CN112661868B - 一种锁阳多糖的酶法提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种锁阳多糖的酶法提取工艺，先将锁阳药材软化切成厚片，加入胃蛋白酶进行酶解辅助处理，将酶解液升温，保持微沸回流提取，过滤得上清液，重复酶解辅助提取两次，合并得酶解辅助提取上清液，脱蛋白后进行浓缩，浓缩液中加入乙醇醇沉，静置后离心分离，真空冷冻干燥后得锁阳多糖。本发明采用蛋白酶辅助酶解处理工艺，以锁阳切片为原料，通过控制不同料液比和酶解时间等工艺参数，保持了锁阳多糖较高的提取得率和纯度；在省去脱脂步骤的同时，通过延长酶解时间，也保证了较好的脱色效果，该工艺具有操作步骤简单、生产设备要求低、环境友好、提取成本低廉等优点，适合大规模工业生产使用。
Description
技术领域
本发明涉及多糖提取技术领域，具体涉及一种锁阳多糖的酶法提取工艺。
背景技术
锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)为根寄生肉质种子植物，在我国主要分布于内蒙古、甘肃、宁夏、新疆和青海等西北地区。主要有效成分有多糖、黄酮、三萜、有机酸等，具有补肾阳、益精血、润肠通便之功效。其中所含的锁阳多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖及半乳糖醛酸等聚合而成。现代研究表明锁阳多糖具有提高免疫力、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、耐缺氧、抗应激、缓解体力疲劳和抗凝活性等多种生理活性。
随着锁阳和锁阳多糖相关产品越来越受到人们的关注和重视，锁阳和锁阳多糖的需求量也逐年增加，大量采挖已造成锁阳野生资源受到破坏。因此，简化操作步骤，提高锁阳多糖的提取率和纯度，对充分利用锁阳资源、开发锁阳多糖产品很有价值。
目前已报道锁阳多糖的提取方法主要包括：热水回流提取、乙醇沉淀法；超声波辅助、微波提取法；低共熔溶剂/盐双水相萃取分离法和酶辅助提取法。文献“甘肃河西沙区锁阳多糖提取工艺优化及含量测定(罗光宏等，2011，食品科学，32(10)：79-83)”采用热水回流提取、乙醇沉淀法对锁阳多糖进行提取，并筛选了最佳工艺(料液比1:15，提取时间90min，提取次数为2次)，以最佳工艺制备的锁阳多糖，经苯酚-硫酸法测定其中所含多糖质量，并计算出甘肃省不同产地的锁阳，其多糖得率也有差别，经测量甘肃地区不同产地锁阳多糖得率范围为37.05-68.50mg/g；专利文献CN101580553A，《一种锁阳多糖的制备方法》采用超声波辅助和微波提取的方法对锁阳多糖进行提取，所得锁阳多糖的得率最高为17.8％；专利文献CN107602720A，《一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法》采用低共熔溶剂/盐双水相萃取分离法提取锁阳多糖，所得锁阳多糖的得率最高19.76％，锁阳多糖含量最高为88.90％；专利文献CN103145863A，《酶处理提取锁阳多糖的方法及锁阳多糖抗肿瘤制剂的制备》利用生物酶提取锁阳多糖的得率最高为8.91％。
传统的水提醇沉方法对锁阳多糖的提取率低，提取时间长；超声波辅助和微波提取方法相对于传统方法，提取率有所提高，但是成本较高，提取设备还有待完善；低共熔溶剂/盐双水相萃取分离法，提取工艺复杂，且使用了化学试剂磷酸氢二钾和氯化胆碱，环境危害效应大；虽然酶法辅助提取相对于传统方法，获得了较好的提取率，提高了锁阳多糖的提取量，但是现有技术中的酶法辅助提取过程包括脱脂和透析等过程，处理工序繁琐，不利于规模化生产，并且在脱脂过程中采用二氯甲烷和甲醇为脱脂试剂，增加了有机试剂使用量，生产成本高，污染环境，危害人体健康。
申请人前期对锁阳多糖的提取工艺进行了研究，并申请了专利CN104004108A，提供了一种酶解制备锁阳多糖的方法，该方法利用胃蛋白酶辅助提取锁阳多糖，所得锁阳多糖的得率最高24.30％，但是，该工艺过程复杂，锁阳粉碎过筛将增加能耗和粉尘量，并且以锁阳粉末为原料提取锁阳多糖，需要离心分离，基于工业化生产过程，需要配备大型离心机，对离心设备的技术参数要求较高，不利于工业化大批量生产；并且该工艺包括脱脂步骤，以二氯甲烷和甲醇为脱脂试剂，增加了有机试剂使用量，工艺过程复杂，设备要求高，并且有机溶剂具有易挥发性，难回收，毒性大等缺点，并且会导致有机溶剂的残留。
对于锁阳多糖产品的品质需要从颜色、提取得率和纯度三方面综合评价，提取制备的锁阳多糖的颜色浅、提取得率大于15％和纯度大于80％为最佳制备工艺。而现有技术中，采用脱脂前置处理锁阳原料，对锁阳多糖的提取率和纯度至关重要，有些现有技术为了简化步骤，也会选择省去脱脂步骤，但是会导致制备获得的锁阳多糖的收率降低、纯度不高、品相不良。申请人在实践过程中意外的发现，以锁阳为原料，省去脱脂步骤，通过控制料液比和延长酶解时间等工艺参数进行酶解辅助提取锁阳多糖，不仅能够避免使用有机试剂，降低了成本，制得的锁阳多糖的颜色为粉白色至浅肉色，保持了较好的品相；另外，与传统方法相比，保持了较高的锁阳多糖提取得率和锁阳多糖含量，提供了一种工业化生产锁阳多糖的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种锁阳多糖的酶法提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将锁阳烘干，得原料；
(2)酶解辅助提取：
a、称取步骤(1)中的原料，加入胃蛋白酶和盐酸水溶液，酶解，得酶解液；其中所述胃蛋白酶的加入量为0.5％-2.5％m/m；所述盐酸水溶液的加入量为1:8-1:12m/v，盐酸水溶液pH为1.3-1.5；所述酶解温度为30-45℃，酶解时间为8-12h；
b、将步骤a中得到的酶解液升温至微沸，保持微沸回流提取2-3h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得滤液按步骤a和步骤b所述方法重复操作两次，其中每次加入盐酸水溶液的量均为1:16-1:24m/v；
