CN111320709A - 北沙参酸性多糖提取方法及其提取物与其免疫调节的应用 - Google Patents

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Abstract

一种北沙参酸性多糖提取方法，具体为：1)以北沙参为原材料，经过热水提取步骤、乙醇沉淀步骤、去除蛋白步骤、透析浓缩冷冻干燥步骤，制得北沙参粗多糖；2)对北沙参粗多糖，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取北沙参多糖；3)对北沙参多糖，采用SephacrylTMS‑300 High Resolution柱层析技术提取北沙参酸性多糖。北沙参酸性多糖在肺癌免疫调节抗肿瘤的实验表明北沙参酸性多糖具有肺癌免疫调节抗肿瘤的作用。

Description

北沙参酸性多糖提取方法及其提取物与其免疫调节的应用
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，特别是一种北沙参酸性多糖的提取方法及其提取物与应用。
背景技术
北沙参(Glehnia littoralis)，别名莱阳参、海沙参、银沙参，为伞形科植物珊瑚菜干燥根。北沙参主要有效成分为多糖、挥发油类、香豆素类和苷类等，其中多糖成分含量最高。北沙参多糖(Glehnia littoralis polysaccharides,GLP)不仅增强机体免疫功能，还具有抗肿瘤活性，能抑制肺癌细胞的增殖和迁移，可作为一种新型天然抗癌药物的来源。研究表明许多免疫类多糖可以通过激活免疫细胞，特别是抗原呈递细胞来发挥免疫调节作用。抗原呈递细胞表面有大量的Toll样受体(TLR)，可以识别抗原并激活细胞内信号通路，在先天和适应性免疫反应中至关重要。TLR4广泛表达于多种肿瘤细胞和免疫细胞，作为宿主先天免疫反应的重要激活剂，参与了一些中药多糖的抗肿瘤活性。
传统的多糖的分离提取方法包括水提醇沉法以及酶提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法、超高压提取技术微波辅助提取法和双水相萃取等新技术,对其分离原理、处理方式和效果都不相同。
在CN105985452A中公开了一种名为“一种北沙参多糖的提取方法及其应用”的发明专利，它采用北沙参粉碎、热水浸提、抽滤、真空浓缩、乙醇沉淀、干燥等步骤，提取了北沙参多糖。其不足在于没有用柱层析方法进一步的分离纯化，提取的北沙参多糖不是均一性多糖，纯度低，未能检测出其分子量和单糖组成。
在CN105859903A公开了一种名为“一种北沙参多糖的提取方法”的发明专利，该对比文件的方法为：1、提取干燥的河北道地药材北沙参，粉碎，除去含有的脂溶性化合物；药材残渣蒸馏水提取，浓缩，加入无水乙醇沉淀，干燥后得北沙参粗多糖；2、分离和纯化a、除蛋白；b、除色素；c、进一步分离和纯化，得到所述的北沙参多糖。
该对比文件与本申请相比，区别在于：1、提取细节不一样，例如对比文件在北沙参粉碎后使用了95％的酒精在55-65℃条件下提取2-3次；使用超声功率200-300W的超声波提取；除蛋白过程和除色素过程；透析过程；洗脱液的成分等。2、对比文件提取的北沙参多糖分子量和成分不同，实际上与本申请相比为两种不同物质。3、对比文件的北沙参多糖用于抗肿痛或抗氧化，本申请用于调节免疫力从而治疗肺癌免疫力。其不足在于：1、对比文件提取的北沙参多糖为中性多糖，相比于北沙参酸性多糖不能提高巨噬细胞的免疫活性；2、对比文件提取的北沙参多糖仅在肝癌方面进行了研究，没有涉及到肺癌的相关实验。
发明内容
本发明的目的就是提供一种北沙参酸性多糖提取方法及其提取物与其免疫调节的应用。
一种北沙参酸性多糖提取方法，具体步骤如下：
1)以北沙参为原材料，粗提取北沙参粗多糖；
2)对北沙参粗多糖提取物，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取北沙参多糖GLP-2；
