CN108727509B - 一种毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖及其制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖及其制备和用途。该毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖由重量百分含量为99％以上的多糖组成；多糖的组成为半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸，其物质的量之比为6.80‑8.50:5.50‑7.30:1.10‑1.90:0.70‑1.30。该毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖的制备方法，包括：水提醇沉提取毛竹笋壳粗多糖，经酶‑Sevage结合法去蛋白、透析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化，真空冷冻干燥分离纯化组分得到毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖。本发明对纯化后多糖进行组分分析、结构鉴定及免疫功能研究，发现本发明毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖有明显的降血糖活性，可以作为降血糖功能品，也可用于制备降血糖功能品，可广泛用于食品、保健品、动物饲料、医药等领域。

Description

一种毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖及其制备和用途

技术领域

本发明涉及植物多糖领域，具体涉及一种毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖及其制备和用途，属于高分子和分子生物学领域。

背景技术

毛竹笋(Phyllostachys heterocycla bamboo shoot)，属于禾本科竹亚科，是一种快速增长的多功能林业植物，在中国、日本和其他亚洲国家，栽培及食用的历史悠久，被广泛应用于建材、家具、纸张、筷子和食物来源等方面。竹笋味甘性微寒，具有抗氧化、保肝、降血糖、降血脂、消炎、抗疲劳及调节免疫力等生物学功效。每年新鲜出土的毛竹笋，主要被加工成传统笋保鲜食品和风味笋等方面，其利用率仅在30％左右，剩余部分如笋蔀头、笋壳等大多作为废弃物丢弃。国内外科研人员研究发现笋壳中含有丰富的活性成分，包括多糖、黄酮、色素、甾醇和过氧化物酶等天然产物，仍然具有一定的增强免疫、抗氧化、抗衰老、清除自由基等生物作用。笋蔀头、笋壳等作为竹笋加工剩余物大量被废弃，造成了资源的极大浪费，同时带来了环境压力，开发再利用笋壳资源，提取其有效活性多糖物质，不仅能够实现笋壳资源的高值化利用，同时在保健食品和医药研究等方面也具有广阔的应用前景。

Zheng等人通过热水浸提的方法提取台湾绿竹笋壳中的粗多糖，并对其进行分离、纯化得到均一多糖，分别利用高效液相色谱联用多角度激光散射(HPSEC-MALLS)和气相色谱法(GC)确定其分子量为1.63×10⁴kDa，由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖在摩尔比为20.4:4.9:1:3.4:20.6的条件下组成，利用粗多糖进行动物性试验发现其具有明显的降血糖功能(Zheng Y,Zhang S,Wang Q,et al.Characterization and hypoglycemicactivity of aβ-pyran polysaccharides from bamboo shoot(Leleba oldhami Nakal)shells[J].Carbohydrate Polymers,2016,144:438)。丁红秀从毛竹叶水提得到的一种多糖，研究发现可显著降低由四氧嘧啶致糖尿病小白鼠的血糖值，缓减糖尿病病鼠体重减轻、消瘦及多饮多食等症状，对正常小白鼠的体重、血糖值、摄食量等无不良影响(丁红秀.毛竹叶多糖构成及生物活性研究[D].南昌：南昌大学，2007)。Kweon等采用热水浸提法从毛竹笋中分离纯化获得了3种水溶性的β-葡聚糖(BS-BGA，BS-BGB和BS-BGC)，且3种多糖在0.1g/L-1.0g/L的浓度下都可以经过旁路或者经典路径激活补体系统，是一种有效的免疫激活剂(Kweon M.,Wang H.,Sung H.Isolation and characterization of anticomplementaryβ-glucans from the shoots of bamboo.Planta Medica.2003,69(1):56-62)。殷军等人从竹叶中提取到两种均一多糖BLP30-1和BLP30-2，并研究两种多糖的抗氧化活性，结果发现其对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基均有较高的抑制作用(殷军,葛青,毛建卫,等.竹叶多糖的组分及抗氧化活性分析[J].食品工业科技,2013,34(2):100-103)。He等对雷竹笋水溶性多糖(WBP)进行分离和表征，以及益生元的活性进行的研究，发现分离得到的两种竹笋多糖WBP-1和WBP-2均具有显著增加双歧杆菌的数量的效果，表明多糖具有潜在益生元特性(He S,Wang X,Zhang Y,et al.Isolation and prebiotic activity ofwater-soluble polysaccharides fractions from the bamboo shoots(Phyllostachyspraecox)[J].Carbohydrate Polymers,2016,151:295)。Zhang等利用热水浸提从毛竹笋中分离到的B1组分具有强烈的抗羟基自由基、超氧自由基活性(Zhang Z,Wang X,Yu S,etal.Isolation and antioxidant activities of polysaccharides extracted from theshoots of Phyllostachys edulis(Carr.)[J].International Journal of BiologicalMacromolecules,2011,49(4):454-7)。上述报道大多是关于竹类多糖的一级结构研究，未涉及该类多糖的高级结构分析，比如对其单糖组成、糖苷键连接方式等未见报道；而且越来越多的研究表明多糖重要功能的发挥是由其结构特征决定的，其高级结构(二级及三级结构)更为密切，多糖的生物活性与其分子量、分子链构象(Conformation)紧密相关，了解该糖分子的构象更有助于阐明其生物活性作用机制。所以发现新的多糖组分及活性，对研究开发新食品保健品、新药等领域是具有非常重要的科学意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种从竹笋废弃物竹笋壳中分离确定出化学结构特征的竹笋壳多糖，即毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖。

