CN111777693A - 川芎均一性多糖及其提取方法与应用 - Google Patents

川芎均一性多糖及其提取方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种川芎多糖及其提取方法与应用，具体步骤如下：以川芎为原材料，经过热水提取步骤、乙醇沉淀步骤、去除蛋白步骤、透析浓缩冷冻干燥步骤，制得川芎粗多糖；对川芎粗多糖，采用DEAE SepharoseTMFast Flow柱层析技术提取川芎多糖；对川芎多糖，采用SephacrylTMS‑300High Resolution柱层析技术提取川芎得到两种均一性多糖LCXP‑1a、LCXP‑3a，对比两种川芎均一性多糖在肝癌免疫调节的实验表明川芎均一性多糖具有免疫调节抗肿瘤作用。

Description

川芎均一性多糖及其提取方法与应用
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，特别是川芎均一性多糖及其提取方法与应用。
背景技术
川芎是一种历史悠久的传统中药，近年来，川芎的多种生物学活性被广泛研究，主要包括抗炎、心血管效应、减缓细胞衰老、抗氧化和体外抗肿瘤活性。目前已从川芎中分离出170多种成分，包括邻苯二甲酸酯、萜烯类及其烯醇、生物碱、多糖、有机酸及其酯类等。川芎多糖(Ligusticum chuanxiong polysaccharides,LCXP)是川芎的主要生物学活性物质之一，LCXP的研究逐渐增多，通常包括LCXP的提取分离纯化和生物活性的研究。研究表明许多免疫类多糖可以通过激活免疫细胞，特别是抗原呈递细胞来发挥免疫调节作用。抗原呈递细胞表面有大量的Toll样受体(TLR)，可以识别抗原并激活细胞内信号通路，在先天和适应性免疫反应中至关重要，参与了一些中药多糖的抗肿瘤活性。
传统的多糖的分离提取方法包括水提醇沉法以及酶提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法、超高压提取技术微波辅助提取法和双水相萃取等新技术,对其分离原理、处理方式和效果都不相同。
公开号为CN105273094，名为“一种川芎多糖快速分离的方法”的发明专利中通过将川芎根干燥粉碎脱脂后，用乙醇-无机盐双水相提取液混合，微波萃取，离心，分离醇，沉淀，干燥得粗多糖；在[期刊论文]帕热哈提·艾合买提,赛德艾合买提,许珊珊,吉尔格丽,吴强,Pare Hati·Aihemaiti,Saide Aihemaiti,Xu Shanshan,Ji'er Gel i,Wu Qiang-《科学之友》2011年18期川芎多糖分离提取的工艺探究中，通过将川芎根经石油醚脱脂，热水提取，乙醇沉淀，去除蛋白，无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥得川芎多糖。它们的不足在于没有用柱层析方法进一步的分离纯化，提取的川芎多糖不是均一性多糖，纯度低，未能检测出其分子量和单糖组成、没有对生物活性进行探索。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种川芎均一性多糖提取方法。
本发明的第二目的是提供两种川芎均一性多糖。
本发明的第三目的是提供两种川芎均一性多糖在肝癌免疫调节抗肿瘤方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种川芎均一性多糖的提取方法，具体步骤如下：
1)以川芎为原材料，粗提取川芎粗多糖；
2)对川芎粗多糖提取物，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取得到川芎多糖LCXP-1、LCXP-3；
3)对川芎多糖LCXP-1、LCXP-3，采用SephacrylTMS-300High Resolut ion柱层析技术提取得到川芎均一性多糖LCXP-1a、LCXP-3a。
进一步，步骤1)中所述粗提取川芎粗多糖的具体方法如下：
1-1)热水提取步骤：将原料川芎在粉碎机里粉碎，得到川芎粉末；在热水提取反应杯中加入川芎粉末，再加入蒸馏水Ⅰ，置于75℃～85℃水浴中搅拌1.5～2.5h，过滤收集提取液Ⅰ；残渣中再加入蒸馏水Ⅱ，置于75℃～85℃水浴中搅拌1.5～2.5h，过滤收集提取液Ⅱ；合并提取液Ⅰ和提取液Ⅱ，离心去除沉淀，在旋转蒸发仪上减压浓缩，得到川芎水溶性粗提取物；川芎粉末、蒸馏水Ⅰ和蒸馏水Ⅱ的重量份数比为：川芎粉末150～250份、蒸馏水Ⅰ1500～2500份、蒸馏水Ⅱ1200～2000份；
1-2)乙醇沉淀步骤：取冷却后的川芎水溶性粗提取物，加入4倍体积的无水乙醇，同时不断搅拌，置于4℃环境，沉淀16～24h，离心取沉淀物Ⅰ；
1-3)去除蛋白步骤：取沉淀物Ⅰ，用蒸馏水Ⅲ溶解，加入其体积五分之一的sevag试剂，电动快速搅拌8～12min，再4000rpm离心处理3～5min；取上清液Ⅰ重复加入其体积五分之一的sevag试剂搅拌离心处理，直到蛋白除尽，得到上清液Ⅱ；沉淀物Ⅰ和蒸馏水Ⅲ的重量份数比为：沉淀物Ⅰ10～20份、蒸馏水Ⅲ25～50份；
1-4)透析浓缩冷冻干燥步骤：取上清液Ⅱ，选取截留分子量为3000Da～4000Da的透析袋，在纯水中透析36～48h；在旋转蒸发仪上减压浓缩，并在冻干机内冷冻干燥，制得川芎粗多糖。
进一步，步骤1-1)中水浴温度都为80℃、搅拌时间都为2h、川芎粉末200份、蒸馏水Ⅰ2000份、蒸馏水Ⅱ1600份；
步骤1-2)中沉淀时间24h；
步骤1-3)中搅拌时间10min、离心时间3min、沉淀物Ⅰ10份、蒸馏水Ⅲ25份；
步骤1-4)中截留分子量3500Da、透析时间48h。
进一步，步骤2)中所述采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取川芎多糖的具体步骤如下：
2-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将DEAE SepharoseTM FastFlow加入柱管中，静置18～24h；用0.4～0.6mol/L的HCl洗1个柱体积，速度为6～8mL/min，时间为30～50min；再用超纯水平衡3～5个柱体积，速度为6～8mL/min，时间为90Min～130Min；