3)对北沙参多糖GLP-2，采用SephacrylTMS-300High Resolution柱层析技术提取北沙参酸性多糖GLP-2a。
进一步，步骤1)中所述粗提取北沙参粗多糖的具体方法如下：
1-1)热水提取步骤：将原料北沙参在粉碎机里粉碎，得到北沙参粉末；在热水提取反应杯中加入北沙参粉末，再加入蒸馏水Ⅰ，置于80℃水浴中搅拌2小时，过滤收集提取液Ⅰ；残渣中再加入蒸馏水Ⅱ，置于80℃水浴中搅拌2小时，过滤收集提取液Ⅱ；合并提取液Ⅰ和提取液Ⅱ，离心去除沉淀，在旋转蒸发仪上减压浓缩，得到北沙参水溶性粗提取物；北沙参粉末、蒸馏水Ⅰ和蒸馏水Ⅱ的重量份数比为：北沙参粉末200份、蒸馏水Ⅰ2000份、蒸馏水Ⅱ1600份；
1-2)乙醇沉淀步骤：取冷却后的北沙参水溶性粗提取物，加入4倍体积的无水乙醇，同时不断搅拌，置于4℃环境，沉淀24小时，离心取沉淀物Ⅰ；
1-3)去除蛋白步骤：取沉淀物Ⅰ，用蒸馏水Ⅲ溶解，加入其体积五分之一的sevag试剂，电动快速搅拌10Min，再4000rpm离心处理3min；取上清液Ⅰ重复加入其体积五分之一的sevag试剂搅拌离心处理，直到蛋白除尽，得到上清液Ⅱ；沉淀物Ⅰ和蒸馏水Ⅲ的重量份数比为：沉淀物Ⅰ10份、蒸馏水Ⅲ25份；
1-4)透析浓缩冷冻干燥步骤：取上清液Ⅱ，选取截留分子量为8000Da的透析袋，在纯水中透析48小时；在旋转蒸发仪上减压浓缩，并在冻干机内冷冻干燥，制得北沙参粗多糖。
进一步，步骤2)中所述采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取北沙参多糖的具体步骤如下：
2-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水，将DEAE SepharoseTM FastFlow加入柱管中，静置24小时；用0.5mol/L的HCl洗1个柱体积，速度为6mL/min，时间为35Min；再用超纯水平衡4个柱体积，速度为8mL/min，时间为90Min；
2-2)取北沙参粗多糖，溶于蒸馏水Ⅳ中，以速度4mL/min上样，分别用水、0.2mol/L和0.4mol/L的NaCl洗脱30管，8mL/管，速度6mL/min，分别得到洗脱液GLP-1、洗脱液GLP-2和洗脱液GLP-3；北沙参粗多糖和蒸馏水Ⅳ的重量份数比分别为：北沙参粗多糖0.3份、蒸馏水Ⅳ25份；
2-3)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液GLP-1、洗脱液GLP-2和洗脱液GLP-3的吸光度；选取第一洗脱主峰的洗脱液GLP-1、第二洗脱主峰的洗脱液GLP-2、第三洗脱主峰的洗脱液GLP-3；
2-4)针对洗脱液GLP-2，选取截留分子量为8000Da的透析袋，在纯水中透析48h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，浓缩并冻干，保存于-20℃环境，得到北沙参多糖GLP-2。
进一步，步骤3)中所述采用SephacrylTMS-300High Resolution柱层析技术提取北沙参酸性多糖的具体步骤如下：
3-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水，将SephacrylTMS-300HighResolution加入柱管中，静置24小时；用平衡液洗1个柱体积，速度为0.3mL/min，时间为260Min；平衡液的配置组成及其重量份数比为：3.04份磷酸二氢钠、4.33份磷酸氢二钠、8.77份氯化钠，溶解于1000份的超纯水中，加NaOH中和至pH为7；
3-2)取北沙参多糖GLP-2，溶于蒸馏水Ⅴ中，以0.3mL/min上样；用平衡液洗脱30管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液GLP-2a；平衡液的配置组成及其重量份数比为：3.04份磷酸二氢钠、4.33份磷酸氢二钠、8.77份氯化钠，溶解于1000份的超纯水中，加NaOH中和至pH7；北沙参多糖GLP-2和蒸馏水Ⅴ的重量份数比分别为：北沙参多糖GLP-2为0.03份、蒸馏水Ⅴ1份；
