CN104945531B - 一种龙胆酸性均一多糖及其提纯方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种龙胆酸性均一多糖及其提纯方法和应用，属于龙胆酸性均一多糖提纯领域。所述龙胆酸性均一多糖，包括如下组分的单糖及其摩尔百分含量：1‑1.5％岩藻糖、11‑12％鼠李糖、22‑23％阿拉伯糖、17‑18％半乳糖、3‑3.5％葡萄糖、3‑3.5％木糖、0.5‑1％甘露糖、39‑40％半乳糖醛酸。本发明实现了对龙胆多糖的进一步分离纯化，获得了重均分子量为5.8×10⁴Da的龙胆酸性均一多糖，其抗凝血活性高，制备方法简单，避免了残留的化学试剂存在的安全隐患，具有良好的开发应用前景。

Description

一种龙胆酸性均一多糖及其提纯方法和应用

技术领域

本发明属于龙胆多糖提纯技术领域，具体涉及一种龙胆酸性均一多糖及其提纯方法和应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高及饮食结构的改变，心脑血管疾病已成为继癌症死亡后的主要原因。大多数血栓患者在手术期间需要抗凝血治疗。而肝素是最常见的用于临床治疗的抗凝血药物，在上述疾病治疗中发挥着十分重要的作用。然而，肝素的生产大多来源于动物脏器，有携带致病微生物以及动物致敏原、致热原的隐患，可能对人体健康造成危害。此外，肝素的使用常常伴随着一些副作用如：易引起出血、高血钾症、肝素诱导性血小板减少症等。因此，从天然产物中寻找抗凝血活性成分，或将其主结构作为先导化合物进而研发新药，或开发功能性食品，具有毒性小、研发费用低、周期短和全民保健的优势。

中药龙胆为龙胆科(Gentianaceae)植物，条叶龙胆(Gentiana manshuricaKitag.)、龙胆(Gentiana scabra Bunge.)、三花龙胆(Gentiana triflora pall.)或滇龙胆(Gentiana rigescens Franch.)的干燥根及根茎。前三种习称“龙胆”，后一种习称“坚龙胆”。条叶龙胆又名东北龙胆，分布于黑龙江、吉林、辽宁、山西、陕西、山东等省区；坚龙胆分布于云南、四川、贵州、湖南、广西等省区；三花龙胆分布于东北及华北地区、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等省区。现代药理研究表明，龙胆具有保肝、利胆、健胃、降压、抗炎、抗过敏、抗病原体、增强免疫功能等多种药理活性，广泛地应用于临床。龙胆中含有裂环环烯醚萜类、环烯萜类化合物、生物碱、挥发油、多糖等成分。其中，多糖为龙胆有效成分之一，具有多种生物活性。

王金宏报道龙胆中植物多糖具有一定的保肝作用、降血压功效及可增强小鼠的非特异性免疫功能和特异性体液免疫功能[王金宏.龙胆中植物多糖保肝、降血脂及免疫调节作用的研究[D].哈尔滨：哈尔滨商业大学,2012.]。王晨瑜在体内抗肿瘤研究中发现龙胆多糖含量为100mg/Kg时，抑瘤率较高，可达65.76％，由此说明龙胆多糖有明显的体内抗肿瘤活性[王晨瑜.龙胆多糖的制备及生物活性分析[D].抚顺：辽宁石油化工大学,2014.]。江蔚新、赵玺发现龙胆粗多糖具有抗凝血活性[江蔚新,赵玺.龙胆多糖的抗凝血作用的研究[J].黑龙江医药,2008(05):31-32.]。目前对龙胆多糖主要集中在提取及其他生物活性的研究，而对龙胆多糖的分离纯化报道较少，对其组分分子量的测定和抗凝血活性的研究却尚未报道。

传统龙胆多糖的提取方法多为水提醇沉法，所得龙胆粗多糖往往含有蛋白质、色素、小分子可溶性物质等，这直接影响到产品的质量，所以粗多糖必须经过进一步的纯化，才能研究其抗凝血的作用机制。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明提出一种龙胆酸性均一多糖及其提纯方法和应用，解决了现有龙胆多糖往往含有蛋白质、色素、小分子可溶性物质的难题，制得的龙胆酸性均一多糖纯度高，同时其抗凝血活性高，具有良好的抗凝血效果且安全无毒。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种龙胆酸性均一多糖，包括如下组分的单糖及其摩尔百分含量：1-1.5％岩藻糖、11-12％鼠李糖、22-23％阿拉伯糖、17-18％半乳糖、3-3.5％葡萄糖、3-3.5％木糖、0.5-1％甘露糖、39-40％半乳糖醛酸。