本发明的另一目的是提供所述毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖的制备方法，该方法具有操作简单、易于控制的优点，适于工业化大规模生产。

本发明还提供了所述毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖的用途，其具有明显的降血糖活性，可以作为降血糖功能品，也可用于制备降血糖功能品。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述多糖的组成为半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸，其中，半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸的物质的量之比为6.80-8.50:5.50-7.30:1.10-1.90:0.70-1.30。

所述的半乳糖为β-半乳糖，优选为β-D-半乳糖；所述的阿拉伯糖为α-阿拉伯糖，优选为α-L-阿拉伯糖；所述的木糖为β-木糖，优选为β-D-木糖；所述的半乳糖醛酸为α-半乳糖醛酸，优选为α-D-半乳糖醛酸，进一步优选为α-6-O-甲基-D-半乳糖醛酸。

所述的多糖的结构单元中优选主链结构为(1→3)连接的β-D-半乳糖(β-D-Galp)残基，在主链上连续的三个β-D-半乳糖残基的O-6位上分别被三条支链取代；支链一是(1→4)连接的β-D-木糖(β-D-Xylp)残基和端基β-D-半乳糖(β-D-Galp)；支链二是(1→5)连接的α-L-阿拉伯糖(α-L-Araf)残基和(1→4)连接的α-6-O-甲基-D-半乳糖醛酸(α-6-O-Me-D-GalpA或α-D-GalpA-6-OMe)残基交替循环，以及端基α-L-阿拉伯糖(α-L-Araf)；支链三为(1→3,5)连接的α-L-阿拉伯糖(α-L-Araf)残基以及其O-3位上连接的端基α-L-阿拉伯糖(α-L-Araf)。

本发明毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖的支链有多种不同的变化组合，三条支链在主链上连续的三个β-D-半乳糖残基的O-6位上可按任意顺序排列，例如可具有如式Ⅰ所示的结构单元(式Ⅰ仅作为三条支链一种排列顺序的示例)：

式Ⅰ中，m、n均为正整数；Galp为吡喃型半乳糖，Araf为呋喃型阿拉伯糖，Xylp为吡喃型木糖，α-D-GalpA-6-OMe为吡喃型6氧甲基半乳糖醛酸。式Ⅰ所示结构单元中的m+n的数值依据毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖的重均分子量来确定。

作为优选，支链二中所述端基α-L-阿拉伯糖连接在(1→5)连接的α-L-阿拉伯糖残基的O-5位上。

所述毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖的重均分子量为55KDa-80KDa，进一步优选为59KDa-70KDa，最优选为59.2KDa-68.3KDa，KDa为千道尔顿。

所述毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖由毛竹笋壳热水浸提分离得到。具体技术方案如下：

所述毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖的制备方法，包括步骤：

(1)预处理：新鲜毛竹笋壳清洗干净后干燥，粉碎，得到毛竹笋壳粉末；

(2)提取：将步骤(1)中的毛竹笋壳粉末，加入水形成料液，75℃-95℃提取、离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，再加入乙醇水溶液，搅拌混匀，沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次毛竹笋壳粗多糖；

(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次毛竹笋壳粗多糖的水溶液用蛋白酶酶解，灭酶并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液；

(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为2000Da-5000Da的透析袋在去离子水中透析，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次毛竹笋壳粗多糖；

(5)纯化：将步骤(4)得到的二次毛竹笋壳粗多糖用水溶解得到二次毛竹笋壳粗多糖水溶液，经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖(DEAE纤维素-Sepharose)离子交换层析柱层析，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第二洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状毛竹笋壳多糖，即毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖，命名为PBSS2。

为了达到更好的发明效果，优选：

步骤(1)中，所述干燥条件为：在50℃-60℃(最优选55℃)干燥3h-5h；干燥条件比较温和，能够最大程度的保持毛竹笋壳中的营养物质。

所述毛竹笋壳粉末为过80目-150目筛的粉末，更利于充分提取多糖。

步骤(2)中，所述的乙醇水溶液的用量优选为浓缩液体积的4倍-5倍。所述的乙醇水溶液的体积百分浓度优选为90％-96％。

所述的沉淀过夜的温度优选为2℃-5℃。

步骤(3)中，所述的蛋白酶选用木瓜蛋白酶。所述的蛋白酶的重量为一次毛竹笋壳粗多糖重量的1％-2％。

所述的用蛋白酶酶解的条件优选为：50℃-55℃水浴2h-2.5h。

本发明灭酶的条件采用本领域的常规条件，例如可在100℃-105℃下灭酶15min-20min。

所述的有机溶剂选用氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1。

步骤(4)中，在去离子水中透析的时间优选为80h-150h。

步骤(5)中，所述二次毛竹笋壳粗多糖水溶液的浓度为10mg/mL-25mg/mL，进一步优选为10mg/mL-15mg/mL；流速1.0ml/min-2.0ml/min。