2-2)取川芎粗多糖，溶于蒸馏水Ⅳ中，以速度3～4mL/min上样，分别用水、0.15mol/L和0.3mol/L的NaCl洗脱40管，8mL/管，速度6～8mL/min，分别得到洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-2和洗脱液LCXP-3；川芎粗多糖和蒸馏水Ⅳ的重量份数比分别为：川芎粗多糖0.3～0.4份、蒸馏水Ⅳ25～30份；
2-3)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-2和洗脱液LCXP-3的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-3。
2-4)对于洗脱液LCXP-1和洗脱液LCXP-3，选取截留分子量为7500Da～8000Da的透析袋，在纯水中透析36-48h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，浓缩后冻干，保存于-20℃环境，分别得到川芎多糖LCXP-1和LCXP-3。
进一步，步骤2-1)中静置时间24h、HCl浓度0.5mol/L、HCl清洗速度6mL/min、HCl清洗时间35min；
步骤2-2)中上样速度4mL/min、洗脱速度6mL/min、川芎粗多糖0.3份、蒸馏水Ⅳ25份；
步骤2-4)中截留分子量8000Da、透析时间48h。
进一步，步骤3)中所述采用SephacrylTMS-300High Resolut ion柱层析技术提取川芎均一性多糖的具体步骤如下：
3-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将SephacrylTMS-300HighResolution加入柱管中，静置18～24h；用PBS平衡液洗1～2个柱体积，速度为0.3～0.4mL/min，时间为200～500min。
3-2)取川芎多糖LCXP-1，溶于蒸馏水Ⅴ中，以0.3～0.4mL/min上样；用PBS平衡液洗脱40管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液LCXP-1a；川芎多糖LCXP-1和蒸馏水Ⅴ的重量份数比分别为：川芎多糖LCXP-1为0.025～0.035份、蒸馏水Ⅴ1～1.5份；
取川芎多糖LCXP-3，溶于蒸馏水Ⅵ中，以0.3～0.4mL/min上样；用PBS平衡液洗脱40管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液LCXP-3a；川芎多糖LCXP-3和蒸馏水Ⅵ的重量份数比分别为：川芎多糖LCXP-3为0.025～0.035份、蒸馏水Ⅵ1～1.5份。
3-3)检测洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a。
3-4)针对吸光度为单峰洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a，选取截留分子量为7500Da～8000Da的透析袋分别透析，在纯水中透析36～48h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，旋转蒸发浓缩后冻干，保存于-20℃环境，得到两个洗脱片段的川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a。
进一步，步骤3-1)中静置时间24h、PBS平衡液洗1个柱体积、PBS平衡液平衡速度0.3mL/min、PBS平衡液平衡时间260min；
步骤3-2)中上样速度都为0.3mL/min、川芎多糖LCXP-1 0.03份、蒸馏水Ⅴ1份、川芎多糖LCXP-3 0.03份、蒸馏水Ⅵ1份；
步骤3-4)中截留分子量8000Da、透析时间48h。
进一步，所述川芎多糖LCXP-1a的组成如下：
分子量为：11159Da；
总多糖含量为：99.68％；
糖醛酸含量为：4.05％；
单糖组成为：甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖。
进一步，所述川芎多糖LCXP-3a的组成如下：
分子量为：203486Da；
总多糖含量为：90.04％；
糖醛酸含量为：63.36％；
单糖组成为：甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖。
进一步，川芎均一性多糖在肝癌免疫调节抗肿瘤方面的应用。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
本发明首先以川芎为原材料，采用传统的水提醇沉法提取川芎粗多糖，接着将提取的川芎粗多糖通过DEAE SepharoseTM Fast Flow柱、SephacrylTMS-300High Resolution柱，两次柱层析分离纯化，得到两个片段的川芎均一性多糖LCXP-1a、LCXP-3a，且具有较强的免疫活性。本发明通过柱层析方法进行进一步的分离纯化，从川芎中提取纯化得到的川芎多糖，LCXP-1a和LCXP-3a皆为单一的对称峰则说明LCXP-1a和LCXP-3a为均一性多糖，LCXP-1a总多糖含量为99.68％、LCXP-3a总多糖含量为90.04％，纯度高，LCXP-1a分子量为11159Da、LCXP-3a分子量为203486Da，并检测出其单糖组成成分分别为LCXP-1a：甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖；LCXP-3a：甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖。本发明提取的川芎多糖具有独有分子量和成分，并通过生物试验证明川芎均一性多糖证明LCXP-3a产生的NO、TNF-α、IL-6高于相应浓度的LCXP-1a，LCXP-1a和LCXP-3a在肝癌免疫调节抗肿瘤方面经LCXP-3a作用后的巨噬细胞对肿瘤的抑制作用增强、还可以抑制肝癌细胞的增殖，LCXP-3a对HepG2和Hep3B产生直接或间接抑制作用。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。
附图说明
本发明的附图说明如下。
图1为本发明的多糖提取流程图；
图2为DEAE SepharoseTM Fast Flow洗脱曲线；
图3为LCXP-1a的SephacrylTMS-300High Resolution洗脱曲线；