所述龙胆酸性均一多糖的提纯方法，该方法是将龙胆根原料除杂洗净干燥后粉碎，经热水浸提，旋蒸浓缩，乙醇沉淀，冷冻干燥后得到龙胆粗提物，龙胆粗提物经树脂脱蛋白、脱色，然后进行层析，先用蒸馏水洗脱，再用NaCl溶液阶段洗脱，收集NaCl洗脱液，真空浓缩后用蒸馏水透析，将其冻干得到龙胆酸性均一多糖。

所述提纯方法具体包括以下步骤：

步骤一，粉碎：将龙胆根除杂洗净后烘干、粉碎、过筛，得到龙胆粉末；

步骤二，水提：将所述龙胆粉末与蒸馏水按料液的质量体积比1:15g/mL～1:35g/mL在60～100℃水浴条件下浸提1.5～3.5h，抽滤后，得到龙胆水提液；

步骤三，浓缩：将所述龙胆水提液在40～65℃条件下真空浓缩得到浓缩液；所述的浓缩液是真空浓缩至原体积的20％，目的是为了减少乙醇的用量，减少后续的离心次数。

步骤四，醇沉：在所述浓缩液中加入2～4倍体积无水乙醇搅拌后，在2～6℃下沉淀6～14h，离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀2～5次，然后将沉淀加水复溶，去除无水乙醇，得到龙胆粗提物；

步骤五，脱蛋白：将所述龙胆粗提物配制成0.5mg/mL～1.5mg/mL水溶液加入树脂后振摇，再抽滤将树脂和溶液分离，收集脱蛋白后的溶液加无水乙醇沉淀，并冷冻干燥，得到脱蛋白龙胆粗提物；

步骤六，脱色：将步骤五得到的脱蛋白龙胆粗提物配制成2mg/mL～4mg/mL水溶液，调pH为5～7，加入大孔吸附树脂振揺，抽滤将树脂和溶液分离，收集脱色后溶液加入无水乙醇沉淀，经冷冻干燥后得到龙胆粗多糖；

步骤七，层析：将步骤六得到的龙胆粗多糖溶于蒸馏水中，离心除去不溶物，所得溶液加入层析柱，先用蒸馏水洗脱，再用浓度逐渐增大的NaCl溶液阶段洗脱，流速为0.5mL/min～3mL/min，收集洗脱液，真空浓缩后透析2～4d，冻干得到龙胆酸性均一多糖。优选的，所述层析柱采用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱。

所述龙胆酸性均一多糖的重均分子量为5.8×10⁴Da(道尔顿)。此为首次得到的此分子量的龙胆多糖组分(酸性多糖)，此分子量的龙胆酸性均一多糖具有较高的抗凝血活性。

优选的，步骤二中所述龙胆粉末与蒸馏水按料液的质量体积比1:25g/mL进行浸提。此为料液的质量体积比单因素条件下进行的响应面优化设计。

优选的，步骤五中所述树脂为聚酰胺。更优选的是，采用80目～100目聚酰胺。此树脂不仅可以除去龙胆多糖中大部分的游离蛋白质，而且使用该法具有多糖保留率高、成本低、对环境友好等优点。

优选的，步骤六中所述大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂。此树脂脱色效果良好且保持了龙胆多糖的原始结构。

优选的，步骤七中所述NaCl溶液阶段洗脱的NaCl浓度为0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L。能够较好的探寻出龙胆酸性多糖洗脱出来的浓度，在此NaCl浓度下主要得到0.1mol/L、0.2mol/L洗脱出来的龙胆酸性多糖。