所述的二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析的条件为：采用梯度洗脱，洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L的NaCl水溶液，流速1.0ml/min-2.0ml/min。

所述凝胶过滤层析的条件为：洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3:1；流速0.5ml/min。

所述凝胶选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，例如市售的Sephacryl S系列(SephacrylS-100)等。

所述的磷酸盐缓冲液的配制方法按照本领域通用的方法，一般可参照《中国药典》。

所述的毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖在一定浓度范围内具有抑制葡萄糖吸收的作用，其中在Caco-2单细胞模型当中，PBSS2(10μg/mL)对葡萄糖(5mmol/L到30mmol/L，尤其是5mmol/L到20mmol/L)吸收有显著的抑制作用；PBSS2(从2.5μg/mL到20μg/mL)对葡萄糖(20mmol/L)吸收有显著的抑制作用，PBSS2(1.25μg/mL到2.5μg/mL)对葡萄糖(20mmol/L)吸收有一定的抑制作用；表明本发明毛竹笋壳多糖具有明显的降血糖活性，可以作为降血糖功能品(例如具有降血糖功能的添加剂、食品和/或保健品等)，也可用于制备降血糖功能品(例如具有降血糖功能的动物饲料、食品、保健品或药品等)，可广泛用于食品、保健品、动物饲料、医药等方面。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明通过对毛竹笋壳提取分离首次获得一种具有生物活性的大分子阿拉伯半乳聚糖PBSS2，经检测其多糖重量百分含量在99％以上，经单糖组成鉴定发现该多糖是由半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸组成，半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸的物质的量之比为6.80-8.50:5.50-7.30:1.10-1.90:0.70-1.30。FTIR证明PBSS2是杂多糖类，含有糖醛酸，含有α与β构型。激光光散射法证明它是单一组分且重均分子量为55KDa-80KDa。核磁共振图谱确定其糖苷键连接方式，多糖的结构单元中主链结构为(1→3)连接β-D-半乳糖残基，在主链上连续的三个β-D-半乳糖残基的O-6位上分别被三条支链取代；支链一是(1→4)连接的β-D-木糖残基和端基β-D-半乳糖；支链二是(1→5)连接的α-L-阿拉伯糖残基和(1→4)连接的α-6-O-甲基-D-半乳糖醛酸残基交替循环，以及端基α-L-阿拉伯糖；支链三为(1→3,5)连接的α-L-阿拉伯糖残基以及其O-3位上连接的端基α-L-阿拉伯糖。原子力显微镜观测出该多糖链直径在9.6nm-10.1nm。

本发明制备方法操作简便，易于控制，能够获得具有较高有序性、结构明确的大分子，为深入研究其高级结构与功能关系提供研究价值。利用本发明方法制备毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖，不影响其天然结构和活性，且该方法对设备要求较低、成本低，利于工业生产上大规模的推广、开发和使用。

本发明毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖在一定浓度范围内具有抑制葡萄糖吸收的作用，其中在Caco-2单细胞模型当中，PBSS2(10μg/mL)对葡萄糖(5mmol/L到30mmol/L)吸收有显著的抑制作用；PBSS2(从2.5μg/mL到20μg/mL)对葡萄糖(20mmol/L)吸收有显著的抑制作用，PBSS2(1.25μg/mL到2.5μg/mL)对葡萄糖(20mmol/L)吸收有一定的抑制作用；表明本发明毛竹笋壳多糖具有明显的降血糖活性，可以作为降血糖功能品，也可用于制备降血糖功能品，可广泛用于食品、保健品、动物饲料、医药等方面。

附图说明

图1A为二次毛竹笋壳粗多糖水溶液经DEAE纤维素-琼脂糖离子交换层析收集的洗脱液在490nm的吸光度(Absorbance at 490nm)曲线，Tube numbers为管数；图1B为经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶Sephacryl S-100纯化后的洗脱液在490nm的吸光度(Absorbance at490nm)曲线，Tumber number为管数；

图2为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后PBSS2溶液的HPLC图谱；A为对照图谱，B为样品图谱；其中，纵坐标mAU为响应值，横坐标为保留时间：分钟(min)，Man为甘露糖，Rib为核糖，Rham鼠李糖，GlcUA为葡萄糖醛酸，GalUA为半乳糖醛酸，Glc为葡萄糖，Gal为半乳糖，Xyl为木糖，Ara为阿拉伯糖，Fuc为岩藻糖；