图4为LCXP-3a的SephacrylTMS-300High Resolution洗脱曲线；
图5为LCXP-1a的紫外吸收光谱结果图；
图6为LCXP-3a的紫外吸收光谱结果图；
图7为LCXP-1a的高效凝胶渗透色谱法HPGPC结果图；
图8为LCXP-3a的高效凝胶渗透色谱法HPGPC结果图；
图9为高效液相色谱法HPLC结果图；
图10为LCXP-1a的红外光谱结果图；
图11为LCXP-3a的红外光谱结果图；
图12为LCXP-1a和LCXP-3a对巨噬细胞释放NO的影响实验结果图；
图13为LCXP-1a和LCXP-3a对巨噬细胞产生TNF-α的影响实验结果图；
图14为LCXP-1a和LCXP-3a对巨噬细胞产生IL-6的影响实验结果图；
图15为LCXP-1a和LCXP-3a对巨噬细胞产生IL-12p70的影响实验结果图；
图16为LCXP-1a和LCXP-3a对LO2、HepG2、Hep3B直接影响实验结果图；
图17为LCXP-1a和LCXP-3a对HepG2凋亡影响实验结果图；
图18为LCXP-1a和LCXP-3a对Hep3B凋亡影响实验结果图；
图19为LCXP-1a和LCXP-3a对HepG2周期影响实验结果图；
图20为LCXP-1a和LCXP-3a对Hep3B周期影响实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：川芎均一性多糖的提取，如图1、图2、图3、图4所示。
产品1：
一种川芎均一性多糖的提取，具体步骤如下：
1)以川芎为原材料，粗提取川芎粗多糖；
1-1)热水提取步骤：将原料川芎在粉碎机里粉碎，得到川芎粉末；在热水提取反应杯中加入川芎粉末，再加入蒸馏水Ⅰ，置于75℃水浴中搅拌1.5h，过滤收集提取液Ⅰ；残渣中再加入蒸馏水Ⅱ，置于75℃℃水浴中搅拌1.5h，过滤收集提取液Ⅱ；合并提取液Ⅰ和提取液Ⅱ，离心去除沉淀，在旋转蒸发仪上减压浓缩，得到川芎水溶性粗提取物；川芎粉末、蒸馏水Ⅰ和蒸馏水Ⅱ的重量份数比为：川芎粉末150份、蒸馏水Ⅰ1500份、蒸馏水Ⅱ1200份；
1-2)乙醇沉淀步骤：取冷却后的川芎水溶性粗提取物，加入4倍体积的无水乙醇，同时不断搅拌，置于4℃环境，沉淀16h，离心取沉淀物Ⅰ；
1-3)去除蛋白步骤：取沉淀物Ⅰ，用蒸馏水Ⅲ溶解，加入其体积五分之一的sevag试剂，电动快速搅拌8min，再4000rpm离心处理3min；取上清液Ⅰ重复加入其体积五分之一的sevag试剂搅拌离心处理，直到蛋白除尽，得到上清液Ⅱ；沉淀物Ⅰ和蒸馏水Ⅲ的重量份数比为：沉淀物Ⅰ10份、蒸馏水Ⅲ25份；
1-4)透析浓缩冷冻干燥步骤：取上清液Ⅱ，选取截留分子量为3000Da的透析袋，在纯水中透析36h；在旋转蒸发仪上减压浓缩，并在冻干机内冷冻干燥，制得川芎粗多糖。
2)对川芎粗多糖提取物，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取得到川芎多糖LCXP-1、LCXP-3；
2-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将DEAE SepharoseTM FastFlow加入柱管中，静置18h；用0.4mol/L的HCl洗1个柱体积，速度为6mL/min，时间为30min；再用超纯水平衡3～5个柱体积，速度为6～8mL/min，时间为90Min～130Min；
2-2)取川芎粗多糖，溶于蒸馏水Ⅳ中，以速度3mL/min上样，分别用水、0.15mol/L和0.3mol/L的NaCl洗脱40管，8mL/管，速度6mL/min，分别得到洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-2和洗脱液LCXP-3；川芎粗多糖和蒸馏水Ⅳ的重量份数比分别为：川芎粗多糖0.3份、蒸馏水Ⅳ25份；
2-3)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-2和洗脱液LCXP-3的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-3。
2-4)对于洗脱液LCXP-1和洗脱液LCXP-3，选取截留分子量为7500Da的透析袋，在纯水中透析36h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，浓缩后冻干，保存于-20℃环境，分别得到川芎多糖LCXP-1和LCXP-3。
3)对川芎多糖LCXP-1、LCXP-3，采用SephacrylTMS-300High Resolut ion柱层析技术提取得到川芎均一性多糖LCXP-1a、LCXP-3a；
3-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将SephacrylTMS-300HighResolution加入柱管中，静置18h；用PBS平衡液洗1个柱体积，速度为0.3mL/min，时间为200min。
3-2)取川芎多糖LCXP-1，溶于蒸馏水Ⅴ中，以0.3mL/min上样；用PBS平衡液洗脱40管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液LCXP-1a；川芎多糖LCXP-1和蒸馏水Ⅴ的重量份数比分别为：川芎多糖LCXP-1为0.025份、蒸馏水Ⅴ1份；
取川芎多糖LCXP-3，溶于蒸馏水Ⅵ中，以0.3～0.4mL/min上样；用PBS平衡液洗脱40管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液LCXP-3a；川芎多糖LCXP-3和蒸馏水Ⅵ的重量份数比分别为：川芎多糖LCXP-3为0.025份、蒸馏水Ⅵ1份。
3-3)检测洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a。
3-4)针对吸光度为单峰洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a，选取截留分子量为7500Da的透析袋分别透析，在纯水中透析36h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，旋转蒸发浓缩后冻干，保存于-20℃环境，得到两个洗脱片段的川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a。
