CN116874630A - 刺梨多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了刺梨多糖及其制备方法和应用。其中刺梨粗多糖通过纯化后获得两种多糖RP1和RP3，RP1单糖种类包括半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖，其摩尔比为1.00:3.45:1.88:1.82，RP3单糖种类包括半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖，半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖，其摩尔比为1.00:0.37:0.37:0.25。经体外实验证实，上述刺梨多糖具有显著的抑制MCF‑7乳腺癌细胞增殖的能力，以及诱导MCF‑7乳腺癌细胞凋亡的作用，可开发制备乳腺癌治疗药物；同时，上述刺梨多糖对正常L929细胞无影响。因此，上述刺梨多糖拥有广阔的应用前景，具有良好的社会效益和经济效益。

Description

刺梨多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及天然产物开发技术领域，具体而言，涉及刺梨多糖及其制备方法和应用。
背景技术
刺梨是一种富含多种天然活性成分的水果，集中分布于我国西南地区，其野生资源丰富。刺梨果实口感酸涩，表皮带刺且质构坚硬，因此更适合加工成产品。多糖作为刺梨其中一种活性成分被研究者发现，但是对于刺梨多糖的研究仅限于对其粗多糖的热水提取以及其体外抗氧化、降血糖和降脂活性研究。刺梨多糖的提取方法的选择和优化、纯化及其精细结构还有抗乳腺癌活性尚未有研究报道。因此，选择一种能提高刺梨多糖产率的提取方法及其优化具有重要意义。同时，对刺梨多糖进行纯化及其精细结构分析，探索其生物活性，为其在功能食品，医药领域的应用提供理论基础，具有重要意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供刺梨多糖及其制备方法和应用，其中获得的刺梨多糖对MCF-7乳腺癌细胞具有抑制生长的作用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种刺梨多糖提取物，其中包括刺梨多糖RP1和RP3；
刺梨多糖RP1中的单糖种类包括半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖，其摩尔比为1.00:3.45:1.88:1.82，刺梨多糖RP3的单糖组成为半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖，摩尔比为1.00:0.37:0.37:0.25。
在可选的实施方式中，刺梨多糖中的单糖种类包括半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和葡萄糖。
在可选的实施方式中，多糖RP1的糖苷键包括→4)-GalpA-(1→,T-Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,→4)-Rhap-(1→,T-Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,→3)-β-Galp-(1→,T-Araf-(1→,和→3)-Araf-(1→。
在可选的实施方式中，多糖RP1的糖苷键→4)-GalpA-(1→,T-Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,→4)-Rhap-(1→,T-Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,→3)-β-Galp-(1→,T-Araf-(1→,和→3)-Araf-(1→的摩尔比为12.88,5.35,3.16,17.95,1.65,19.33,12.95,11.21,4.63,3.68,4.51和2.66。
在可选的实施方式中，多糖RP3的糖苷键包括T-GalpA-(1→,→4)-GalpA-(1→,→3,4)-GalpA-(1→,T-Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,T-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,T-Araf-(1→,→5)-Araf-(1→,→4)-Glcp-(1→,T-Xylp-(1→。
在可选的实施方式中，多糖RP3的糖苷键T-GalpA-(1→,→4)-GalpA-(1→,→3,4)-GalpA-(1→,T-Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,T-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,T-Araf-(1→,→5)-Araf-(1→,→4)-Glcp-(1→,T-Xylp-(1→的摩尔比为7.80,43.22,1.79,3.68,4.06,5.29,7.86,4.84,3.78,9.15,1.79,2.71和1.97。