图3为PBSS2的红外光谱图；其中，纵坐标Transmittance为透光率，横坐标Wavenumbers为波数；

图4为PBSS2的激光光散射图；其中，纵坐标Relative Scale为相对比例，横坐标time(min)为时间(分钟)；

图5为PBSS2的¹H-NMR图谱(图5A)与¹³C-NMR图谱(图5B)；

图6为PBSS2的HSQC图谱(图6A)与HMBC图谱(图6B)；

图7为PBSS2二维原子力显微镜测试图(图7A)、各形貌测量值曲线图(图7B和图7C)和三维立体原子力显微镜测试图(图7D)；

图8为一定浓度PBSS2对不同浓度葡萄糖的吸收影响图；其中，横坐标Group为组，纵坐标Concentration of Glu为细胞吸收的葡萄糖浓度；

图9为不同浓度PBSS2对一定浓度葡萄糖的吸收影响图；其中，横坐标Group为组，纵坐标Concentration of Glc为细胞吸收的葡萄糖浓度。

具体实施方式

毛竹笋壳(P.heterocycle)，购自浙江杭州径山镇杭帮竹笋专业合作社。

实施例1

(1)预处理：新鲜毛竹笋壳用自来水清洗干净，于烘箱55℃干燥4h后粉碎，过80目筛得到毛竹笋壳粉末，备用。

(2)提取：将步骤(1)中的毛竹笋壳粉末，加入蒸馏水形成料液，95℃提取、离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，再加入占浓缩液体积4倍量、体积百分浓度95％乙醇水溶液，搅拌混匀，2℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次毛竹笋壳粗多糖。

(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次毛竹笋壳粗多糖的水溶液用木瓜蛋白酶在55℃水浴2h进行酶解，木瓜蛋白酶的重量为一次毛竹笋壳粗多糖重量的1.5％，在105℃下灭酶20min并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂氯仿和正丁醇的混合液(其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1)离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液。

(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为2000Da的透析袋在去离子水中透析80h，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次毛竹笋壳粗多糖。

(5)纯化：将步骤(4)得到的二次毛竹笋壳粗多糖用去离子水溶解得到15mg/mL的二次毛竹笋壳粗多糖水溶液；用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱(10cm×26cm)，将二次毛竹笋壳粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，上样量10ml，流速1.0ml/min；洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L NaCl水溶液梯度洗脱，洗脱液流速1.5ml/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm多糖吸收峰(如图1A)，收集第二洗脱峰的洗脱液；

将收集的第二洗脱峰的洗脱液经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)进一步纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml；洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，洗脱液流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰(如图1B)，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为3000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的毛竹笋壳多糖，即毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖，命名为PBSS2。

实施例2

(1)预处理：新鲜毛竹笋壳用自来水清洗干净，于烘箱50℃干燥5h后粉碎，过150目筛得到毛竹笋壳粉末，备用。

(2)提取：将步骤(1)中的毛竹笋壳粉末，加入蒸馏水形成料液，75℃提取、离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，再加入占浓缩液体积4倍量、体积百分浓度96％乙醇水溶液，搅拌混匀，3℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次毛竹笋壳粗多糖。

(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次毛竹笋壳粗多糖的水溶液用木瓜蛋白酶在50℃水浴2.5h进行酶解，木瓜蛋白酶的重量为一次毛竹笋壳粗多糖重量的2％，在105℃下灭酶15min并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂氯仿和正丁醇的混合液(其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1)离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液。

(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为5000Da的透析袋在去离子水中透析100h，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次毛竹笋壳粗多糖。

(5)纯化：将步骤(4)得到的二次毛竹笋壳粗多糖用去离子水溶解得到10mg/mL的二次毛竹笋壳粗多糖水溶液；用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱(10cm×26cm)，将二次毛竹笋壳粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，上样量5ml，流速2.0ml/min；洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L NaCl水溶液梯度洗脱，洗脱液流速2.0ml/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm多糖吸收峰(如图1A)，收集第二洗脱峰的洗脱液；

将收集的第二洗脱峰的洗脱液经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)进一步纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为3:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰(如图1B)，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为5000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的毛竹笋壳多糖，即毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖，命名为PBSS2。

实施例3

(1)预处理：新鲜毛竹笋壳用自来水清洗干净，于烘箱60℃干燥3h后粉碎，过120目筛得到毛竹笋壳粉末，备用。

(2)提取：将步骤(1)中的毛竹笋壳粉末，加入蒸馏水形成料液，85℃提取、离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，再加入占浓缩液体积5倍量、体积百分浓度90％乙醇水溶液，搅拌混匀，5℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次毛竹笋壳粗多糖。

(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次毛竹笋壳粗多糖的水溶液用木瓜蛋白酶在55℃水浴2h进行酶解，木瓜蛋白酶的重量为一次毛竹笋壳粗多糖重量的1％，在100℃下灭酶20min并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂氯仿和正丁醇的混合液(其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1)离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液。

(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为4000Da的透析袋在去离子水中透析150h，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次毛竹笋壳粗多糖。

(5)纯化：将步骤(4)得到的二次毛竹笋壳粗多糖用去离子水溶解得到12mg/mL的二次毛竹笋壳粗多糖水溶液；用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱(10cm×26cm)，将二次毛竹笋壳粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，上样量8ml，流速1.5ml/min；洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L NaCl水溶液梯度洗脱，洗脱液流速1ml/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm多糖吸收峰(如图1A)，收集第二洗脱峰的洗脱液；