d、合并步骤b和步骤c中的滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：将步骤(2)所得的酶解辅助提取液用Sevage法脱蛋白2-4次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；所述Sevage试剂由体积比为4:1的氯仿和正丁醇组成，所述Sevage试剂与酶解辅助提取液的体积比为1:3-1:5；
(4)浓缩醇沉：将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩得浓缩液，所述浓缩液质量为水溶液的30％-60％；向浓缩液加入4倍量的无水乙醇，静置2-4h，在2-25℃，转速为3000-10000r/min条件下离心10-30min，得到锁阳多糖湿粉；
(5)冻干：将步骤(4)中所得的锁阳多糖湿粉冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
优选地，所述步骤(2)的步骤a中加入盐酸水溶液的量为1:10m/v，步骤c中两次加入盐酸水溶液的量均为1:20m/v。
优选地，所述步骤(2)的步骤a中胃蛋白酶的加入量为0.5％m/m，盐酸水溶液pH为1.5，酶解温度为40℃，酶解时间为10h；步骤b中的微沸回流提取时间为3h。
优选地，所述步骤(2)的步骤a中胃蛋白酶的加入量为0.5％m/m，盐酸水溶液pH为1.5，酶解温度为40℃，酶解时间为10h，步骤b中的微沸回流提取时间为2h。
优选地，所述步骤(2)的步骤a中胃蛋白酶的加入量为1.5％m/m，盐酸水溶液pH为1.5，酶解温度为40℃，酶解时间为12h，步骤b中的微沸回流提取时间为3h。
本发明的另一目的在于提供另一种锁阳多糖的酶法提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将锁阳烘干，得原料；
(2)酶解辅助提取：
a、称取步骤(1)中的原料，加入胃蛋白酶和盐酸水溶液，酶解，得酶解液；其中所述胃蛋白酶的加入量为0.5％-2.5％m/m；所述盐酸水溶液的加入量为1:8-1:12m/v，盐酸水溶液pH为1.3-1.5，所述酶解温度为30-45℃，酶解时间为8-12h；
b、将步骤a中得到的酶解液升温至微沸，保持微沸回流提取2-3h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得滤液按步骤a和步骤b所述方法重复操作两次，其中每次加入盐酸水溶液的量为1:32-1:48m/v和1:8-1:12m/v；
d、合并步骤b和步骤c中的滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：将步骤(2)所得的酶解辅助提取液用Sevage法脱蛋白2-4次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；所述Sevage试剂由体积比为4:1的氯仿和正丁醇组成，所述Sevage试剂与酶解辅助提取液的体积比为1:3-1:5；
(4)浓缩醇沉：将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩得浓缩液，所述浓缩液质量为水溶液的30％-60％；向浓缩液加入4倍量的无水乙醇，静置2-4h，在2-25℃，转速为3000-10000r/min条件下离心10-30min，得到锁阳多糖湿粉；
(5)冻干：将步骤(4)中所得的锁阳多糖湿粉冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
优选地，所述步骤(2)的步骤a中加入盐酸水溶液的量分别为1:10m/v，步骤c中两次加入盐酸水溶液的量分别为1:40m/v和1:10m/v。
优选地，所述步骤(2)的步骤a中胃蛋白酶的加入量为2.5％m/m，盐酸水溶液pH为1.5，酶解温度为40℃，酶解时间为10h，步骤b中的微沸回流提取时间为3h。
优选地，所述步骤(2)的步骤a中胃蛋白酶的加入量为1.5％m/m，盐酸水溶液pH为1.5，酶解温度为40℃，酶解时间为10h，步骤b中的微沸回流提取时间为3h。
优选地，所述步骤(2)的步骤a中胃蛋白酶的加入量为1.5％m/m，盐酸水溶液pH为1.5，酶解温度为40℃，酶解时间为10h，步骤b中的微沸回流提取时间为2h。
需要说明的是，本发明提到的锁阳原料为烘干的锁阳片、锁阳块等常见的锁阳药材形式。
本发明的有益效果是：①锁阳原材料软化切片或直接使用饮片，不用粉碎，节省劳动力，避免扬尘，酶解辅助提取后采用过滤替代离心分离，不需要配备大型离心机，设备要求简单，有利于大批量的工业生产；②原材料预处理省去脱脂步骤，通过控制不同料液比和酶解时间等工艺参数进行酶解辅助提取，避免使用有机试剂，有效降低了成本，且保持了较好的提取得率；③通过胃蛋白酶酶解作用以及控制不同料液比和酶解时间等，既除了多酚、色素、蛋白质等杂质，使提取得到的锁阳多糖的颜色呈浅肉色到粉白色，脱色效果良好；又能提高锁阳多糖的纯度，保持良好的水溶性，对多种剂型药品保健品的开发利用提供了良好的原料，显著提高了锁阳多糖的附加值，有利于锁阳多糖的综合开发利用；④相对于现有技术，本发明公开的酶解步骤虽然延长了酶解时间，但是通过合理安排，酶解过程可过夜进行，无需额外工作人员看护，实际缩短了实际操作时间，进一步节省了人力成本；⑤相较于传统方法，本发明制得的锁阳多糖提取得率和多糖含量显著增高，锁阳多糖提取得率最高为22.72％，多糖含量为95.44％，并且产品颜色呈浅肉色到粉白色，水溶性良好，可以添加到保健食品或药品中，用于增强免疫力。
附图说明
图1实施例9中制备的锁阳多糖的红外吸收光谱图，实施例1-8制备得到的锁阳多糖的红外吸收光谱图与图1类似。其中吸收峰说明如下：
3380.31cm-1，O-H伸缩振动吸收峰；