产品2：
1)以川芎为原材料，粗提取川芎粗多糖；
1-1)热水提取步骤：将原料川芎在粉碎机里粉碎，得到川芎粉末；在热水提取反应杯中加入川芎粉末，再加入蒸馏水Ⅰ，置于85℃水浴中搅拌2.5h，过滤收集提取液Ⅰ；残渣中再加入蒸馏水Ⅱ，置于85℃水浴中搅拌2.5h，过滤收集提取液Ⅱ；合并提取液Ⅰ和提取液Ⅱ，离心去除沉淀，在旋转蒸发仪上减压浓缩，得到川芎水溶性粗提取物；川芎粉末、蒸馏水Ⅰ和蒸馏水Ⅱ的重量份数比为：川芎粉末250份、蒸馏水Ⅰ2500份、蒸馏水Ⅱ2000份；
1-2)乙醇沉淀步骤：取冷却后的川芎水溶性粗提取物，加入4倍体积的无水乙醇，同时不断搅拌，置于4℃环境，沉淀24h，离心取沉淀物Ⅰ；
1-3)去除蛋白步骤：取沉淀物Ⅰ，用蒸馏水Ⅲ溶解，加入其体积五分之一的sevag试剂，电动快速搅拌12min，再4000rpm离心处理5min；取上清液Ⅰ重复加入其体积五分之一的sevag试剂搅拌离心处理，直到蛋白除尽，得到上清液Ⅱ；沉淀物Ⅰ和蒸馏水Ⅲ的重量份数比为：沉淀物Ⅰ20份、蒸馏水Ⅲ50份；
1-4)透析浓缩冷冻干燥步骤：取上清液Ⅱ，选取截留分子量为4000Da的透析袋，在纯水中透析48h；在旋转蒸发仪上减压浓缩，并在冻干机内冷冻干燥，制得川芎粗多糖。
2)对川芎粗多糖提取物，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取得到川芎多糖LCXP-1、LCXP-3；
2-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将DEAE SepharoseTM FastFlow加入柱管中，静置24h；用0.6mol/L的HCl洗1个柱体积，速度为8mL/min，时间为50min；再用超纯水平衡3～5个柱体积，速度为6～8mL/min，时间为90Min～130Min；
2-2)取川芎粗多糖，溶于蒸馏水Ⅳ中，以速度4mL/min上样，分别用水、0.15mol/L和0.3mol/L的NaCl洗脱40管，8mL/管，速度8mL/min，分别得到洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-2和洗脱液LCXP-3；川芎粗多糖和蒸馏水Ⅳ的重量份数比分别为：川芎粗多糖0.4份、蒸馏水Ⅳ30份；
2-3)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-2和洗脱液LCXP-3的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-3。
2-4)对于洗脱液LCXP-1和洗脱液LCXP-3，选取截留分子量为8000Da的透析袋，在纯水中透析48h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，浓缩后冻干，保存于-20℃环境，分别得到川芎多糖LCXP-1和LCXP-3。
3)对川芎多糖LCXP-1、LCXP-3，采用SephacrylTMS-300High Resolut ion柱层析技术提取得到川芎均一性多糖LCXP-1a、LCXP-3a；
3-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将SephacrylTMS-300HighResolution加入柱管中，静置24h；用PBS平衡液洗2个柱体积，速度为0.4mL/min，时间为500min。
3-2)取川芎多糖LCXP-1，溶于蒸馏水Ⅴ中，以0.4mL/min上样；用PBS平衡液洗脱40管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液LCXP-1a；川芎多糖LCXP-1和蒸馏水Ⅴ的重量份数比分别为：川芎多糖LCXP-1为0.035份、蒸馏水Ⅴ1.5份；
取川芎多糖LCXP-3，溶于蒸馏水Ⅵ中，以0.4mL/min上样；用PBS平衡液洗脱40管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液LCXP-3a；川芎多糖LCXP-3和蒸馏水Ⅵ的重量份数比分别为：川芎多糖LCXP-3为0.035份、蒸馏水Ⅵ1.5份。
3-3)检测洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a。
3-4)针对吸光度为单峰洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a，选取截留分子量为8000Da的透析袋分别透析，在纯水中透析48h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，旋转蒸发浓缩后冻干，保存于-20℃环境，得到两个洗脱片段的川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a。
产品3：
1)以川芎为原材料，粗提取川芎粗多糖；
1-1)热水提取步骤：将原料川芎在粉碎机里粉碎，得到川芎粉末；在热水提取反应杯中加入川芎粉末，再加入蒸馏水Ⅰ，置于80℃水浴中搅拌2h，过滤收集提取液Ⅰ；残渣中再加入蒸馏水Ⅱ，置于80℃水浴中搅拌2h，过滤收集提取液Ⅱ；合并提取液Ⅰ和提取液Ⅱ，离心去除沉淀，在旋转蒸发仪上减压浓缩，得到川芎水溶性粗提取物；川芎粉末、蒸馏水Ⅰ和蒸馏水Ⅱ的重量份数比为：川芎粉末200份、蒸馏水Ⅰ2000份、蒸馏水Ⅱ1600份；
1-2)乙醇沉淀步骤：取冷却后的川芎水溶性粗提取物，加入4倍体积的无水乙醇，同时不断搅拌，置于4℃环境，沉淀24h，离心取沉淀物Ⅰ；
1-3)去除蛋白步骤：取沉淀物Ⅰ，用蒸馏水Ⅲ溶解，加入其体积五分之一的sevag试剂，电动快速搅拌10min，再4000rpm离心处理3min；取上清液Ⅰ重复加入其体积五分之一的sevag试剂搅拌离心处理，直到蛋白除尽，得到上清液Ⅱ；沉淀物Ⅰ和蒸馏水Ⅲ的重量份数比为：沉淀物Ⅰ10份、蒸馏水Ⅲ25份；
1-4)透析浓缩冷冻干燥步骤：取上清液Ⅱ，选取截留分子量为3500Da的透析袋，在纯水中透析48h；在旋转蒸发仪上减压浓缩，并在冻干机内冷冻干燥，制得川芎粗多糖。
2)对川芎粗多糖提取物，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取得到川芎多糖LCXP-1、LCXP-3；