优选的，步骤七中所述收集洗脱液为收集0.2mol/L的NaCl溶液洗脱液。该NaCl浓度下得到的龙胆酸性多糖具有较高的抗凝血活性。

相应的，本发明还提供了龙胆酸性均一多糖在功能性食品和医学上用于制备具有抗凝血作用的药物中的应用。

本发明有益效果是：(1)本发明实现了对龙胆多糖的进一步分离纯化，获得了重均分子量为5.8×10⁴Da的龙胆酸性均一多糖，经体外抗凝血活性实验证明该多糖组分具有良好的抗凝血效果。

(2)本发明操作简单可行，能耗小，获得的龙胆酸性均一多糖抗凝血活性高，先利用水提醇沉法得到龙胆粗提物，再利用树脂法有效除去龙胆多糖中的蛋白质和色素，且保留了多糖的原始结构，避免了残留的化学试剂存在的安全隐患，再结合DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱的洗脱层析，进一步分离纯化得到高纯度的龙胆酸性均一多糖，可用于药品、保健营养品的原料或添加剂，如胶囊剂、片剂、口服液等。该多糖安全无毒，具有良好的开发应用前景。

附图说明

下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：

图1是本发明所述龙胆多糖经DEAE-Sepharose CL-6B的洗脱曲线图；

图2是本发明龙胆酸性均一多糖的高效凝胶渗透色谱图。

图3是单糖标样的离子色谱分析图谱；

图4是本发明实施例1得到的龙胆酸性均一多糖GSP-3的离子色谱分析图谱。

图3和图4中，1、岩藻糖，2、氨基葡萄糖，3、鼠李糖，4、阿拉伯糖，5、氨基半乳糖，6、半乳糖，7、葡萄糖，8、木糖，9、甘露糖，10、果糖，11、核糖，12、半乳糖醛酸，13、葡萄糖醛酸。

具体实施方式

下面对照附图，通过对实施例的描述，本发明的具体实施方式如所涉及的各部分的作用及原理、制造工艺及方法等，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

实施例1：

一种龙胆酸性均一多糖，包括如下组分的单糖及其摩尔百分含量：岩藻糖1.1％、鼠李糖11.5％、阿拉伯糖22.5％、半乳糖17.9％、葡萄糖3.3％、木糖3.1％、甘露糖0.7％、半乳糖醛酸39.9％。具体制备方法如下：

多糖提取

将龙胆根除杂洗净后在60℃的烘箱中烘干，然后用粉碎机粉碎，过80目筛，得到龙胆粉末，将龙胆粉末与蒸馏水按料液的质量体积比1:25g/mL在90℃下浸提3h，抽滤后，得到滤液，将滤液在55℃条件下真空浓缩至原体积的20％(目的是为了减少乙醇的用量，减少后续的离心次数)，得到浓缩液，缓慢加入4倍体积的无水乙醇并不断搅拌，并将其置于4℃的冰箱过夜沉淀12h，4000rpm，15min离心后收集沉淀，并用无水乙醇洗涤沉淀3次，以除去脂溶性杂质，然后将沉淀加水复溶，用旋转蒸发器去除酒精后，冷冻干燥得到龙胆粗提物。

将得到的龙胆粗提物配成浓度为1mg/mL的水溶液，加入80目～100目的聚酰胺，其龙胆粗提物与聚酰胺的质量比为25:2mg/g，在室温下摇床振揺3h，转速为120r/min，使树脂吸附溶液成分。振荡结束后，抽滤将树脂和溶液分离，收集脱蛋白后的溶液加入4倍体积的无水乙醇沉淀，并冷冻干燥得到脱蛋白后的龙胆粗提物。然后将其配成3mg/mL的水溶液，以蒸馏水与浓盐酸按体积比配制成体积分数为1％的盐酸溶液，用此1％的盐酸溶液调节3mg/mL的脱蛋白后的龙胆粗提物水溶液的pH为6，加入AB-8大孔吸附树脂，其脱蛋白后的龙胆粗提物与AB-8大孔吸附树脂的质量比为24:1mg/g，55℃摇床振揺3h，转速为120r/min。振荡结束后，抽滤将树脂和溶液分离，收集脱色后的溶液,以氢氧化钠与蒸馏水按质量比配制成质量分数为1％的氢氧化钠溶液，用此1％的氢氧化钠溶液将收集后的滤液调到pH为7，加入4倍体积的无水乙醇沉淀，经冷冻干燥后得到龙胆粗多糖。