2929.92cm-1，C-H伸缩振动吸收峰；
1737.89cm-1，1642.42cm-1，1413.85cm-1，C＝O伸缩振动吸收峰；
1152.49cm-1，1080.16cm-1，1026.15cm-1，多糖特征吸收峰；
928.74cm-1，861.23cm-1，α-糖苷键特征吸收峰。
图2多种制备方法制备的锁阳多糖的颜色对比；其中A-I为实施例1-9制备的锁阳多糖；a-g为对比例1-7制备的锁阳多糖。
具体实施方式
下面将结合具体的实施方式对本发明进行具体的阐述，但本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
下述实施例中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；所述锁阳多糖提取得率和锁阳多糖中多糖含量的计算公式如下：
锁阳多糖提取得率＝(冻干锁阳多糖质量/锁阳切片质量)×100％；
锁阳多糖中多糖含量＝(经苯酚-硫酸法测定的多糖质量/锁阳多糖质量)×100％。
需要说明的是，本发明提到的锁阳原料为烘干的锁阳片、锁阳块等常见的锁阳药材形式。
实施例1锁阳多糖的酶法提取工艺1
1.1方法
(1)原料预处理：将锁阳软化后切成厚片，厚度为3mm，烘干；
(2)酶解辅助提取：
a、在烘干后的原料中加入胃蛋白酶1.5％m/m，再加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，进行酶解，进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间10h，得酶解液；
b、将步骤a中的酶解液微沸回流提取2h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得的滤液，按步骤a和步骤b方法重复酶解和提取两次，第一次加入pH1.5的盐酸水溶液1:40m/v，第二次加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，合并滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：在步骤(2)得到的酶解辅助提取液中加入1/4倍体积的Sevage试剂(体积比为4:1的氯仿和正丁醇)，脱蛋白3次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；
(4)将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩至原质量的40％，得浓缩液，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇进行醇沉，静置4h后，4℃，5000r/min离心20min，得到锁阳多糖湿粉，真空冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
1.2含量测定
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法提取的锁阳多糖为粉白色粉末，计算得出，锁阳多糖的提取得率为17.90％，锁阳多糖中的多糖含量为93.10％。
实施例2锁阳多糖的酶法提取工艺2
2.1方法
(1)原料预处理：将锁阳软化后切成厚片，厚度为3mm，烘干；
(2)酶解辅助提取：
a、在烘干后的原料中加入胃蛋白酶1.5％m/m，再加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，进行酶解，进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间10h，得酶解液；
b、将步骤a中的酶解液微沸回流提取3h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得的滤液，按步骤a和步骤b方法重复酶解和提取两次，第一次加入pH1.5的盐酸水溶液1:40m/v，第二次加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，合并滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：在步骤(2)得到的酶解辅助提取液中加入1/4倍体积的Sevage试剂(体积比为4:1的氯仿和正丁醇)，脱蛋白3次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；
(4)将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩至原质量的40％，得浓缩液，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇进行醇沉，静置4h后，4℃，5000r/min离心20min，得到锁阳多糖湿粉，真空冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖
2.2含量测定
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法提取的锁阳多糖为粉白色粉末，计算得出，锁阳多糖的提取得率为18.90％，锁阳多糖中的多糖含量为96.57％。
实施例3锁阳多糖的酶法提取工艺3
3.1方法
(1)原料预处理：将锁阳软化后切成厚片，厚度为3mm，烘干；
(2)酶解辅助提取：
a、在烘干后的原料中加入胃蛋白酶2.5％m/m，再加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，进行酶解，进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间10h，得酶解液；