在可选的实施方式中，多糖RP1的数均分子量为629.41kDa；多糖RP3的数均分子量为74.70kDa。
第二方面，本发明提供了上述刺梨提取物的制备方法，其包括：将刺梨干粉进行提取和纯化后获得含有多糖RP1和多糖RP3的刺梨提取物。
在可选的实施方式中，提取包括将刺梨干粉用缓冲液溶解并用果胶酶进行酶解，再对酶解液进行超声提取。
在可选的实施方式中，酶解的条件为：缓冲液与刺梨干粉的料液比为10:1-50:1mL/g；果胶酶的添加量为刺梨干粉质量的0.4％-4％；酶解体系的pH值为3-6；酶解温度为35-55℃；酶解时间为5-70分钟。
更佳地，缓冲液与刺梨干粉的料液比为1-30mL/g；果胶酶的添加量为刺梨干粉质量的2.5％；酶解体系的pH值为4.0；酶解温度为50℃；酶解时间为40分钟。
在可选的实施方式中，超声的条件为：超声功率为80-200W；超声温度为40-90℃；时间为5-60分钟。
更佳地，超声功率为120W；超声温度为80℃；时间为20分钟。
在可选的实施方式中，通过阴离子交换柱分离获得纯化后的刺梨提取物。
具体地，将提取液通过AB-8大孔树脂进行脱色，加入三氯乙酸除蛋白，离心去除蛋白沉淀，取上清液经醇沉淀后，重溶、透析和冷冻干燥，得到粗刺梨多糖；然后将提取到的粗刺梨多糖用水溶解后，经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱分离后收集刺梨多糖组分。
第三方面，本发明还提供了上述刺梨提取物制备抗乳腺癌的药物中的应用。
第四方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述多糖RP1和/或多糖RP3，以及药学上可接受的载体。
本发明具有以下有益效果：
本发明从刺梨中分离得到了刺梨多糖，经体外实验证实，上述刺梨多糖具有显著的抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖的能力，以及诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的作用，可进一步开发制备乳腺癌治疗药物；同时，上述刺梨多糖对正常L929细胞无影响。因此，本发明的刺梨多糖拥有广阔的应用前景，具有良好的社会效益和经济效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的刺梨多糖的DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱洗脱图；
图2为本发明不同提取条件对刺梨多糖提取产率的影响；
图3为本发明提供的刺梨纯多糖RP1和RP3的单糖组成；
图4为本发明提供的刺梨纯多糖RP1和RP3的红外光谱图；
图5为本发明提供的刺梨纯多糖RP1和RP3的一维核磁图谱；
图6为本发明提供的刺梨纯多糖RP1对MCF-7细胞的存活率的影响；
图7为本发明提供的刺梨纯多糖RP1对L929细胞的存活率的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例为刺梨多糖的制备，具体步骤如下：
(1)将从贵州省六盘水地区购买的刺梨干果进行研磨过筛后加入95％的乙醇在70℃的水浴中回流3h，重复2次进行脱色脱脂处理，结束后过滤将滤渣置于烘箱中50摄氏度干燥过夜，得刺梨干粉；
(2)将步骤(1)制得刺梨干粉放入圆底烧瓶，加入2.5％的果胶酶，加入pH为4.0的0.1mol/L柠檬酸钠-柠檬酸钠缓冲液(液体与原料的比例为30:1mL/g)混合，将溶液置于50℃水浴中酶解40min；
(3)将步骤(2)制得的液体放置于功率为120W，温度为80℃的超声反应器中20min；
(4)将步骤(3)制得溶液进行过滤，得到滤液；
(5)将步骤(4)制得的滤液通加入AB-8大孔树脂进行脱色；
(6)将步骤(5)制得的滤液中加入终浓度为4％的三氯乙酸，室温搅拌半小时，离心，收集上清液；
(7)将步骤(6)制得的上清液中加入四倍体积的无水乙醇，经醇沉后，离心，收集沉淀；
(8)将步骤(7)制得的沉淀用水溶解，透析，真空冷冻干燥后，制得粗刺梨多糖；
(9)将步骤(8)制得粗刺梨多糖用水溶解，制得粗刺梨多糖溶液；
(10)将步骤(9)制得的粗刺梨多糖溶液通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱获得RP1和RP3组分；
(11)将步骤(10)制得的刺梨多糖溶液经透析、真空冷冻干燥后，制得纯化的刺梨多糖。
采用本实施例的制备方法获得的刺梨多糖产量为4.78±0.10％。
图1为本发明刺梨多糖的DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱洗脱图。