多糖纯化

准确称取80mg龙胆粗多糖溶于9mL蒸馏水中，10000r/min离心20min，除去不溶物，溶液上DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱(1.6×60cm)，先用蒸馏水洗脱，再用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L NaCl溶液阶段洗脱，流速为1.6mL/min，每管收集8mL。洗脱液用部分收集器收集，苯酚-硫酸法在波长为490nm处检测多糖含量，并以试管的管号为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线，如图1所示，得到3个洗脱组分GSP-1、GSP-2和GSP-3，收集0.2mol/L NaCl洗脱液，真空浓缩后用蒸馏水透析3d(每天换3次水)，以除去小分子杂质，然后将其冻干得到龙胆酸性均一多糖。采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定龙胆酸性均一多糖的重均分子量为5.8×10⁴Da。采用配有脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)测定其单糖组成，采用此方法测定其单糖组成，试验可根据相应单糖标准样品的相对保留时间进行定性，根据相应单糖标准曲线计算各种单糖的浓度来定量，可确定多糖中各种单糖的百分比。如图3和4所示，由此确定龙胆酸性均一多糖GSP-3由8种单糖组成，分别为：岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸。且其摩尔百分比分别为1.1％，11.5％，22.5％，17.9％，3.3％，3.1％，0.7％，39.9％。

龙胆酸性均一多糖体外抗凝血活性实验

对上述得到的龙胆酸性均一多糖进行了体外抗凝血活性实验。具体方法和结果如下：

1.样本的收集和样品的处理

将从健康志愿者获得的血与3.8％的柠檬酸钠按体积比9:1混合均匀，经3600r/min离心15min后取上清液，将其置于塑料离心管内，制得贫血小板血浆，冰箱中保存备用。将待测血浆与多糖样品按4:1体积比混合均匀，生理盐水和肝素钠分别作为阴性和阳性对照。

2.观察指标

采用医学上常用来确定凝血途径的3项指标：活化部分凝血活酶时间(APTT)，凝血酶原时间(PT)，凝血酶时间(TT)。

3.数据处理

本实验对各指标测得的结果采用Minitab 15软件进行统计学分析，并采用t-t配对进行显著性差异分析。

4.实验方法

龙胆酸性均一多糖对活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响

取待测血浆与多糖样品的混合溶液50μL，37℃预温3min，然后加入37℃预温的APTT试剂50μL，将其置于37℃预温5min。最后加入已经在37℃预温的0.025mol/L CaCl₂溶液50μL，并记录仪器测定结果。

4.1龙胆酸性均一多糖对凝血酶原时间(PT)的影响

取待测血浆与多糖样品的混合溶液50μL，经37℃预温3min后，最后加入37℃预温的PT试剂100μL，并记录仪器测定结果。

4.2龙胆酸性均一多糖对凝血酶时间(TT)的影响

取待测血浆与多糖样品的混合溶液50μL，经37℃预温3min后，最后加入37℃预温的TT试剂50μL，并记录仪器测定结果。

5.实验结果

表1龙胆酸性均一多糖GSP-3的体外抗凝血活性实验结果

注：表1中数据为平均值±标准差，数据取n＝6。其中：**表示与生理盐水相比P≤0.01；*表示与生理盐水相比0.01＜P≤0.05。

从表1的结果可以看出，与阴性对照的生理盐水相比，在实验浓度下，龙胆酸性均一多糖GSP-3可以延长APTT和TT，且具有剂量依赖效应，但对PT没有影响。这表明龙胆酸性均一多糖GSP-3通过参与内源性凝血途径并且进一步将血浆纤维蛋白原转变为纤维蛋白来发挥抗凝血效果，由此证明了其具有抗凝血活性。

实施例2

抗凝血保健品—龙胆饮料的制备

按重量份计，水与龙胆粗粉的比例为1～15:100，萃取温度为75～95℃，时间5～30分钟，浸提后用250目尼龙布过滤除渣，迅速冷却至5℃，放置24h澄清，0.5μm精滤获得澄清龙胆汁。将0.04-0.2％龙胆酸性均一多糖GSP-3，3-6％蔗糖，0.03-0.07％抗坏血酸等辅料先用部分温水溶化、过滤。与上述精滤龙胆汁混合，135℃灭菌5-7s，装瓶制得抗凝血保健龙胆饮料。

