결과, 도 2와 같이, 파형의 패턴이 동일함을 확인하여, 실시예 5의 다당체가 베타-글루칸임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 표고버섯 자실체로부터 수용성 다당체의 분리 및 정제법은 항암, 항종양, 면역활성 증강 효과가 있는 것으로 알려진 베타-글루칸을 함유하는 고분자 수용성 다당체를 단순공정을 통해 고효율로 분리 정제할 수 있어 매우 경제적이며, 또한, 알코올과 같은 고가의 유기용매의 처리에 의한 제조단가의 상승 및 환경오염을 억제할 수 있으므로, 대량생산을 위해 상업적으로 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (8)

1. 건조된 표고버섯(Letinus edodes) 자실체로부터 알카리를 이용하여 추출물을 수득하는 1단계, 상기 추출물을 산용액으로 중화시키고 생성된 단백질 및 기타 불용성분의 침전을 제거하는 2단계, 탈염 및 농축시키는 3단계, 초한외여과 장치를 이용하여 재농축 및 불순물을 제거하여, 분자량 1 만 이상의 베타-글루칸을 함유하는 수용성 다당체 용액을 분리 정제하는 4단계, 상기에서 수득된 수용성 다당체 용액을 동결건조하는 5단계를 포함하는 분자량 1만 이상의 베타-글루칸을 함유하는 고분자의 수용성 다당체의 분리 정제 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 알카리는 1 내지 10 %의 수산화나트륨 용액인 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 제1단계에서 추출하는 동안 교반하거나 교반과 동시에 98 ℃의 열을 가하여 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 제2단계의 단백질 및 기타 불용성분의 침전 제거시 연속원심분리장치 및 여과장치를 이용하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 제2단계의 단백질 및 기타 불용성분의 침전제거시 중화시킨 추출물을 100 ℃에서 1 시간 가열하여 단백질을 응고시킨 후, 연속원심분리장치 및 여과장치를 이용하여 제거함을 포함하는 방법.
6. 제 4항 또는 제5항에 있어서, 침전을 제거하기 위하여 연속원심분리 장치에서 13,000 내지 15,000 rpm으로 원심 분리하는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 제4단계의 불순물 제거시, 1 만 이하의 분자량을 가지는 저분자의 당류와 무기물 등의 불순물을 제거하는 방법.
8. 제 1항에 있어서, 상기 표고버섯은 자연산 또는 인공 배양산인 방법.