将收集的第二洗脱峰的洗脱液经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)进一步纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰(如图1B)，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为4000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的毛竹笋壳多糖，即毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖，命名为PBSS2。

下面是对PBSS2结构鉴定或性能分析的实施例：

实施例4：理化性质组分及分子量检测

将实施例1制得的毛竹笋壳多糖即毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖PBSS2，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.3％。从图4看出，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品PBSS2的保留时间主要分布在30min-39min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明PBSS2是均一的多糖，而LS信号主峰前的小峰可能是由多糖部分团聚而引起。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。该毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖Mw/Mn的比值为1.924，比较接近2，表明PBSS2是一个相对宽分散的多糖组分，其分子量Mw＝6.83×10⁴Da。

将实施例2制得的毛竹笋壳多糖即毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖PBSS2，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.3％。其激光光散射图与图4相同，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品PBSS2的保留时间主要分布在30min-39min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明PBSS2是均一的多糖，而LS信号主峰前的小峰可能是由多糖部分团聚而引起。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。该毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖Mw/Mn的比值为1.835，比较接近2，表明PBSS2是一个相对宽分散的多糖组分，其分子量Mw＝5.92×10⁴Da。

将实施例3制得的毛竹笋壳多糖即毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖PBSS2，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.5％。其激光光散射图与图4相同，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品PBSS2的保留时间主要分布在30min-39min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明PBSS2是均一的多糖，而LS信号主峰前的小峰可能是由多糖部分团聚而引起。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。该毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖Mw/Mn的比值为1.916，比较接近2，表明PBSS2是一个相对宽分散的多糖组分，其分子量Mw＝6.78×10⁴Da。

实施例5：单糖组成

取实施例1、实施例2或者实施例3制得的毛竹笋壳多糖即毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖3mg，加入1mL、4mol/L三氟乙酸(TFA)溶液，置于具塞试管中、氮气封口，121℃水解6h，冷却至室温，加入200μL甲醇，60℃真空离心浓缩，去除残留的三氟乙酸，反复3次，待衍生化。将各种单糖和糖醛酸标准品溶在0.3M(mol/L)氢氧化钠水溶液中配制每种单糖和糖醛酸浓度为5mmol/L(mM)的单糖和糖醛酸标准品溶液，将多糖PBSS2水解样品溶在0.3M氢氧化钠水溶液中配制多糖PBSS2水解样品浓度为5mmol/L的PBSS2溶液，然后分别取50μl单糖和糖醛酸标准品溶液、取50μlPBSS2溶液，各加入50μl 0.5M PMP甲醇液，混匀，70℃水浴100min，冷却至室温，加入50μl、0.3M HCl水溶液中和，10000rpm离心3min，将上清液转移至另一干净离心管，加水至1ml，加入等体积氯仿，充分震荡，静置分层后收集水相，为了除去PMP、过剩反应试剂等杂质，收集的水相，重复“加水至1ml，加入等体积氯仿，充分震荡，静置分层”的步骤三次，过0.22μm膜，分别得到PMP衍生化后单糖和糖醛酸标准品溶液和PMP衍生化后PBSS2溶液，待HPLC检测。

HPLC条件:柱子APS-2HYPERSIL(5μm，4.6×250mm)，检测波长245nm，流速1.0ml/min，柱温：室温，注入体积：10μlPMP衍生化后单糖和糖醛酸标准品溶液或10μl PMP衍生化后PBSS2溶液，流动相A(乙腈):流动相B(0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8))＝19:81(体积比)。

如图2，对应单糖和糖醛酸标准品，实施例1PBSS2多糖部分的单糖组成为由半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸组成，半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸的物质的量之比为6.80:7.30:1.10:1.30；说明PBSS2主要是阿拉伯半乳聚糖为主，并含有少量其它分支的多糖。

对应单糖和糖醛酸标准品，实施例2PBSS2多糖部分的单糖组成为由半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸组成，半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸的物质的量之比为8.50:5.50:1.90:0.70；说明PBSS2主要是阿拉伯半乳聚糖为主，并含有少量其它分支的多糖。

对应单糖和糖醛酸标准品，实施例3PBSS2多糖部分的单糖组成为由半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸组成，半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸的物质的量之比为7.10:5.75:1.36:0.95；说明PBSS2主要是阿拉伯半乳聚糖为主，并含有少量其它分支的多糖。

实施例6：FTIR

取5mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的毛竹笋壳多糖PBSS2，用KBr压片，美国Nicolet5700红外光谱仪4000-600cm^-1红外扫描。