3-3)检测洗脱液GLP-2a的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液GLP-2a；选取第一洗脱主峰的洗脱液GLP-2；
3-4)针对吸光度为单峰洗脱液GLP-2a，选取截留分子量为8000Da的透析袋，在纯水中透析48小时，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，旋转蒸发浓缩，再冻干后保存于-20℃环境，得到北沙参酸性多糖GLP-2a。
采用上述提取方法制备得到的北沙参酸性多糖，所述北沙参酸性多糖分子量为337.38kDa；所述北沙参酸性多糖的单糖组成和摩尔比为：甘露糖：核糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.12:0.74:0.45:1.11:0.88:91.74:2.81:2.2。
本发明还提供了上述北沙参酸性多糖在肺癌免疫调节抗肿瘤方面的应用。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
本发明首先以北沙参为原材料，采用传统的水提醇沉法提取北沙参粗多糖，接着将提取的北沙参粗多糖通过两次柱层析分离纯化，得到北沙参酸性多糖，且具有较强的免疫活性。本发明通过柱层析方法进行进一步的分离纯化，从北沙参中提取纯化得到的酸性多糖是均一性多糖，且纯度高，并检测出其分子量和单糖组成。本发明提取的北沙参酸性多糖具有独有分子量和成分，通过试验证明,本发明提取的北沙参酸性多糖促进巨噬细胞释放NO和TNF-α具有更高的免疫活性，可以用于肺癌免疫调节抗肿瘤。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。
附图说明
本发明的附图说明如下。
图1为DEAE SepharoseTM Fast Flow洗脱曲线；
图2为SephacrylTMS-300High Resolution洗脱曲线；
图3为凝胶渗透色谱结果图；
图4为高效液相色谱结果图；
图5为本发明的多糖提取流程图；
图6为实施例中GLP-1a和GLP-2a对巨噬细胞释放NO的影响实验结果图；
图7为实施例中GLP-1a和GLP-2a对巨噬细胞产生TNF-α的影响实验结果图；
图8为实施例中GLP-2a对瘤体重量的影响实验结果图；
图9为实施例中GLP-2a对抑瘤率的影响实验结果图；
图10为实施例中GLP-2a对脾脏指数的影响实验结果图；
图11为实施例中GLP-2a对胸腺指数的影响实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：北沙参酸性多糖GLP-2a的提取
一种北沙参酸性多糖的提取，具体步骤如下：
1)以北沙参为原材料，粗提取北沙参粗多糖：
1-1)热水提取步骤：将原料北沙参在粉碎机里粉碎，得到北沙参粉末；在热水提取反应杯中加入北沙参粉末，再加入蒸馏水Ⅰ，置于80℃水浴中搅拌2小时，过滤收集提取液Ⅰ；残渣中再加入蒸馏水Ⅱ，置于80℃水浴中搅拌2小时，过滤收集提取液Ⅱ；合并提取液Ⅰ和提取液Ⅱ，离心去除沉淀，在旋转蒸发仪上减压浓缩，得到北沙参水溶性粗提取物；北沙参粉末、蒸馏水Ⅰ和蒸馏水Ⅱ的重量份数比为：北沙参粉末200份、蒸馏水Ⅰ2000份、蒸馏水Ⅱ1600份；
1-2)乙醇沉淀步骤：取冷却后的北沙参水溶性粗提取物，加入4倍体积的无水乙醇，同时不断搅拌，置于4℃环境，沉淀24小时，离心取沉淀物Ⅰ；
1-3)去除蛋白步骤：取沉淀物Ⅰ，用蒸馏水Ⅲ溶解，加入其体积五分之一的sevag试剂，电动快速搅拌10Min，再4000rpm离心处理3min；取上清液Ⅰ重复加入其体积五分之一的sevag试剂搅拌离心处理，直到蛋白除尽，得到上清液Ⅱ；沉淀物Ⅰ和蒸馏水Ⅲ的重量份数比为：沉淀物Ⅰ10份、蒸馏水Ⅲ25份；
1-4)透析浓缩冷冻干燥步骤：取上清液Ⅱ，选取截留分子量为8000Da的透析袋，在纯水中透析48小时；在旋转蒸发仪上减压浓缩，并在冻干机内冷冻干燥，制得北沙参粗多糖。