2-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将DEAE SepharoseTM FastFlow加入柱管中，静置24h；用0.5mol/L的HCl洗1个柱体积，速度为6mL/min，时间为35min；再用超纯水平衡3～5个柱体积，速度为6～8mL/min，时间为90Min～130Min；
2-2)取川芎粗多糖，溶于蒸馏水Ⅳ中，以速度4mL/min上样，分别用水、0.15mol/L和0.3mol/L的NaCl洗脱40管，8mL/管，速度6mL/min，分别得到洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-2和洗脱液LCXP-3；川芎粗多糖和蒸馏水Ⅳ的重量份数比分别为：川芎粗多糖0.3份、蒸馏水Ⅳ25份；
2-3)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-2和洗脱液LCXP-3的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-3。
2-4)对于洗脱液LCXP-1和洗脱液LCXP-3，选取截留分子量为8000Da的透析袋，在纯水中透析48h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，浓缩后冻干，保存于-20℃环境，分别得到川芎多糖LCXP-1和LCXP-3。
3)对川芎多糖LCXP-1、LCXP-3，采用SephacrylTMS-300High Resolut ion柱层析技术提取得到川芎均一性多糖LCXP-1a、LCXP-3a；
3-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将SephacrylTMS-300HighResolution加入柱管中，静置24h；用PBS平衡液洗1个柱体积，速度为0.3mL/min，时间为260min。
3-2)取川芎多糖LCXP-1，溶于蒸馏水Ⅴ中，以0.3mL/min上样；用PBS平衡液洗脱40管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液LCXP-1a；川芎多糖LCXP-1和蒸馏水Ⅴ的重量份数比分别为：川芎多糖LCXP-1为0.03份、蒸馏水Ⅴ1份；
取川芎多糖LCXP-3，溶于蒸馏水Ⅵ中，以0.3mL/min上样；用PBS平衡液洗脱40管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液LCXP-3a；川芎多糖LCXP-3和蒸馏水Ⅵ的重量份数比分别为：川芎多糖LCXP-3为0.03份、蒸馏水Ⅵ1份。
3-3)检测洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a。
3-4)针对吸光度为单峰洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a，选取截留分子量为8000Da的透析袋分别透析，在纯水中透析48h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，旋转蒸发浓缩后冻干，保存于-20℃环境，得到两个洗脱片段的川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a。
实施例2：川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a的化学组成：
1、实验材料：
实施例1中产品3的条件所制得的川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a、四硼酸钠、间羟基联苯、半乳糖醛酸、浓硫酸、氢氧化钠、苯酚
2、实验方法：
2-1、多糖含量的检测：采用苯酚-硫酸法
分别取LCXP-1a和LCXP-3a多糖样品10mg溶于1000ml蒸馏水，混匀后取2ml于试管中，先加入1ml苯酚溶液(1g苯酚溶于20ml蒸馏水)，混匀后再加入5ml浓硫酸混匀，待冷却后在波长490nm测吸光度，将所测吸光度代入标准曲线进行计算得多糖含量。
2-2、糖醛酸含量的检测：采用间羟基联苯法
间羟基联苯溶液：取0.15g间羟基联苯溶于5mg/ml的氢氧化钠溶液中，定容100ml,浓度为1.5mg/ml；四硼酸钠/硫酸溶液：取0.478g四硼酸钠溶于100ml浓硫酸中；
分别取LCXP-1a和LCXP-3a多糖样品10mg溶于1000ml蒸馏水，混匀后取1ml于具塞试管中，置于冰水浴中，加入6ml四硼酸钠/硫酸溶液，混匀，沸水浴中加热5min,冷水浴中冷却后加入100ul间羟基联苯溶液,混匀并超声去除气泡。在520nm处检测吸光度，将所测吸光度带入标准曲线计算得糖醛酸含量；采用紫外吸收方法检测样品中的蛋白和核酸情况，首先以空白溶剂跑基线，然后测试待测溶液，所用仪器是岛津UV3600。
3、结果：
结果显示LCXP-1a和LCXP-3a的多糖含量分别为99.68％、90.04％；糖醛酸含量分别为4.05％、63.36％；如图5、图6所示，LCXP-1a和LCXP-3a几乎不含蛋白和核酸。
实施例3：川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a的分子量和纯度：
1、实验材料：
实施例1中产品3的条件所制得的川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a、NaNO3NaN3、窄分布聚乙二醇(PEG)
2、实验方法：
分别将LCXP-1a和LCXP-3a上样后用高效凝胶渗透色谱法HPGPC系统(日本岛津LC20凝胶渗透色谱仪；日本TOSOH公司TSKgel GMPWXL水相凝胶色谱柱)分析，用示差检测器(日本Shimadz公司，RID-20a)记录结果。流动相为0.1N NaNO3+0.06％NaN3水溶液，流动相流速0.6mL/min，柱温35℃。标准样品为窄分布聚乙二醇(PEG)，采用窄分布聚乙二醇PEG做标准曲线，使用相对校正法，测试完成后用葡聚糖的参数做普适校正。
3、结果：
结果显示LCXP-1a和LCXP-3a皆为单一的对称峰，表明其为均一的多糖，分子量大小分别为11159Da和203486Da，结果如图7、图8所示。