如图3，IR谱图在3415cm^-1，出现一强宽吸收峰，为多糖上O-H伸缩振动的强吸收峰，表明多糖的分子内和分子间均存在氢键。2931cm^-1为C-H伸缩振动，1400-1200cm^-1处的吸收峰为C-H的变形振动，表明该组分为多聚糖。1745cm^-1吸收峰为糖醛酸的羰基振动峰，表明PBSS2含有一定量的糖醛酸；1629cm^-1和1440cm^-1为-CH₂的变形振动吸收峰。此外，在1049cm^-1存在多糖结构中吡喃环的特征吸收峰，即糖苷键C-O-C的非对称振动吸收峰。在1078cm^-1、1049cm^-1的2个吸收峰为吡喃型糖苷环骨架C-O变角振动吸收峰；结果显示842cm^-1和906cm^-1处存在吸收峰表明PBSS2的结构中同时含有α-型糖苷键和β-型糖苷键两种糖苷键构型。

实施例7：甲基化分析

取2mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的毛竹笋壳多糖PBSS2样品溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中，通氮气密封，超声片刻助溶，然后按照Ciucanu,et al.方法进行甲基化制备(Ciucanu,L.,&Kerek,F..A simple and repid method for permethylation ofcarbohydrates.Carbohydrate Research,131,209-217)。

PBSS2经过三次甲基化后，再经酸水解、还原，乙酰化制备成部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行GC-MS分析(见表1)。由表1可知：该多糖含有7种残基，分别是2,3,5-3-O-甲基阿拉伯糖，2,3-2-O-甲基阿拉伯糖，2,3,4,6-4-O-甲基半乳糖，2,3-2-O-甲基木糖，2-O-甲基阿拉伯糖，2,4,6-3-O-甲基半乳糖和2,4-2-O-甲基半乳糖。而羧基还原后多出2,3,6-Me₃-Gal残基，上述结果表明PBSS2由L-Araf-(1→，→5)-L-Araf-(1→，D-Galp-(1→，→4)-D-Xylp-(1→，→1)-L-Araf-(3,5→，→3)-D-Galp-(1→，→1)-D-Galp-(3,6→组成，摩尔比为6.04:3.16:1.00:3.88:3.96:7.21:3.19。

通过比较PBSS2的甲基化结果发现，多糖中(1→3)糖苷键连接的半乳糖含量最高，其次是(1→3)糖苷键连接的阿拉伯糖，而(1→4)糖苷键连接的半乳糖含量较少，另外还有少量的木糖和半乳糖的端基。糖残基的摩尔比与上述单糖组成的摩尔比基本一致。

表1 PBSS2甲基化分析

实施例8：核磁共振

取60mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的毛竹笋壳多糖PBSS2溶于0.5ml氘水中，瑞士Bruker-AVIII500M进行600MHz NMR扫描。

根据PBSS2的¹H-NMR(见图5A)、¹³C-NMR(见图5B)结合HSQC谱(见图6A)，检测到8个峰较为显著可用于分析。在δ1.0-δ2.3之间检测到有一些小的共振峰，可能PBSS2中含有蛋白质。在¹H-NMR谱中，于化学位移δ4.51-5.32ppm之间显示了PBSS2的主要的8个异头质子信号，按低场到高场分别为δ5.32、δ5.31、δ5.15、δ5.03、δ4.61、δ4.58、δ4.57和δ4.51ppm，分别命名为糖残基A、B、C、D、E、F、G、H；¹³C-NMR谱中也有8个异头碳信号(图5B)，δ110.63、δ110.63、δ108.79、δ101.67、δ104.40、δ104.45、δ104.45和δ104.72ppm分别逐一对应。为了进一步阐明其化学结构，糖残基A-H的¹H-NMR、¹³C-NMR谱化学位移经进一步结合¹H-¹H COSY、¹H-¹H TCOSY、¹H-¹³C HSQC和¹H-¹³C HMBC等二维核磁共振谱得到归属，归属结果见表2。

各残基的化学位移见表2，分析推断所有残基的氢、碳化学位移，耦合常数与标准残基对照发现，A、B、C归属于Ara糖残基，D、E、G、H归属于Gal糖残基，F归属于Xly糖残基。一般通过各个糖残基异头氢的化学位移可以判断异头碳的构型，δ>5.00ppm为α-型，δ<5.00ppm为β-型，从核磁解析结果可以发现Ara异头氢的化学位移处于相对低场(δ>5.00ppm)，为α-构型，Xly的异头氢的化学位移均处于相对高场(δ<5.00ppm)，为β-构型，Gal的异头氢的化学位移一部分处于高场，一部分处于低场存在两种构型，β-构型居多。一般来说可以通过“苷化位移”来判断多糖中单糖之间的连接位置，糖残基的各个碳都得到归属后，通过与已知单糖的碳的化学位移相对照，确定糖链的连接位置。残基A的C-3位、5位与未发生取代的糖残基的化学位移向低场分别移动，所以残基的连接位置分别在3位和5位。残基C、H的各个氢和碳的化学位移几乎与标准单糖的化学位移一致，属于末端残基，分别为(1→)-α-L-Araf和(1→)-β-D-Galp。残基B的C-5化学位移向低场移动，表明连接位置为5位。DEPT-135谱中δ62.58ppm出现负的亚甲基碳信号，说明残基E的C-6位被取代，此外E残基的C-3(δ81.57ppm)化学位移向低场移动，表明E为(1→3,6)-β-Galp残基。同理分析残基D的连接位置分别在C-4、C-6位，F残基的连接位置为C-4和G残基的连接位置为C-3，残基D、F、G分别是(1→4)α-GalpA-6-OMe残基、(1→4)-β-D-Xylp残基和(1→3)-β-D-Galp残基。以上分析结果和甲基化分析结果相一致。