b、将步骤a中的酶解液微沸回流提取2h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得的滤液，按步骤a和步骤b方法重复酶解和提取两次，第一次加入pH1.5的盐酸水溶液1:40m/v，第二次加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，合并滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：在步骤(2)得到的酶解辅助提取液中加入1/4倍体积的Sevage试剂(体积比为4:1的氯仿和正丁醇)，脱蛋白3次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；
(4)将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩至原质量的40％，得浓缩液，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇进行醇沉，静置4h后，4℃，5000r/min离心20min，得到锁阳多糖湿粉，真空冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖
3.2含量测定
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法提取的锁阳多糖为粉白色粉末，计算得出，锁阳多糖的提取得率为15.08％，锁阳多糖中的多糖含量为84.36％。
实施例4锁阳多糖的酶法提取工艺4
4.1方法
(1)原料预处理：将锁阳软化后切成厚片，厚度为3mm，烘干；
(2)酶解辅助提取：
a、在烘干后的原料中加入胃蛋白酶2.5％m/m，再加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，进行酶解，进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间10h，得酶解液；
b、将步骤a中的酶解液微沸回流提取3h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得的滤液，按步骤a和步骤b方法重复酶解和提取两次，第一次加入pH1.5的盐酸水溶液1:40m/v，第二次加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，合并滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：在步骤(2)得到的酶解辅助提取液中加入1/4倍体积的Sevage试剂(体积比为4:1的氯仿和正丁醇)，脱蛋白3次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；
(4)将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩至原质量的40％，得浓缩液，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇进行醇沉，静置4h后，4℃，5000r/min离心20min，得到锁阳多糖湿粉，真空冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
4.2含量测定
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法提取的锁阳多糖为粉白色粉末，计算得出，锁阳多糖的提取得率为17.00％，锁阳多糖中的多糖含量为84.93％。
实施例5锁阳多糖的酶法提取工艺5
5.1方法
(1)原料预处理：将锁阳软化后切成厚片，厚度为3mm，烘干；
(2)酶解辅助提取：
a、在烘干后的原料中加入胃蛋白酶0.5％m/m，再加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，进行酶解，进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间10h，得酶解液；
b、将步骤a中的酶解液微沸回流提取3h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得的滤液，按步骤a和步骤b方法重复酶解和提取两次，每次加入pH1.5的盐酸水溶液1:20m/v，合并滤液得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：在步骤(2)得到的酶解辅助提取液中加入1/4倍体积的Sevage试剂(体积比为4:1的氯仿和正丁醇)，脱蛋白3次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；
(4)将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩至原质量的40％，得浓缩液，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇进行醇沉，静置4h后，4℃，5000r/min离心20min，得到锁阳多糖湿粉，真空冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
5.2含量测定
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法提取的锁阳多糖为粉白色粉末，计算得出，锁阳多糖的提取得率为16.58％，锁阳多糖中的多糖含量为89.53％。
实施例6锁阳多糖的酶法提取工艺6
6.1方法
(1)原料预处理：将锁阳软化后切成厚片，厚度为3mm，烘干；
(2)酶解辅助提取：
a、在烘干后的原料中加入胃蛋白酶0.5％m/m，再加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，进行酶解，进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间10h，得酶解液；