实施例2
本实施例采用实施例1的制备方法，通过单因素变化筛选最佳的制备方案，其中单因素变化的因素分别为酶解温度、酶解时间、料液比、体系pH、酶量、超声温度、超声时间和超声功率。
检测结果如图2所示，在缓冲液与刺梨干粉的料液比为10:1-50:1mL/g、果胶酶的添加量为刺梨干粉质量的0.4％-4％、酶解体系的pH值为3-6、酶解温度为35-55℃、酶解时间为5-70分钟、超声功率为80-200W、超声温度为40-90℃和超声时间为5-60分钟的条件下，采用本发明的制备方法均可以制备获得刺梨多糖，但是最佳的条件为：果胶酶的添加量为刺梨干粉质量的2.5％、酶解温度为50℃、酶解时间为40min，酶解pH为4.0、缓冲液与刺梨干粉的反应液料比1:30、超声功率为120W、超声提取温度为80℃和超声提取时间为20min。
实施例3
本实施例为实施例1中获得的刺梨多糖的鉴定
3.1分子量测定
具体步骤如下：
(1)取实施例1得到的RP1和RP3分别溶解在0.1M NaNO3水溶液中至终浓度为1mg/mL，并通过孔径为0.45μm的过滤器过滤；
(2)将步骤(1)制得的滤液(100μL)注入凝胶排阻色谱柱(Ohpak SB 805HQ(300×8mm)，Ohpak SB 804HQ(300×8mm)，Ohpak SB 803HQ(300×8mm))，用NaNO3溶液(0.1M)以0.4mL/min流速进行洗脱，柱温45℃，得到响应值数据；
(3)将得到的数据收集和处理，根据马克·霍温克方程(Mark Houwink Equation)计算分子量。测定结果为：RP1和RP3的平均分子量分别为629.41kDa和74.70KDa。
3.2单糖的组成测定
具体步骤如下：
(1)将5mg实施例1得到的RP1和RP3用三氟乙酸(TFA)在121℃水解2小时；
(2)通入氮气，吹干，加入甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2 3次；
(3)加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测；
(4)以标准岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸作为对比，通过高效阴离子交换色谱(HPAEC)连同脉冲安培检测器和DionexTMCarboPacTMPA20(150mm×1.0mm，10μm)液相色谱柱测定水解产物的单糖组成和单糖含量；
其中，HPAEC操作条件如下：
流动相A：0.1M NaOH；流动相B：0.1M NaOH，0.2M NaAc；流速：0.5mL/min。
梯度洗脱条件如下：0min，95％A、5％B；30min，80％A、20％B；30.1min，60％A、40％B；45min，60％A、40％B；45.1min，95％A、5％B；60min，95％A、5％B。
将测定结果与标准品对比计算，结果发现：RP1包含半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖以及少量的木糖和葡萄糖；其中半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖的摩尔比为1.00:3.45:1.88:1.82。RP3包含半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖以及少量的木糖和葡萄糖；其中半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖的摩尔比为1.00:0.37:0.37:0.25。
图3为本发明刺梨多糖RP1和RP3的单糖组成。
3.3FT IR光谱检测
具体步骤如下：
将实施例1得到的RP1和RP3分别和KBr以1：100的比例混合研磨，然后通过抽真空压成薄片；将压成薄片的RP1和RP3在4000～400cm 1的范围内在IR Tracer 100傅里叶变换红外光谱仪上测定。
测定结果如图4所示，在大约3403.41cm-1(RP1)和3422.55cm-1(RP-3)处的宽拉伸强峰代表-OH拉伸振动峰，在大约2927.65cm-1(RP1)和2931.86cm-1(RP3)处观察到的小峰被归属于C-H的拉伸振动。以1600-1650cm-1为中心的吸收带是由C＝O不对称拉伸振动引起的。在约1615.96cm-1(RP1)和1616.08cm-1(RP3)处的峰代表非酯化羰基C＝O不对称拉伸振动，这表明糖醛酸的存在。C＝O在1734.79cm-1(RP1)和1740.09cm-1(RP3)处的价态振动，1249cm-1处的对称C-H弯曲振动表明存在乙酰基[31]。1200-1000cm-1区域是多糖的特征吸收带，与吡喃糖单元中的C-O-C糖苷键和C-O-H连接键有关。此外，893.26cm-1处的特征吸收峰表明RP1在糖单元之间具有β型糖苷键。
3.4甲基化检测
具体步骤如下：