2)对北沙参粗多糖提取物，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取北沙参多糖GLP-2：
2-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水，将DEAE SepharoseTM FastFlow加入柱管中，静置24小时；用0.5mol/L的HCl洗1个柱体积，速度为6mL/min，时间为35Min；再用超纯水平衡4个柱体积，速度为8mL/min，时间为90Min；
2-2)取北沙参粗多糖，溶于蒸馏水Ⅳ中，以速度4mL/min上样，分别用水、0.2mol/L和0.4mol/L的NaCl洗脱30管，8mL/管，速度6mL/min，分别得到洗脱液GLP-1、洗脱液GLP-2和洗脱液GLP-3；北沙参粗多糖和蒸馏水Ⅳ的重量份数比分别为：北沙参粗多糖0.3份、蒸馏水Ⅳ25份；
2-3)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液GLP-1、洗脱液GLP-2和洗脱液GLP-3的吸光度；选取第一洗脱主峰的洗脱液GLP-1、第二洗脱主峰的洗脱液GLP-2、第三洗脱主峰的洗脱液GLP-3；
2-4)针对洗脱液GLP-2，选取截留分子量为8000Da的透析袋，在纯水中透析48h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，浓缩并冻干，保存于-20℃环境，得到北沙参多糖GLP-2。
3)对北沙参多糖GLP-2，采用SephacrylTMS-300High Resolution柱层析技术提取北沙参酸性多糖GLP-2a：
3-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水，将SephacrylTMS-300HighResolution加入柱管中，静置24小时；用平衡液洗1个柱体积，速度为0.3mL/min，时间为260Min；平衡液的配置组成及其重量份数比为：3.04份磷酸二氢钠、4.33份磷酸氢二钠、8.77份氯化钠，溶解于1000份的超纯水中，加NaOH中和至pH为7；
3-2)取北沙参多糖GLP-2，溶于蒸馏水Ⅴ中，以0.3mL/min上样；用平衡液洗脱30管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液GLP-2a；平衡液的配置组成及其重量份数比为：3.04份磷酸二氢钠、4.33份磷酸氢二钠、8.77份氯化钠，溶解于1000份的超纯水中，加NaOH中和至pH7；北沙参多糖GLP-2和蒸馏水Ⅴ的重量份数比分别为：北沙参多糖GLP-2为0.03份、蒸馏水Ⅴ1份；
3-3)检测洗脱液GLP-2a的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液GLP-2a；选取第一洗脱主峰的洗脱液GLP-2；
3-4)针对吸光度为单峰洗脱液GLP-2a，选取截留分子量为8000Da的透析袋，在纯水中透析48小时，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，旋转蒸发浓缩，再冻干后保存于-20℃环境，得到北沙参酸性多糖GLP-2a。
通过高效凝胶渗透色谱法HPGPC鉴定步骤3-4)得到的北沙参酸性多糖的分子量GLP-2a和纯度：
将GLP-2a上样后用HPGPC系统(日本Shimadzu公司LC20高效液相色谱泵；日本TOSOH公司TSKgel GMPWXL水相凝胶色谱柱)分析，用示差检测器(日本Shimadz公司，RID-20a)记录结果。流动相为0.1N NaNO3+0.06％NaN3水溶液，流动相流速0.6mL/min，柱温35℃。标准样品为窄分布聚乙二醇(PEG)，采用窄分布PEG做标准曲线，使用相对校正法，测试完成后用葡聚糖的参数做普适校正。
结果显示GLP-2a为单一的对称峰，表明其为均一的多糖，分子量大小为337.38kDa；鉴定结果如图1至图3所示。