b、将步骤a中的酶解液微沸回流提取2h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得的滤液，按步骤a和步骤b方法重复酶解和提取两次，每次加入pH1.5的盐酸水溶液1:20m/v，合并滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：在步骤(2)得到的酶解辅助提取液中加入1/4倍体积的Sevage试剂(体积比为4:1的氯仿和正丁醇)，脱蛋白3次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；
(4)将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩至原质量的40％，得浓缩液，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇进行醇沉，静置4h后，4℃，5000r/min离心20min，得到锁阳多糖湿粉，真空冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
6.2含量测定
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法提取的锁阳多糖为粉白色粉末，计算得出，锁阳多糖的提取得率为15.67％，锁阳多糖中的多糖含量为88.61％。
实施例7阳多糖的酶法提取工艺7
7.1方法
(1)原料预处理：将锁阳软化后切成厚片，厚度为3mm，烘干；
(2)酶解辅助提取：
a、在烘干后的原料中加入胃蛋白酶1.5％m/m，再加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，进行酶解，进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间12h，得酶解液；；
b、将步骤a中的酶解液微沸回流提取3h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得的滤液，按步骤a和步骤b方法重复酶解和提取两次，每次加入pH1.5的盐酸水溶液1:20m/v，合并滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：在步骤(2)得到的酶解辅助提取液中加入1/4倍体积的Sevage试剂(体积比为4:1的氯仿和正丁醇)，脱蛋白3次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；
(4)将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩至原质量的40％，得浓缩液，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇进行醇沉，静置4h后，4℃，5000r/min离心20min，得到锁阳多糖湿粉，真空冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
7.2含量测定
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法提取的锁阳多糖为粉白色粉末，计算得出，锁阳多糖的提取得率为19.81％，锁阳多糖中的多糖含量为91.42％。
实施例8锁阳多糖的酶法提取工艺8
8.1方法
(1)原料预处理：将锁阳软化后切成厚片，厚度为3mm，烘干；
(2)酶解辅助提取：
a、在烘干后的原料中加入胃蛋白酶1.5％m/m，再加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，进行酶解，进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间10h，得酶解液；
b、将步骤a中的酶解液微沸回流提取2h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得的滤液，按步骤a和步骤b方法重复酶解和提取两次，每次加入pH1.5的盐酸水溶液1:20m/v，合并滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：在步骤(2)得到的酶解辅助提取液中加入1/4倍体积的Sevage试剂(体积比为4:1的氯仿和正丁醇)，脱蛋白3次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；
(4)将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩至原质量的40％，得浓缩液，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇进行醇沉，静置4h后，4℃，5000r/min离心20min，得到锁阳多糖湿粉，真空冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
8.2含量测定
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法提取的锁阳多糖为粉白色粉末，计算得出，锁阳多糖的提取得率为21.44％，锁阳多糖中的多糖含量为94.92％。
实施例9锁阳多糖的酶法提取工艺9
9.1方法
(1)原料预处理：将锁阳软化后切成厚片，厚度为3mm，烘干；
(2)酶解辅助提取：
a、在烘干后的原料中加入胃蛋白酶1.5％m/m，再加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，进行酶解，进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间10h，得酶解液；