(1)称取10mg RP1和RP3，分别加入1ml一级水溶解，加入1ml 100mg/mL碳二亚胺，反应2h。
(2)加入1ml 2M的咪唑，将样品平均分为两份，分别加入1ml 30mg/mL的NaBH4和1ml 30mg/mL NaBD4，反应3h。
(3)加入100μL冰醋酸终止反应。透析样品48h，透析完成后冷冻干燥样品，进行甲基化处理。
(4)冻干样品中加入500μL DMSO溶解。
(5)加入1mg NaOH，孵育30min。
(6)加入50μL碘甲烷溶液反应1h。
(7)加入1mL水和2mL二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相。重复水洗3次。
(8)取下层二氯甲烷相并蒸干。
(9)加入100μL 2M TFA，121℃反应90min并在30℃蒸干。
(10)加入50μl 2M氨水，50μL 1M NaBD4，混匀，室温下反应2.5h。
(11)加入20μL乙酸终止反应，氮气吹干，250μL甲醇洗两次，氮气吹干。
(12)加入乙酸酐250μL，涡旋混匀，100℃反应2.5h。
(13)加入1mL水静置10min。
(14)加入500μL二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相。重复水洗3次。
(15)取下层二氯甲烷相，然后通过GC-MS(安捷伦7890A-5977B；安捷伦技术公司，美国)和BPX70毛细管柱(25m×0.22mm×0.25μm)对乙酰化产物进行定性分析。
测定结果如表1所示：
表1刺梨多糖的甲基化结果
根据表1列举的RP1和RP3的甲基化结果可以得出：RP1通过甲基化获得其重要的糖苷键连接方式分别为→4)-GalpA-(1→,T-Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,→4)-Rhap-(1→,T-Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,→3)-β-Galp-(1→,T-Araf-(1→,and→3)-Araf-(1→，其摩尔比分别为12.88,5.35,3.16,17.95,1.65,19.33,12.95,11.21,4.63,3.68,4.51和2.66。
RP3通过甲基化获得其重要的糖苷键连接方式分别为T-GalpA-(1→,→4)-GalpA-(1→,→3,4)-GalpA-(1→,T-Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,T-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,T-Araf-(1→,→5)-Araf-(1→,→4)-Glcp-(1→,T-Xylp-(1→，其摩尔比分别为7.80,43.22,1.79,3.68,4.06,5.29,7.86,4.84,3.78,9.15,1.79,2.71和1.97。
3.5NMR检测
具体步骤如下：
将约30mg干燥的样品粉末溶解在D2O(0.5mL)中，反复冷冻干燥三次后用于NMR分析。将残余物用加入的2，2，3，3-d4-3-(三甲基甲硅烷基)丙酸钠(TMSP)作为内标物再溶于D2O中，并通过1D NMR光谱分析。在298K温度下于Bruker 800MHz核磁仪(Avance III-800MHz，Bruker，Switzerland)上进行图谱分析。
测定结果如图5所示：RP1被证实是鼠李糖乳糖醛酸，其主链是由1,4-连接的α-GalpA和1,2,4-连接α-Rap，并且具有丰富的阿拉伯半乳聚糖(AG-I)和Gal侧链。RP3被证实是果胶多糖，具有较长的HG骨架和RG-I结构域，侧链由Gal和Ara等组成。
实施例4
本实施例为实施例1获得的刺梨多糖的功能验证
4.1刺梨多糖RP1和RP3对MCF-7乳腺癌细胞抑制增殖的作用
用CCK-8方法来评价对RP1和RP3对体外培养的MCF-7癌症细胞和L929细胞的抑制作用。
具体步骤如下：取对数生长期的细胞按5×103的密度接种到96孔板中，每个孔中有100μL培养基，并在37℃和5％ CO2下孵育24小时。向孔内加入200μL不同浓度0、10、20、50、100、500、1000和2000μg/mL的RP1和RP3溶液，分别孵育24、48和72小时。孵育结束后，向每个孔中加入100μL含有10％ CCK-8的新鲜培养基，并在37℃下孵育1.5小时。使用Synergy-H1酶标仪测量450nm处的吸光度。