实施例4:川芎均一性多糖的单糖组成成分。
1、实验材料：
实施例1中产品3的条件所制得的川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a、甘露糖对照品、核糖对照品、鼠李糖对照品、葡萄糖醛酸对照品、半乳糖醛酸对照品、N-乙酰-氨基葡萄糖对照品、葡萄糖对照品、N-乙酰-氨基半乳糖对照品、半乳糖对照品、木糖对照品、阿拉伯糖对照品、岩藻糖对照品、PMP-甲醇、TFA、氯仿、磷酸二氢钾溶液、氢氧化钠溶液、乙腈、NaOH、HCl
2、实验方法：
对照品溶液的配置：精密称取甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖、N-乙酰-氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖对照品适量，加水溶解稀释至每1ml中各含50ug的混合对照溶液，精确吸取250uL混合对照溶液到5mLEP管中，加入250uL0.6 mol/LNaOH，500uL 0.4mol/LPMP-甲醇，70℃反应1h。冷水中冷却10min；加入500uL 0.3mol/LHCl中和，再加入1mL氯仿漩涡1min，3000r/min离心10min,取上清，萃取3次，得到对照品溶液。
样品的配置：分别精密移取LCXP-1a、LCXP-3a样品0.4ml至不同的5ml安培瓶中，加入1.0mL2 mol/L TFA于5mL安瓿中，封管，110℃酸解8h.取出挥干TFA，加1.0ml水复溶，得到LCXP-1a混合溶液和LCXP-3a混合溶液，分别精确吸取250uL LCXP-1a和LCXP-3a的混合溶液到不同的5mLEP管中，加入250uL0.6 mol/LNaOH，500uL 0.4mol/LPMP-甲醇，70℃反应1h。冷水中冷却10min；加入500uL 0.3mol/LHCl中和，再加入1mL氯仿漩涡1min，3000r/min离心10min,取上清，萃取3次，得到样品溶液。
取配置好的样品溶液上清液，用于HPLC上机测试(仪器：岛津LC-20AD；色谱柱：Xtimate C18 4.6*200mm,5μm)，以20μL进样，流动相为0.05M磷酸二氢钾溶液(用氢氧化钠溶液调PH为6.70)-乙腈＝83-17，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，采用250nm波长检测；通过红外光谱检测川芎均一性多糖的红外吸收情况。
3、结果：
表1 LCXP-1a和LCXP-3a的单糖组成
Figure BDA0002636114750000131
-表示没有检测到该单糖；Tr.表示含量较少(<0.5％).
通过高效液相色谱HPLC对川芎均一性多糖的单糖组成检测，结果如图9和表1所示。
实施例5：川芎均一性多糖的红外吸收情况
1、实验材料：
实施例1中产品3的条件所制得的川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a、KBr
2、实验方法：
分别取LCXP-1a和LCXP-3a样品与KBr约以1:100的比例混合研磨均匀，分别得到LCXP-1a混合样品和LCXP-3a混合样品，分别取100mgLCXP-1a混合样品和LCXP-3a混合样品进行压片，压力为10MPa。以空白KBr压片作为参比采集背景，然后采集样品的红外光谱。红外仪器是美国尼高力公司的Nicolet iS10，波数范围400-4000cm-1，分辨率4cm-1，室温条件下进行。
3、结果：
结果如图10、图11所示，川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a的红外光谱在3400cm-1附近的吸收峰是因O-H伸缩振动；在2928.86cm-1和1420.15cm-1附近的吸收峰与C-H的伸缩和弯曲振动有关；图10为LCXP-1a红外图在1643.46cm-1处的吸收峰表示C＝O的不对称伸缩振动，而图11为LCXP-3a红外图在1633.28cm-1处的吸收带表示C＝C的伸缩振动；图11中1743.27cm-1附近的峰由羰基引起，表示糖醛酸的存在；图10和图11在1370.01cm-1处的吸收峰与C-H键的变形振动有关；LCXP-1a在1156.05cm-1处的吸收峰暗示吡喃糖的存在，1022.91cm-1表示C-O-H的变形振动，表示可能富含葡萄糖，而LCXP-3a在1246.66cm-1的峰由木聚糖乙酰基中糖苷C-O键引起；两个图在1200—1000cm-1区域内的信号归于C-O-C的伸缩振动,证明他们有吡喃糖环,1000-520cm-1之间的很多峰暗示有吡喃糖环上的β糖苷键；此外，LXP-1a在850.16和761.51cm-1代表可能为D-吡喃葡萄糖衍生物。
实施例6：川芎均一性多糖促进巨噬细胞产生NO和细胞因子
1、实验材料：
实施例1中产品3条件所制得的川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a、细胞因子ELISA检测试剂盒、一氧化氮检测试剂盒、巨噬细胞
2、实验方法：
样品溶液的配制：分别称取LCXP-1a和LCXP-3a各10mg溶解于2mL PBS中，制得浓度为5mg/mL的溶液。ADM的浓度为0.4mg/mL。
将巨噬细胞RAW264.7铺板于24孔板中(5×104cel ls/ml)，待细胞贴壁后分别取不同体积LCXP-1a和LCXP-3a加入不同的孔中，分别形成浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LCXP-1a孔和浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LCXP-3a孔，作用24h后，收集培养基上清，2000rpm离心10分钟，使用一氧化氮检测试剂盒和细胞因子ELISA试剂盒按操作说明书分别检测NO、TNF-α、IL-6、IL-12p70的含量。
3、结果：
1、分别检测LCXP-1a和LCXP-3a对巨噬细胞NO分泌的影响：
结果显示浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LCXP-1a以及浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LCXP-3a都能促进巨噬细胞生成NO，而且100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LCXP-3a产生的NO均高于相应浓度的LCXP-1a，结果如图12所示。