通过高效液相色谱法HPCL检测步骤3-4)得到的北沙参酸性多糖的单糖组成：
对照溶液的配置：精密称取甘露糖，鼠李糖，乳糖，葡萄糖木糖，阿拉伯糖，葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸等对照品适量，加水溶解稀释至每毫升中各含50μg的混合对照溶液。
衍生步骤：精确吸取250μL混合对照溶液到5mL EP管中，加入250μL 0.6mol/LNaOH，500μL 0.4mol/L PMP-甲醇，70℃反应1h。冷水中冷却10min；加入500μL0.3mol/L HCl中和，再加入1mL氯仿漩涡1min，3000r/min离心10min,小心取上清，萃取3次，上清用于HPLC。
待测样品水解：精密移取样品0.5mL至5mL安培瓶中，加入0.5mL 2mol/L TFA于5mL安瓿中，封管，110℃酸解8h。取出挥干TFA，加1.0mL水复溶。
样品溶液衍生：精确吸取250μL GLP-2a样品溶液到5mL EP管中，加入250μL0.6mol/L NaOH，500μL 0.4mol/L PMP-甲醇，70℃反应1h，冷水中冷却10min；加入500μL0.3mol/L HCl中和，再加入1mL氯仿漩涡1min，3000r/min离心10min,小心取上清，萃取3次。
取上清液，用于HPLC上机测试(仪器：Ultimate 3000；色谱柱：Xtimate C184.6*200mm,5μm)，以20μL进样，流动相为0.05M磷酸二氢钾溶液(用氢氧化钠溶液调PH为6.70)-乙腈＝83-17，柱温为30℃，流速保持在1.0ml/min，采用250nm波长检测；检测结果如图4所示。
采用上述提取方法制备得到的北沙参酸性多糖，分子量为337.38kDa；北沙参酸性多糖的单糖组成和摩尔比为：甘露糖：核糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.12:0.74:0.45:1.11:0.88:91.74:2.81:2.2。
实施例2：北沙参酸性多糖在肺癌免疫调节抗肿瘤的实验
实验所用北沙参酸性多糖通过上述方式制得，分子量为337.38kDa；北沙参酸性多糖的单糖组成和摩尔比为：甘露糖：核糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.12:0.74:0.45:1.11:0.88:91.74:2.81:2.2。
方法：检测GLP-1a和GLP-2a对巨噬细胞释放NO的影响、检测GLP-1a和GLP-2a对巨噬细胞产生TNF-α的影响、检测GLP-2a对小鼠瘤体重量的影响、检测GLP-2a对小鼠抑瘤率的影响、检测GLP-2a对小鼠脾脏指数的影响、检测GLP-2a对小鼠胸腺指数的影响。
仪器和材料：酶标仪((Mul-tiskanFC,Thermo,Waltham,MA,USA)，细胞因子ELISA检测试剂盒，一氧化氮检测试剂盒，胰酶，青-链霉素，巨噬细胞，Lewis肺癌细胞，胎牛血清，细胞培养液，细胞培养皿/细胞培养板/离心管/冻存管等。
实验动物：肺癌小鼠。
样品溶液的配制：称取GLP-1a和GLP-2a各10mg溶解于2mL生理盐水，制得浓度为5mg/mL的溶液。ADM的浓度为0.4mg/mL。
检测结果如图6至图11所示：
1、分别检测GLP-1a和GLP-2a对小鼠腹腔巨噬细胞NO分泌的影响：
结果显示低、中浓度(125μg/mL,250μg/mL)的GLP-1a，中、高浓度(250μg/mL,500μg/mL)的GLP-2a能促进巨噬细胞生成NO(差异有统计学意义)，而且中、高浓度的GLP-2a产生的NO均高于低、中浓度的GLP-1a。
2、检测GLP-1a和GLP-2a对巨噬细胞释放TNF-α的影响：
结果显示三种浓度梯度的GLP-1a和GLP-2a均促进巨噬细胞释放TNF-α，差异有统计学意义。并且，三种浓度梯度的GLP-2a促进巨噬细胞生成的TNF-α均高于GLP-1a，显示了更高的免疫活性。