实施例3

抗凝血药物的制备

取4g龙胆酸性均一多糖GSP-3，500g微晶纤维素，450g糊精，75g低取代羟丙甲纤维素，75％乙醇75mL，硬脂酸镁5g，用湿法制粒压片法压2000片。

颗粒剂：取4g龙胆酸性均一多糖GSP-3，1400g糊精，100g糖粉，50g酒石酸，50％乙醇适量，用湿法制粒经过筛、混合制软材、挤压成粒，60℃干燥，整粒后包装，每袋2-5g。

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种龙胆酸性均一多糖，包括如下组分的单糖及其摩尔百分含量：1-1.5％岩藻糖、11-12％鼠李糖、22-23％阿拉伯糖、17-18％半乳糖、3-3.5％葡萄糖、3-3.5％木糖、0.5-1％甘露糖、39-40％半乳糖醛酸。

2.根据权利要求1所述龙胆酸性均一多糖的制备方法，其特征在于，该方法是将龙胆根原料除杂洗净干燥后粉碎，经热水浸提，旋蒸浓缩，乙醇沉淀，冷冻干燥后得到龙胆粗提物，龙胆粗提物经树脂脱蛋白、脱色，然后进行层析，先用蒸馏水洗脱，再用NaCl溶液阶段洗脱，收集NaCl洗脱液，真空浓缩后用蒸馏水透析，将其冻干得到龙胆酸性均一多糖。

3.根据权利要求2所述龙胆酸性均一多糖的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：

步骤一，粉碎：将龙胆根除杂洗净后烘干、粉碎，过筛，得到龙胆粉末；

步骤二，水提：将所述龙胆粉末与蒸馏水按料液的质量体积比1:15g/mL～1:35g/mL在60～100℃水浴条件下浸提1.5～3.5h，抽滤后，得到龙胆水提液；

步骤三，浓缩：将所述龙胆水提液在40～65℃条件下真空浓缩得到浓缩液；

步骤四，醇沉：在所述浓缩液中加入2～4倍体积无水乙醇搅拌后，在2～6℃下沉淀6～14h，离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀2～5次，然后将沉淀加水复溶，去除无水乙醇，得到龙胆粗提物；

步骤五，脱蛋白：将所述龙胆粗提物配制成0.5mg/mL～1.5mg/mL水溶液加入树脂后振摇，再抽滤将树脂和溶液分离，收集脱蛋白后的溶液加无水乙醇沉淀，并冷冻干燥，得到脱蛋白龙胆粗提物；

步骤六，脱色：将步骤五得到的脱蛋白龙胆粗提物配制成2mg/mL～4mg/mL水溶液，调pH为5～7，加入大孔吸附树脂振揺，抽滤将树脂和溶液分离，收集脱色后溶液加入无水乙醇沉淀，经冷冻干燥后得到龙胆粗多糖；

步骤七，层析：将步骤六得到的龙胆粗多糖溶于蒸馏水中，离心除去不溶物，所得溶液加入层析柱，先用蒸馏水洗脱，再用浓度逐渐增大的NaCl溶液阶段洗脱，流速为0.5mL/min～3mL/min，收集洗脱液，真空浓缩后透析2～4d，冻干得到龙胆酸性均一多糖。

4.根据权利要求3所述龙胆酸性均一多糖的制备方法，其特征在于，所述龙胆酸性均一多糖的重均分子量为5.8×10⁴Da。

5.根据权利要求3所述龙胆酸性均一多糖的制备方法，其特征在于，步骤五中所述树脂为聚酰胺。

6.根据权利要求3所述龙胆酸性均一多糖的制备方法，其特征在于，步骤六中所述大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂。

7.根据权利要求3所述龙胆酸性均一多糖的制备方法，其特征在于，步骤七中所述NaCl溶液阶段洗脱的NaCl浓度为0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L。

8.根据权利要求7所述龙胆酸性均一多糖的制备方法，其特征在于，步骤七中所述收集洗脱液为收集0.2mol/L的NaCl溶液洗脱液。

9.权利要求1所述龙胆酸性均一多糖在功能性食品中的应用。

10.权利要求1所述龙胆酸性均一多糖在制备具有抗凝血作用的药物中的应用。