2、检测LCXP-1a和LCXP-3a对巨噬细胞释放TNF-α、IL-6、IL-12p70的影响：
结果显示：浓度为200μg/mL和400μg/mL的LCXP-1a以及100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LCXP-3a都能促进巨噬细胞生成TNF-α。并且100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LCXP-3a产生的TNF-α均高于相应浓度的LCXP-1a，结果如图13所示。
浓度为100μg/mL和400μg/mL的LCXP-1a以及50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LCXP-3a都能促进巨噬细胞生成IL-6。且50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LCXP-3a产生的IL-6均高于相应浓度的LCXP-1a，结果如图14所示。
浓度为200μg/mL的LCXP-3a能促进巨噬细胞生成IL-6，且高于相应浓度的LCXP-1a，结果如图15所示。
实施例7：川芎均一性多糖通过免疫调节发挥抗肝癌作用
1、实验材料：
实施例1中产品3条件所制得的川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a、CCK-8检测试剂盒、胰酶、青-链霉素、巨噬细胞、肝癌细胞HepG2、Hep3B、正常肝细胞LO2、胎牛血清
2、实验方法：
样品溶液的配制：分别称取LCXP-1a和LCXP-3a各10mg溶解于2mL DMEM中，制得浓度为5mg/mL的溶液。ADM的浓度为0.4mg/mL。
CCK-8实验：
将HepG2、Hep3B、LO2细胞分别铺板于96孔板中(1×104cell s/ml)，待细胞贴壁后分别取不同体积LCXP-1a和LCXP-3a加入不同的孔中，分别形成浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LCXP-1a作用孔和浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的LCXP-3a作用孔，作用24h后，使用CCK-8检测试剂盒按操作说明书分别检测细胞情况，细胞抑制率(％)＝[OD(对照)-OD(实验)]/[OD(对照)-OD(空白)]×100％。
凋亡周期实验：
分别设置6个组，包括直接作用组(药物直接作用于HepG2或Hep3B)，分别为空白组、LCXP-1a、LCXP-3a；共培养组(RAW264.7与HepG2或Hep3B共培养)，分别为RAW264.7、RAW264.7+LCXP-1a、RAW264.7+LCXP-3a。
将HepG2、Hep3B细胞分别铺板于6孔板,其中3个分别用DMEM，200μg/mL的LCXP-1a、LCXP-3a处理；另外3个孔采用小室与RAW264.7共培养，RAW264.7加入DMEM，200μg/mL的LCXP-1a、LCXP-3a处理，处理24h后，收集6孔板细胞，用PBS清洗3次后，加入500μL PBS制成细胞悬液，进行Annexin-V-FITC/PI双染色后进行流式凋亡检测；同样，收集用于周期检测得细胞后，用PBS洗3次，用70％得乙醇4℃过夜固定后，用PI染色后进行流式细胞检测。
3、结果：
3-1、LCXP-1a和LCXP-3a对LO2、HepG2、Hep3B的直接影响
LCXP-1a对LO2、HepG2、Hep3B三种细胞几乎没有明显的抑制作用；LCXP-3a对LO2不会产生抑制作用，差异没有统计学意义，而200μg/mL和400μg/mL的LCXP-3a则会对HepG2和Hep3B产生一定的抑制，结果如图16所示。
3-2、LCXP-1a和LCXP-3a对HepG2、Hep3B的间接作用
从凋亡结果看，共培养后，两种肝癌细胞的凋亡率有所提高，经LCXP-3a作用后的巨噬细胞对肿瘤的抑制作用增强，结果如图17和图18所示。
从周期结果来看，经LCXP-3a作用后的巨噬细胞可以使得两种肝癌细胞的G0/G1期增加，S期减少，说明可以抑制肝癌细胞的增殖，且发生G0/G1阻滞，结果如图19和图20所示。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种川芎均一性多糖的提取方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)以川芎为原材料，粗提取川芎粗多糖；
2)对川芎粗多糖提取物，采用DEAE SepharoseTMFast Flow柱层析技术提取得到川芎多糖LCXP-1、LCXP-3；
3)对川芎多糖LCXP-1、LCXP-3，采用SephacrylTMS-300 High Resolution柱层析技术提取得到川芎均一性多糖LCXP-1a、LCXP-3a。
2.如权利要求1所述的一种川芎均一性多糖的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述粗提取川芎粗多糖的具体方法如下：
1-1)热水提取步骤：将原料川芎在粉碎机里粉碎，得到川芎粉末；在热水提取反应杯中加入川芎粉末，再加入蒸馏水I，置于75℃～85℃水浴中搅拌1.5～2.5h，过滤收集提取液I；残渣中再加入蒸馏水II，置于75℃～85℃水浴中搅拌1.5～2.5h，过滤收集提取液II；合并提取液I和提取液II，离心去除沉淀，在旋转蒸发仪上减压浓缩，得到川芎水溶性粗提取物；川芎粉末、蒸馏水I和蒸馏水II的重量份数比为：川芎粉末150～250份、蒸馏水I 1500～2500份、蒸馏水II 1200～2000份；
1-2)乙醇沉淀步骤：取冷却后的川芎水溶性粗提取物，加入4倍体积的无水乙醇，同时不断搅拌，置于4℃环境，沉淀16～24h，离心取沉淀物I；
1-3)去除蛋白步骤：取沉淀物I，用蒸馏水III溶解，加入其体积五分之一的sevag试剂，电动快速搅拌8～12min，再4000rpm离心处理3～5min；取上清液I重复加入其体积五分之一的sevag试剂搅拌离心处理，直到蛋白除尽，得到上清液II；沉淀物I和蒸馏水III的重量份数比为：沉淀物I 10～20份、蒸馏水III 25～50份；