3、瘤体重量：
给药GLP-2a 30d后，各组瘤重均值分别为NS组(0.2ml/d)5.467g，ADM组(4mg/kg/d)3.041g。低剂量GLP-2a组4.604g，中剂量GLP-2a组4.006g，高剂量GLP-2a组4.217g。数据显示，ADM组小鼠瘤重与NS组相比，明显减小，ADM抑瘤效果显著(P<0.01)。低、中、高三种剂量的GLP-2a处理组与NS组比较，瘤重均有所下降，但只有中剂量组和高剂量组的GLP-2a，减小的差异有统计学意义(P<0.05)。
4、抑瘤率：
结果整理得各组抑瘤率分别为ADM组44.43％，低剂量GLP-2a组15.81％，中剂量GLP-2a组26.73％，高剂量GLP-2a组22.91％。结果显示，ADM组小鼠肿瘤质量与NS组相比明显减小，抑瘤效果显著(P<0.01)。低、中、高三种剂量的GLP-2a处理组与NS组相比，抑瘤率有所提高。ADM组、GLP-2a中剂量和高剂量组与NS组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)。
5、脾脏指数
结果整理得各组脾脏指数为ADM组7.834(mg/g)，低剂量GLP-2a组9.688(mg/g)，中剂量GLP-2a组11.148(mg/g)，高剂量GLP-2a组10.168(mg/g)。结果显示，ADM组小鼠脾脏指数低于NS对照组，但统计分析差异无统计学意义(P>0.05)。低、中、高三种剂量的GLP-2a处理组小鼠脾脏指数均高于NS组，但仅中剂量GLP-2a组与NS组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
6、胸腺指数
结果整理得各组胸腺指数为ADM组1.241(mg/g)，低剂量GLP-2a组1.480(mg/g)，中剂量GLP-2a组1.983(mg/g)，高剂量GLP-2a组1.668(mg/g)。结果显示，ADM组小鼠胸腺指数低于NS对照组，但经统计分析差异无统计学意义(P>0.05)。低、中、高三种剂量的GLP-2a处理组小鼠胸腺指数均高于NS组，但仅中剂量GLP-2a组与NS组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (6)

1.一种北沙参酸性多糖提取方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)以北沙参为原材料，粗提取北沙参粗多糖；
2)对北沙参粗多糖提取物，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取北沙参多糖GLP-2；
3)对北沙参多糖GLP-2，采用SephacrylTMS-300High Resolution柱层析技术提取北沙参酸性多糖GLP-2a。
2.如权利要求1所述的北沙参酸性多糖提取方法，其特征在于，步骤1)中所述粗提取北沙参粗多糖的具体方法如下：
1-1)热水提取步骤：将原料北沙参在粉碎机里粉碎，得到北沙参粉末；在热水提取反应杯中加入北沙参粉末，再加入蒸馏水Ⅰ，置于80℃水浴中搅拌2小时，过滤收集提取液Ⅰ；残渣中再加入蒸馏水Ⅱ，置于80℃水浴中搅拌2小时，过滤收集提取液Ⅱ；合并提取液Ⅰ和提取液Ⅱ，离心去除沉淀，在旋转蒸发仪上减压浓缩，得到北沙参水溶性粗提取物；北沙参粉末、蒸馏水Ⅰ和蒸馏水Ⅱ的重量份数比为：北沙参粉末200份、蒸馏水Ⅰ2000份、蒸馏水Ⅱ1600份；
1-2)乙醇沉淀步骤：取冷却后的北沙参水溶性粗提取物，加入4倍体积的无水乙醇，同时不断搅拌，置于4℃环境，沉淀24小时，离心取沉淀物Ⅰ；
1-3)去除蛋白步骤：取沉淀物Ⅰ，用蒸馏水Ⅲ溶解，加入其体积五分之一的sevag试剂，电动快速搅拌10Min，再4000rpm离心处理3min；取上清液Ⅰ重复加入其体积五分之一的sevag试剂搅拌离心处理，直到蛋白除尽，得到上清液Ⅱ；沉淀物Ⅰ和蒸馏水Ⅲ的重量份数比为：沉淀物Ⅰ10份、蒸馏水Ⅲ25份；