测定结果如图6和图7所示：RP1和RP3在用浓度为10、20、50、100、500、1000和2000μg/mL的多糖共同孵育24、48和72小时后，对MCF-7细胞的生长表现出时间和剂量依赖性的抑制作用。当浓度低于100μg/mL时，RP1和RP-3对MCF-7细胞的细胞毒性很小，48小时的细胞活力分别为73.9％和79.9％。在1000μg/mL浓度下，RP1和RP3对MCF-7细胞48小时的存活率分别为42.5％和74.6％，表明RP1的抑制作用比RP3更显著。同样在一定浓度范围内，RP1和RP3对L929细胞的生长没有显著影响。结果表明，RP1和RP3可以以剂量依赖的方式降低MCF-7细胞的活力，而不影响正常细胞的生长。因此，这种来自刺梨果实的水溶性多糖可能是一种潜在的抗乳腺癌物质。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种刺梨多糖提取物，其特征在于，所述刺梨多糖提取物包括刺梨多糖；
所述刺梨多糖中的单糖种类包括半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖，所述半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖的摩尔比为1.00:3.45:1.88:1.82或1.00:0.37:0.37:0.25。
2.根据权利要求1所述的刺梨多糖提取物，其特征在于，所述刺梨多糖中的单糖种类包括半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、及少量的木糖和葡萄糖。
3.根据权利要求2所述的刺梨多糖提取物，其特征在于，所述刺梨多糖包括多糖RP1，其糖苷键包括→4)-GalpA-(1→,T-Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,→4)-Rhap-(1→,T-Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,→3)-β-Galp-(1→,T-Araf-(1→,和→3)-Araf-(1→；
优选地，所述多糖RP1的糖苷键→4)-GalpA-(1→,T-Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,→4)-Rhap-(1→,T-Galp-(1→,→4)-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,→3)-β-Galp-(1→,T-Araf-(1→,和→3)-Araf-(1→的摩尔比为12.88,5.35,3.16,17.95,1.65,19.33,12.95,11.21,4.63,3.68,4.51和2.66。
4.根据权利要求3所述的刺梨多糖提取物，其特征在于，所述刺梨多糖包括多糖RP3，其糖苷键包括T-GalpA-(1→,→4)-GalpA-(1→,→3,4)-GalpA-(1→,T-Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,T-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,T-Araf-(1→,→5)-Araf-(1→,→4)-Glcp-(1→,T-Xylp-(1→；
优选地，所述多糖RP3的糖苷键T-GalpA-(1→,→4)-GalpA-(1→,→3,4)-GalpA-(1→,T-Rhap-(1→,→2)-Rhap-(1→,→2,4)-Rhap-(1→,T-Galp-(1→,→6)-Galp-(1→,→3,6)-Galp-(1→,T-Araf-(1→,→5)-Araf-(1→,→4)-Glcp-(1→,T-Xylp-(1→的摩尔比为7.80,43.22,1.79,3.68,4.06,5.29,7.86,4.84,3.78,9.15,1.79,2.71和1.97。
5.根据权利要求3或4所述的刺梨多糖提取物，其特征在于，所述多糖RP1的数均分子量为629.41kDa；所述多糖RP3的数均分子量为74.70kDa。
6.如权利要求1-5任一项所述的刺梨多糖提取物的制备方法，其特征在于，将刺梨干粉进行提取和纯化后获得含有所述多糖RP1和多糖RP3的刺梨多糖提取物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述提取包括将所述刺梨干粉用缓冲液溶解并用果胶酶进行酶解，再对酶解液进行超声提取；
优选地，所述酶解的条件为：缓冲液与刺梨干粉的料液比为10:1-50:1mL/g；果胶酶的添加量为刺梨干粉质量的0.4％-4％；酶解体系的pH值为3-6；酶解温度为35-55℃；酶解时间为5-70分钟；
优选地，所述超声的条件为：超声功率为80-200W；超声温度为40-90℃；时间为5-60分钟。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括将超声后获得的提取液阴离子交换柱分离获得纯化后的刺梨提取物。
9.如权利要求1-5任一项所述的刺梨多糖提取物在制备抗乳腺癌的药物中的应用。
10.一种药物组合，其特征在于，所述药物组合中包含权利要求3和/或4所述的多糖RP1和/或多糖RP3，以及药学上可接受的载体。
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