1-4)透析浓缩冷冻干燥步骤：取上清液II，选取截留分子量为3000Da～4000Da的透析袋，在纯水中透析36～48h；在旋转蒸发仪上减压浓缩，并在冻干机内冷冻干燥，制得川芎粗多糖。
3.如权利要求2所述的一种川芎均一性多糖的提取方法，其特征在于，
步骤1-1)中水浴温度都为80℃、搅拌时间都为2h、川芎粉末200份、蒸馏水I 2000份、蒸馏水II 1600份；
步骤1-2)中沉淀时间24h；
步骤1-3)中搅拌时间10min、离心时间3min、沉淀物I 10份、蒸馏水III 25份；
步骤1-4)中截留分子量3500Da、透析时间48h。
4.如权利要求1所述的一种川芎均一性多糖的提取方法，其特征在于，步骤2)中所述采用DEAE SepharoseTMFast Flow柱层析技术提取川芎多糖的具体步骤如下：
2-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将DEAE SepharoseTMFast Flow加入柱管中，静置18～24h；用0.4～0.6mol/L的HCl洗1个柱体积，速度为6～8mL/min，时间为30～50min；再用超纯水平衡3～5个柱体积，速度为6～8mL/min，时间为90Min～130Min；
2-2)取川芎粗多糖，溶于蒸馏水IV中，以速度3～4mL/min上样，分别用水、0.15mol/L和0.3mol/L的NaCl洗脱40管，8mL/管，速度6～8mL/min，分别得到洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-2和洗脱液LCXP-3；川芎粗多糖和蒸馏水IV的重量份数比分别为：川芎粗多糖0.3～0.4份、蒸馏水IV 25～30份；
2-3)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-2和洗脱液LCXP-3的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液LCXP-1、洗脱液LCXP-3。
2-4)对于洗脱液LCXP-1和洗脱液LCXP-3，选取截留分子量为7500Da～8000Da的透析袋，在纯水中透析36-48h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，浓缩后冻干，保存于-20℃环境，分别得到川芎多糖LCXP-1和LCXP-3。
5.如权利要求4所述的一种川芎均一性多糖的提取方法，其特征在于，
步骤2-1)中静置时间24h、HCl浓度0.5mol/L、HCl清洗速度6mL/min、HCl清洗时间35min；
步骤2-2)中上样速度4mL/min、洗脱速度6mL/min、川芎粗多糖0.3份、蒸馏水IV 25份；
步骤2-4)中截留分子量8000Da、透析时间48h。
6.如权利要求1所述的一种川芎均一性多糖的提取方法，其特征在于，步骤3)中所述采用SephacrylTMS-300 High Resolution柱层析技术提取川芎均一性多糖的具体步骤如下：
3-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将SephacrylTMS-300 HighResolution加入柱管中，静置18～24h；用PBS平衡液洗1～2个柱体积，速度为0.3～0.4mL/min，时间为200～500min。
3-2)取川芎多糖LCXP-1，溶于蒸馏水V中，以0.3～0.4mL/min上样；用PBS平衡液洗脱40管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液LCXP-1a；川芎多糖LCXP-1和蒸馏水V的重量份数比分别为：川芎多糖LCXP-1为0.025～0.035份、蒸馏水V 1～1.5份；
取川芎多糖LCXP-3，溶于蒸馏水Ⅵ中，以0.3～0.4mL/min上样；用PBS平衡液洗脱40管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液LCXP-3a；川芎多糖LCXP-3和蒸馏水Ⅵ的重量份数比分别为：川芎多糖LCXP-3为0.025～0.035份、蒸馏水Ⅵ 1～1.5份。
3-3)检测洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a。
3-4)针对吸光度为单峰洗脱液LCXP-1a和LCXP-3a，选取截留分子量为7500Da～8000Da的透析袋分别透析，在纯水中透析36～48h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，旋转蒸发浓缩后冻干，保存于-20℃环境，得到两个洗脱片段的川芎均一性多糖LCXP-1a和LCXP-3a。
7.如权利要求6所述的一种川芎均一性多糖的提取方法，其特征在于，
步骤3-1)中静置时间24h、PBS平衡液洗1个柱体积、PBS平衡液平衡速度0.3mL/min、PBS平衡液平衡时间260min；
步骤3-2)中上样速度都为0.3mL/min、川芎多糖LCXP-1 0.03份、蒸馏水V 1份、川芎多糖LCXP-3 0.03份、蒸馏水Ⅵ 1份；
步骤3-4)中截留分子量8000Da、透析时间48h。
8.如权利要求1-7所述的一种川芎均一性多糖的提取方法提取的川芎均一性多糖，其特征在于，所述川芎多糖LCXP-1a的组成如下：
分子量为：11159Da；
总多糖含量为：99.68％；
糖醛酸含量为：4.05％；
单糖组成为：甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖。
9.如权利要求1-7所述的一种川芎均一性多糖的提取方法提取的川芎均一性多糖，其特征在于，所述川芎多糖LCXP-3a的组成如下：
分子量为：203486Da；
总多糖含量为：90.04％；
糖醛酸含量为：63.36％；
单糖组成为：甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖。
10.如权利要求8或9所述的一种川芎均一性多糖在肝癌免疫调节抗肿瘤方面的应用。
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