1-4)透析浓缩冷冻干燥步骤：取上清液Ⅱ，选取截留分子量为8000Da的透析袋，在纯水中透析48小时；在旋转蒸发仪上减压浓缩，并在冻干机内冷冻干燥，制得北沙参粗多糖。
3.如权利要求2所述的北沙参酸性多糖提取方法，其特征在于，步骤2)中所述采用DEAESepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取北沙参多糖的具体步骤如下：
2-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水，将DEAE SepharoseTM Fast Flow加入柱管中，静置24小时；用0.5mol/L的HCl洗1个柱体积，速度为6mL/min，时间为35Min；再用超纯水平衡4个柱体积，速度为8mL/min，时间为90Min；
2-2)取北沙参粗多糖，溶于蒸馏水Ⅳ中，以速度4mL/min上样，分别用水、0.2mol/L和0.4mol/L的NaCl洗脱30管，8mL/管，速度6mL/min，分别得到洗脱液GLP-1、洗脱液GLP-2和洗脱液GLP-3；北沙参粗多糖和蒸馏水Ⅳ的重量份数比分别为：北沙参粗多糖0.3份、蒸馏水Ⅳ25份；
2-3)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液GLP-1、洗脱液GLP-2和洗脱液GLP-3的吸光度；选取第一洗脱主峰的洗脱液GLP-1、第二洗脱主峰的洗脱液GLP-2、第三洗脱主峰的洗脱液GLP-3；
2-4)针对洗脱液GLP-2，选取截留分子量为8000Da的透析袋，在纯水中透析48h，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，浓缩并冻干，保存于-20℃环境，得到北沙参多糖GLP-2。
4.如权利要求3所述的北沙参酸性多糖提取方法，其特征在于，步骤3)中所述采用SephacrylTMS-300High Resolution柱层析技术提取北沙参酸性多糖的具体步骤如下：
3-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水，将SephacrylTMS-300HighResolution加入柱管中，静置24小时；用平衡液洗1个柱体积，速度为0.3mL/min，时间为260Min；平衡液的配置组成及其重量份数比为：3.04份磷酸二氢钠、4.33份磷酸氢二钠、8.77份氯化钠，溶解于1000份的超纯水中，加NaOH中和至pH为7；
3-2)取北沙参多糖GLP-2，溶于蒸馏水Ⅴ中，以0.3mL/min上样；用平衡液洗脱30管，3mL/管，速度0.3mL/min，得到洗脱液GLP-2a；平衡液的配置组成及其重量份数比为：3.04份磷酸二氢钠、4.33份磷酸氢二钠、8.77份氯化钠，溶解于1000份的超纯水中，加NaOH中和至pH7；北沙参多糖GLP-2和蒸馏水Ⅴ的重量份数比分别为：北沙参多糖GLP-2为0.03份、蒸馏水Ⅴ1份；
3-3)检测洗脱液GLP-2a的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液GLP-2a；选取第一洗脱主峰的洗脱液GLP-2；
3-4)针对吸光度为单峰洗脱液GLP-2a，选取截留分子量为8000Da的透析袋，在纯水中透析48小时，其间隔4h换一次水；收集透析袋内的液体，旋转蒸发浓缩，再冻干后保存于-20℃环境，得到北沙参酸性多糖GLP-2a。
5.一种利用权利要求4所述方法制备得到的北沙参酸性多糖，其特征在于，所述北沙参酸性多糖分子量为337.38kDa；所述北沙参酸性多糖的单糖组成和摩尔比为：甘露糖：核糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.12:0.74:0.45:1.11:0.88:91.74:2.81:2.2。
6.如权利要求5所述的北沙参酸性多糖在肺癌免疫调节抗肿瘤方面的应用。
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