表2 PBSS2糖残基的化学位移全归属

^a表示没有分配，T表示末端残基。

通过HMBC谱(图6B)可以推断出多糖PBSS2糖残基之间的连接方式。在HMBC谱中，残基A的C-1(δ110.63ppm)与残基E的H-6(δ3.98ppm)存在交叉峰，表明残基A连接在残基E的O-6位。残基H的H-1(δ4.52ppm)与残基E的C-6(δ70.49ppm)存在交叉峰，表明残基H连接在残基E的O-6位上。交叉峰δ85.20/5.15和δ68.06/5.15分别表明残基C连接在残基A的O-3位和残基C连接在残基B的O-5位。交叉峰δ5.32/80.09表明残基B连接在残基D的O-4位。从HMBC谱中又可以看出残基G的H-3与残基G的C-1有相关信号峰交叉，表明残基G作为多糖分子的主链自身连接为→3)-β-Galp-(1→3)-β-Galp-(1→。残基A的H-1与残基G的C-6有相关点，而残基C的H-1与残基B的C-3存在交叉峰，表明残基C连接在残基B的末端。残基A的H-1(δ5.32ppm)与残基A的C-3(δ85.20ppm)存在交叉峰，表明残基A的自身连接为→3,5)-α-L-Araf-(1→3,5)-α-L-Araf-(1→。残基H的H-1与残基E的C-6有相关点，残基H作为末端连接在支链上。上述结果与甲基化分析的结果相符。

实施例9：原子力显微镜测试

将质量百分浓度为5％-10％的实施例1、实施例2或者实施例3制得的毛竹笋壳多糖PBSS2水溶液涂抹在云母片上测试，获得该多糖的原子力图，如图7，其中图7A为2维原子力形貌图，图7D为3维立体形貌图，图7B和图7C为各形貌测量值曲线图，从结果中可以看出样品为紧缩的球形团，高度为9.6nm-10.1nm，从而可以判断该分子的分支相互结合聚集而成的，进一步证实PBSS2是具有紧密结构的球型链。

本发明建立了毛竹笋壳多糖提取纯化的方法，获得均一多糖，并初步研究其一级结构，对进一步进行生物活性及构效关系的探讨有重要的意义。

综合实施例4-实施例9的分析结果，证实了PBSS2由重量百分含量为99％以上的多糖组成；该多糖是由半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸组成，其中半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸的物质的量之比为6.80-8.50:5.50-7.30:1.10-1.90:0.70-1.30。该大分子主链结构为(1→3)连接β-D-半乳糖(β-D-Galp)残基，在主链上连续的三个β-D-半乳糖残基的O-6位上分别被三条支链取代；支链一是(1→4)连接的β-D-木糖(β-D-Xylp)残基和端基β-D-半乳糖(β-D-Galp)；支链二是(1→5)连接的α-L-阿拉伯糖(α-L-Araf)残基和(1→4)连接的α-6-O-甲基-D-半乳糖醛酸(α-6-O-Me-D-GalpA或α-D-GalpA-6-OMe)残基交替循环，以及端基α-L-阿拉伯糖(α-L-Araf)；支链三为(1→3,5)连接的α-L-阿拉伯糖(α-L-Araf)残基以及其O-3位上连接的端基α-L-阿拉伯糖(α-L-Araf)。支链二中端基α-L-阿拉伯糖连接在(1→5)连接的α-L-阿拉伯糖残基的O-5位上。三条支链在主链上连续的三个β-D-半乳糖残基的O-6位上可按任意顺序排列，具体结构单元可以是结构式Ⅰ所示的一种结构单元，也可以是三条支链按其它排列顺序排列的结构单元。

实施例10：一定浓度的PBSS2对不同浓度葡萄糖吸收作用

本发明检测了实施例1、实施例2或者实施例3制得的毛竹笋壳多糖PBSS2在一定浓度时对不同浓度葡萄糖吸收的抑制能力。

参考Johnston等的方法(Johnston,Sharp,Clifford,and Morgan,2005)。以Caco-2体外细胞为模型，向5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L浓度的葡萄糖HBSS溶液(HBSS即Hank's平衡盐溶液)中各加入10μg/mL毛竹笋壳多糖水溶液分别作为实验组A、实验组B、实验组C、实验组D、实验组E，相同浓度(5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L)的葡萄糖HBSS溶液为对照组conA、对照组conB、对照组conC、对照组conD、对照组conE，对照组不加入毛竹笋壳多糖，孵育过程中(30min、60min、90min、120min)用葡萄糖[GOPOD法]测定试剂盒检测葡萄糖的剩余量，进而推断不同浓度葡萄糖在毛竹笋壳多糖影响下与Caco-2细胞的结合情况，每组实验重复三次。一定浓度的PBSS2溶液对不同浓度葡萄糖吸收的影响的检测结果见图8a、图8b、图8c和图8d。