b、将步骤a中的酶解液微沸回流提取3h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得的滤液，按步骤a和步骤b方法重复酶解和提取两次，每次加入pH1.5的盐酸水溶液1:20m/v，合并滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：在步骤(2)得到的酶解辅助提取液中加入1/4倍体积的Sevage试剂(体积比为4:1的氯仿和正丁醇)，脱蛋白3次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；
(4)将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩至原质量的40％，得浓缩液，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇进行醇沉，静置4h后，4℃，5000r/min离心20min，得到锁阳多糖湿粉，真空冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
9.2含量测定
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法提取的锁阳多糖为粉白色粉末，计算得出，锁阳多糖的提取得率为22.72％，锁阳多糖中的多糖含量为95.44％。该方法制备得到的锁阳多糖的红外吸收光谱图如图1所示。
对比例1传统方法最佳工艺条件制备锁阳多糖
参照罗光宏等(2011，甘肃河西沙区锁阳多糖提取工艺优化及含量测定，食品科学，32(10):79-83)方法，改进最佳工艺条件，制备方法如下：称取脱脂干燥锁阳粉末2.00g于圆底烧瓶中，按料液比(W/V)1:30加入蒸馏水，保持微沸回流提取3次，每次2h，趁热抽滤，合并滤液，按Sevage法(氯仿：正丁醇4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，将所得沉淀冷冻干燥，得锁阳多糖。
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法制备的锁阳多糖的颜色为棕红色，锁阳多糖提取得率为7.10％，多糖含量为71.73％。
对比例2胃蛋白酶辅助酶解制备锁阳多糖
称取脱脂干燥锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1:80加入160ml pH 1.5的盐酸水溶液，于40℃酶解5h，保持微沸回流1h使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，将沉淀经冷冻干燥后，得锁阳多糖。
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法制备的锁阳多糖的颜色为粉白色，锁阳多糖的提取得率为24.30％，多糖含量为94.63％。
对比例3以锁阳粉末为原料简单省去脱脂步骤制备锁阳多糖
称取干燥的锁阳粉末2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1:80加入160ml pH 1.5的盐酸水溶液，于40℃酶解5h，保持微沸回流1h，使胃蛋白酶灭活，放置冷却后离心(5000r/min，20min，4℃)，上清液按Sevage法(氯仿:正丁醇4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，将沉淀经冷冻干燥后，得锁阳多糖。
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法制备的锁阳多糖的颜色为浅棕黄色，锁阳多糖的提取得率为17.44％，多糖含量为85.20％。
对比例4以锁阳切片为原料简单省去脱脂步骤制备锁阳多糖
称取干燥的锁阳切片2.00g于具塞三角瓶中，按酶用量2％加入40.0mg胃蛋白酶，按料液比(W/V)1:80加入160ml，pH 1.5的盐酸水溶液，于40℃酶解5h，保持微沸回流1h，使胃蛋白酶灭活，放置冷却后过滤，滤液按Sevage法(氯仿:正丁醇4:1)脱除蛋白质共3次，弃去下层有机相，上层水溶液减压旋转蒸发浓缩至小体积，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，4℃冰箱静置过夜，离心(5000r/min，20min，4℃)，所得沉淀用无水乙醇洗涤，离心(5000r/min，20min，4℃)，将沉淀经冷冻干燥后，得锁阳多糖。
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法制备的锁阳多糖的颜色为浅棕红色，锁阳多糖的提取得率为12.32％，多糖含量为72.04％。
对比例5锁阳多糖的酶法提取工艺10
5.1方法
(1)原料烘干：将锁阳软化后切成厚片，厚度为3mm，烘干；
(2)酶解辅助提取：
a、在烘干后的原料中加入胃蛋白酶1.5％m/m，再加入pH 1.5的盐酸水溶液1:20m/v，进行酶解，进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间10h，得酶解液；
b、将步骤a中的酶解液微沸回流提取2h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得的滤液，按步骤a和步骤b所述方法重复操作两次，合并滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：在步骤(2)得到的酶解辅助提取液中加入1/4倍体积的Sevage试剂(体积比为4:1的氯仿和正丁醇)，脱蛋白3次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；