由图8a、图8b、图8c和图8d可以发现随着时间的推移，葡萄糖吸收量逐渐增加，实验组分别加入10μg/mL毛竹笋壳多糖后，葡萄糖的吸收量与对照组相比均有显著差异(P<0.05)，不同实验组间也存在显著差异(p<0.05)。这些结果表明，PBSS2可以抑制不同浓度的葡萄糖的摄取，葡萄糖浓度越低，PBSS2的抑制效果越好。

实施例11：不同浓度的PBSS2对一定浓度葡萄糖吸收作用

本发明检测了实施例1、实施例2或者实施例3制得的毛竹笋壳多糖PBSS2在不同浓度时对一定浓度葡萄糖吸收的抑制能力。

参考Johnston等的方法(Johnston,Sharp,Clifford,and Morgan,2005)。以Caco-2体外细胞为模型，分别在20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL浓度的毛竹笋壳多糖水溶液中加入20mmol/L葡萄糖HBSS溶液作为实验组F、实验组G、实验组H、实验组I、实验组J，20mmol/L的葡萄糖HBSS溶液作对照实验con，孵育过程中(30min、60min、90min、120min)用葡萄糖[GOPOD法]测定试剂盒检测葡萄糖的剩余量，进一步探究不同浓度的毛竹笋壳多糖对于相同葡萄糖浓度的吸收的影响，每组实验重复三次。检测结果见图9。

不同浓度的PBSS2组葡萄糖吸收量随时间变化的关系如图9所示，由图9可以看出，葡萄糖的摄取量随着毛竹笋壳多糖浓度的增大，存在显著降低，不同浓度的毛竹笋壳多糖溶液(20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL)对葡萄糖(20mmol/L)的吸收均有抑制效果(图9中*表示与对照组比较P<0.05)，随着时间的延长，葡萄糖的吸收量不同，各实验组的葡萄糖摄取量有显著性差异，多糖浓度越高，葡萄糖的吸收量越少，抑制葡萄糖吸收的效果越好。

表明本发明毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖具有较强的抑制葡萄糖吸收活性，可以作为降血糖添加剂、食品和/或保健品等降血糖功能品，也可用于制备具有降血糖功能的食品、保健品、动物饲料和/或药品等方面。

Claims (4)

1.一种毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖，其特征在于，由重量百分含量为99%以上的多糖组成；所述多糖的组成为半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸，其中，半乳糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖醛酸的物质的量之比为6.80-8.50 : 5.50-7.30: 1.10-1.90: 0.70-1.30；

所述毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖的重均分子量为55KDa-80Kda；

所述的半乳糖为β-D-半乳糖；所述的阿拉伯糖为α-L-阿拉伯糖；所述的木糖为β-D-木糖；所述的半乳糖醛酸为α-6-O-甲基-D-半乳糖醛酸；

所述多糖的结构单元中主链结构为（1→3）连接的β-D-半乳糖残基，在主链上连续的三个β-D-半乳糖残基的O-6位上分别被三条支链取代；支链一是（1→4）连接的β-D-木糖残基和端基β-D-半乳糖；支链二是（1→5）连接的α-L-阿拉伯糖残基和（1→4）连接的α-6-O-甲基-D-半乳糖醛酸残基交替循环，以及端基α-L-阿拉伯糖；支链三为（1→3,5）连接的α-L-阿拉伯糖残基以及其O-3位上连接的端基α-L-阿拉伯糖；

三条支链的排列顺序为任意顺序；

支链二中所述端基α-L-阿拉伯糖连接在（1→5）连接的α-L-阿拉伯糖残基的O-5位上。

2.根据权利要求1所述的毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖，其特征在于，所述毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖的重均分子量为59KDa-70KDa。

3.根据权利要求1-2任一项所述的毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖的制备方法，其特征在于，包括步骤：

（1）预处理：新鲜毛竹笋壳清洗干净后干燥，粉碎，得到毛竹笋壳粉末；

（2）提取：将步骤（1）中的毛竹笋壳粉末，加入水形成料液，75℃-95℃提取、离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，再加入乙醇水溶液，搅拌混匀，沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次毛竹笋壳粗多糖；

（3）去蛋白：将步骤（2）所得的一次毛竹笋壳粗多糖的水溶液用蛋白酶酶解，灭酶并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液；

（4）透析：步骤（3）所得的提取液用孔径为2000Da-5000Da的透析袋在去离子水中透析，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次毛竹笋壳粗多糖；

（5）纯化：将步骤（4）得到的二次毛竹笋壳粗多糖用水溶解得到二次毛竹笋壳粗多糖水溶液，经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第二洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状毛竹笋壳多糖，即毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖；

所述的二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析的条件为：采用梯度洗脱，洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L的 NaCl水溶液；

所述凝胶过滤层析的条件为：洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3:1。

4.根据权利要求1-2任一项所述的毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖在制备具有降血糖功能的添加剂、动物饲料、食品、保健品或药品中的应用。

Images