(4)将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩至原质量的40％，得浓缩液，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇进行醇沉，静置4h后，4℃，5000r/min离心20min，得到锁阳多糖湿粉，真空冷冻干燥，即得锁阳多糖。
5.2含量测定
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法提取的锁阳多糖为棕黄色粉末，计算得出，锁阳多糖的提取得率为10.06％，锁阳多糖中的多糖含量为93.12％。
对比例6锁阳多糖的酶法提取工艺11
6.1方法
(1)原料预处理：将锁阳软化后切成厚片，厚度为3mm，烘干；
(2)酶解辅助提取：
a、在烘干后的原料中加入胃蛋白酶0.5％m/m，再加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，进行酶解，进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间10h，得酶解液；
b、将步骤a中的酶解液微沸回流提取3h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得的滤液，按步骤a和步骤b所述方法重复操作两次，第一次加入pH1.5的盐酸水溶液1:40m/v，第二次加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，合并滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：在步骤(2)得到的酶解辅助提取液中加入1/4倍体积的Sevage试剂(体积比为4:1的氯仿和正丁醇)，脱蛋白3次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；
(4)将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩至原质量的40％，得浓缩液，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇进行醇沉，静置4h后，4℃，5000r/min离心20min，得到锁阳多糖湿粉，真空冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
6.2含量测定
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法提取的锁阳多糖为浅棕黄色粉末，计算得出，锁阳多糖的提取得率为13.80％，锁阳多糖中的多糖含量为89.75％。
对比例7锁阳多糖的酶法提取工艺12
7.1方法
(1)原料预处理：将锁阳软化后切成厚片，厚度为3mm，烘干；
(2)酶解辅助提取：
a、在烘干后的原料中加入胃蛋白酶2.5％m/m，再加入pH 1.5的盐酸水溶液1:10m/v，进行酶解，进行酶解，酶解温度40℃，酶解时间10h，得酶解液；
b、将步骤a中的酶解液微沸回流提取3h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得的滤液，按步骤a和步骤b所述方法重复操作两次，每次加入pH 1.5的盐酸水溶液1:20m/v，合并滤液，得酶解辅助提取液；
(3)脱蛋白：在步骤(2)得到的酶解辅助提取液中加入1/4倍体积的Sevage试剂(体积比为4:1的氯仿和正丁醇)，脱蛋白3次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；
(4)将步骤(3)所得的水溶液减压浓缩至原质量的40％，得浓缩液，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇进行醇沉，静置4h后，4℃，5000r/min离心20min，得到锁阳多糖湿粉，真空冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
7.2含量测定
称取上述锁阳多糖的质量，计算锁阳多糖提取得率；精确称取锁阳多糖100mg，溶于适量的蒸馏水中，于100ml容量瓶中定容，取样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，重复三次。
该方法提取的锁阳多糖为浅棕黄色粉末，计算得出，锁阳多糖的提取得率为11.22％，锁阳多糖中的多糖含量为89.28％。
分别采用实施例1-9和对比例1-7的方法提取锁阳多糖，计算提取得率，并按苯酚-硫酸法检测多糖含量，结果数据见表1。
表1实施例1-9和对比例1-7数据对比
| 组别 | 颜色 | 锁阳多糖提取得率/％ | 多糖含量/％ |
| 实施例1 | 浅肉色 | 17.90±1.06 | 93.10±0.47 |
| 实施例2 | 粉白色 | 18.90±0.75 | 96.57±0.49 |
| 实施例3 | 浅肉色 | 15.08±0.95 | 84.36±0.41 |
| 实施例4 | 浅肉色 | 17.00±1.33 | 84.93±0.26 |
| 实施例5 | 浅肉色 | 16.58±1.16 | 89.53±0.43 |
| 实施例6 | 浅肉色 | 15.67±0.76 | 88.61±0.35 |
| 实施例7 | 粉白色 | 19.81±0.95 | 91.42±0.29 |
| 实施例8 | 粉白色 | 21.44±1.14 | 94.92±0.37 |
| 实施例9 | 粉白色 | 22.72±0.91 | 95.44±0.36 |
| 对比例1 | 棕红色 | 7.10±1.23 | 71.73±0.26 |
| 对比例2 | 粉白色 | 24.30±0.64 | 94.63±0.37 |
| 对比例3 | 浅棕黄色 | 17.44±1.04 | 85.20±0.42 |
| 对比例4 | 浅棕红色 | 12.32±0.78 | 72.04±0.39 |
| 对比例5 | 棕黄色 | 10.06±1.10 | 93.12±0.57 |
| 对比例6 | 浅棕黄色 | 13.80±0.88 | 89.75±0.38 |
| 对比例7 | 浅棕黄色 | 11.22±0.99 | 89.28±0.32 |
从实施例1-9和对比例1-7可以看出，相对于传统方法，本发明省去粉碎过筛和脱脂处理，采用锁阳切片，通过胃蛋白酶酶解辅助提取、Sevage法脱蛋白及醇沉处理，并通过控制料液比和酶解时间等工艺参数，制备得到的锁阳多糖颜色为浅肉色到粉白色，脱色效果好，并且提取得率和多糖含量高，提高了锁阳多糖的纯度，保持了较好的水溶性。对比例1和对比例3-7制备的锁阳多糖的脱色效果差，并影响了锁阳多糖产品的颜色、提取得率和纯度。而本发明实施例9和对比例1的传统水提醇沉方法相比，提取得率和多糖含量分别提高了220％和32％；本发明实施例9和以锁阳粉末为原料简单省去脱脂步骤制备锁阳多糖的对比例3相比，提取得率和多糖含量分别提高了30.28％和12.02％；本发明实施例9和以锁阳粉切片为原料简单省去脱脂步骤制备锁阳多糖的对比例4相比，提取得率和多糖含量分别提高了84.42％和32.48％；而且本发明实施例9和对比例2的胃蛋白酶辅助酶解方法相比，提取得率和多糖含量均相当。本发明实施例1-9和对比例5-7相比，虽然均为酶法提取工艺，但料液比、酶用量和酶解提取时间等未采用合适的工艺参数，锁阳多糖产品的颜色不佳、提取得率偏低。从以上结果可以看出，本发明提出的提取工艺与对比例2相比，在省去脱脂步骤，简化步骤，节约设备，避免有机试剂使用的情况下，以锁阳切片为原料，通过控制料液配比和酶解时间等技术方案，且保持了较好的脱色效果，保持了较高的提取率和纯度，保持了锁阳多糖良好的水溶性。因此，本发明提供的锁阳多糖的酶法提取工艺，具有操作过程简单易行、对设备要求低的优点，有利于工业化的大批量生产，并且制备的锁阳多糖颜色为粉白色，纯度高，具有良好的水溶性，可以添加到保健食品或药品中，用于增强免疫力。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (5)
1.一种锁阳多糖的酶法提取工艺，其特征在于，所述步骤如下：
（1）将锁阳软化后切成厚度为3 mm的厚片，烘干得原料；
（2）酶解辅助提取：
a、称取步骤（1）中的原料，加入胃蛋白酶和盐酸水溶液，酶解，得酶解液；其中所述胃蛋白酶的加入量为1.5% m/m；所述盐酸水溶液的加入量为1:10 m/v，盐酸水溶液pH为1.5；所述酶解温度为40℃，酶解时间为10-12 h；
b、将步骤a中得到的酶解液升温至微沸，保持微沸回流提取2-3 h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得滤渣按步骤a和步骤b所述方法重复操作两次，其中每次加入盐酸水溶液的量均为1:20m/v；
d、合并步骤b和步骤c中的滤液，得酶解辅助提取液；
（3）脱蛋白：将步骤（2）所得的酶解辅助提取液用Sevage法脱蛋白2-4次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；所述Sevage试剂由体积比为4:1的氯仿和正丁醇组成，所述Sevage试剂与酶解辅助提取液的体积比为1:3-1:5；
（4）浓缩醇沉：将步骤（3）所得的水溶液减压浓缩得浓缩液，所述浓缩液质量为水溶液的30%-60%；向浓缩液加入4倍量的无水乙醇，静置2-4 h，在2-25℃，转速为5000 r/min条件下离心20 min，得到锁阳多糖湿粉；
（5）冻干：将步骤（4）中所得的锁阳多糖湿粉冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
2.如权利要求1所述的锁阳多糖的酶法提取工艺，其特征在于，所述步骤（2）的步骤a中胃蛋白酶的加入量为1.5% m/m，盐酸水溶液pH为1.5，酶解温度为40℃，酶解时间为12 h，步骤b中的微沸回流提取时间为3 h。
3.如权利要求1所述的锁阳多糖的酶法提取工艺，其特征在于，所述步骤（2）的步骤a中胃蛋白酶的加入量为1.5% m/m，盐酸水溶液pH为1.5，酶解温度为40℃，酶解时间为10 h，步骤b中的微沸回流提取时间为3 h。
4.如权利要求1所述的锁阳多糖的酶法提取工艺，其特征在于，所述步骤（2）的步骤a中胃蛋白酶的加入量为1.5% m/m，盐酸水溶液pH为1.5，酶解温度为40℃，酶解时间为10 h，步骤b中的微沸回流提取时间为2 h。
5.一种锁阳多糖的酶法提取工艺，其特征在于，所述步骤如下：
（1）将锁阳软化后切成厚度为3 mm的厚片，烘干得原料；
（2）酶解辅助提取：
a、称取步骤（1）中的原料，加入胃蛋白酶和盐酸水溶液，酶解，得酶解液；其中所述胃蛋白酶的加入量为1.5%m/m；所述盐酸水溶液的加入量为1:10m/v，盐酸水溶液pH为1.5，所述酶解温度为40℃，酶解时间为10h；
b、将步骤a中得到的酶解液升温至微沸，保持微沸回流提取3 h，过滤，得滤液；
c、将步骤b所得滤渣按步骤a和步骤b所述方法重复操作两次，其中每次加入盐酸水溶液的量为1:40m/v和1:10 m/v；
d、合并步骤b和步骤c中的滤液，得酶解辅助提取液；
（3）脱蛋白：将步骤（2）所得的酶解辅助提取液用Sevage法脱蛋白2-4次，弃去下层有机相，合并上层得水溶液；所述Sevage试剂由体积比为4:1的氯仿和正丁醇组成，所述Sevage试剂与酶解辅助提取液的体积比为1:3-1:5；
（4）浓缩醇沉：将步骤（3）所得的水溶液减压浓缩得浓缩液，所述浓缩液质量为水溶液的30%-60%；向浓缩液加入4倍量的无水乙醇，静置2-4 h，在2-25℃，转速为5000 r/min条件下离心20 min，得到锁阳多糖湿粉；
（5）冻干：将步骤（4）中所得的锁阳多糖湿粉冷冻干燥，即得所述的锁阳多糖。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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