CN105175575B - 一种灵芝β‑葡聚糖及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种灵芝β‑葡聚糖及其制备方法，其结构以β‑1，3‑连接为主链，平均每3‑7个主链葡萄糖残基上含有1‑2个以β‑1，6‑连接的葡萄糖侧基，该多糖平均分子量为240万‑280万道尔顿，分子量范围为120万‑380万道尔顿，灵芝β‑葡聚糖具有免疫调节和抗肿瘤的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物学领域，涉及一种具有免疫调节作用的灵芝β-葡聚糖及其制备方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)是一种传统药用真菌，具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿作用。灵芝多糖是其主要活性成分之一，可以通过影响免疫细胞如造血干细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等发挥其相应的生物学活性，以增强和激活机体免疫功能。目前，灵芝多糖的研究内容主要集中在提取方法、结构表征和活性评价三个方面，但由于灵芝多糖的复杂性以及分离和分析方法的种种限制和原料来源及纯化技术上的差异，灵芝多糖的种类至今尚未探明，其分子结构也未完全确定。
β-葡聚糖是真菌细胞壁的主要组成部分，是一种典型的“生物反应调节剂”(biological response modifier，BRM)。研究结果表明，真菌β-葡聚糖不仅能激活T、B淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、树突状细胞(DC)等免疫细胞，还能促进细胞因子的生成，激活补体系统、促进抗体的产生，对免疫系统发挥多方面的调节作用，其抗肿瘤作用也认为与它激活机体的免疫系统有关。由于真菌类β-葡聚糖具有免疫调节和抗肿瘤等多种功效，在食品、医药和生物材料等领域具有广阔的开发与应用前景。
本发明通过简单有效的纯化方法，从灵芝子实体中获得了一种高纯度的β-葡聚糖，通过化学分析和光谱分析相结合的方法解析了其结构，体内外药理实验表明，其具有抗肿瘤和免疫调节作用，可以应用于药品或保健品中。
发明内容
本发明公开了一种灵芝β-葡聚糖及其制备方法，并公开了其在免疫调节和抗肿瘤方面的用途。
本发明公开了一种灵芝β-葡聚糖，其结构以β-1，3-连接为主链，平均每3-7个主链葡萄糖残基上含有1-2个以β-1，6-连接的葡萄糖侧基，该多糖平均分子量为240万-280万道尔顿，分子量范围为120万-380万道尔顿。
本发明公开了一种灵芝β-葡聚糖的组合物，其结构以β-1，3-连接为主链，平均每3-7个主链葡萄糖残基上含有1-2个以β-1，6-连接的葡萄糖侧基，该多糖平均分子量为240万-280万道尔顿，分子量范围为120万-380万道尔顿。
本发明公开了一种灵芝β-葡聚糖的组合物，其中β葡聚糖含量75.4％-90％，其余为蛋白质和杂多糖。
本发明公开了一种灵芝β-葡聚糖的组合物，其中β葡聚糖含量达到75.4％，其余为蛋白质和杂多糖。
本发明公开了一种灵芝β-葡聚糖的组合物，其中β葡聚糖含量94.3％。
本发明公开了一种灵芝β-葡聚糖的组合物，其中β葡聚糖含量75.4％-90％，其余为蛋白质和杂多糖，经液相检测，含有如下两个主峰，第一个主峰的出峰时间为22.40-38.9min，另一个峰主要为46.7-53.2min，经检测，主峰为主要的多糖组分，次要峰在紫外280nm处有很强的吸收峰，含蛋白类成分。
本发明公开了一种灵芝β-葡聚糖的组合物，其中β葡聚糖含量94.3％，经液相分析，仅含有如下一个主峰，主峰的出峰时间为22.40-38.9min，经检测，主峰为主要的多糖组分。
本发明公开了一种灵芝β-葡聚糖的液相分析方法：
经高效凝胶色谱(waters公司2695泵分离系统)串联TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色谱柱(7.8mm×300mm，TOSOH，日本)进行分离，以0.15mol/L NaNO3和0.05mol/LNaH2PO4(pH＝7，0.02％叠氮钠)的水溶液为流动相，柱温：35℃；流速：0.5mL/min；进样量：100μL；
以八角度激光光散射检测器(MALLS，Wyatt公司)和Waters 2414示差检测器(RI)进行分析，激光检测器光源波长选用623.8nm。检测器的温度为室温。
多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146mL/g计算。使用Astra(version6.1.1，Wyatt Technology，Santa Barbara，CA)数据分析软件对光散射数据进行采集和分析。
本发明公开了一种灵芝β-葡聚糖的制备方法，包括如下步骤：
1、灵芝粗多糖的提取：以赤芝子实体为原料，粉碎后过10目筛，加入15-20倍重量的水中，常温浸泡20-40分钟，加热至沸腾，保持微沸90-120分钟，过滤。滤渣重复上述步骤，再提取1-2次，合并滤液。
2、灵芝提取液的浓缩：提取液先用100-200目的滤网粗滤，减压浓缩至料液比(质量/体积)为1∶3-1∶6，浓缩液再用离心机以8000rpm转速离心20min取上清。
3、乙醇沉淀粗多糖：向上述浓缩液中缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到40％-50％，室温静置6-8小时，离心去除醇沉上清，收集沉淀。沉淀加水溶解后在60-80℃水浴锅上挥去乙醇，冷冻干燥后得灰白色棉絮状固体样品。
4、β-葡聚糖的纯化：取上述固体样品，加适量蒸馏水溶解，离心取上清液进行DEAE柱层析分离，先以1倍柱体积的蒸馏水做洗脱液进行洗脱，再以2倍柱体积的0-1M NaCl盐溶液进行线性洗脱，洗脱的梯度见下表，收集盐相部分浓缩，透析后冷冻干燥即获得所需的灵芝β-葡聚糖。
表DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析柱洗脱程序
本发明涉及一种灵芝β-葡聚糖的组合物，由灵芝的提取制备得到，属于灵芝提取物，质量稳定，其中灵芝β-葡聚糖的含量超过90％。
本发明涉及一种灵芝β-葡聚糖的组合物，用于制备刺激淋巴细胞增殖的组合物。
本发明涉及一种灵芝β-葡聚糖的组合物，用于制备刺激淋巴细胞增殖的免疫调节剂。
本发明涉及一种灵芝β-葡聚糖的组合物，用于制备刺激TNF-α生成的促进剂。
本发明涉及一种灵芝β-葡聚糖的组合物，用于制备刺激TNF-α生成的抗肿瘤的组合物。
本发明涉及一种灵芝β-葡聚糖的组合物，用于制备药品、食品、保健品、化妆品、食品添加剂，食品补充剂。
本发明涉及一种灵芝β-葡聚糖的组合物，用于制备片剂、胶囊、冻干粉、水溶液，注射剂。
本发明的一种灵芝β-葡聚糖的组合物具有体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的作用，还可以刺激经PMA诱导THP-1细胞产生的巨噬细胞释放TNF-α，在动物体内试验中表现出对小鼠Lewis肺癌的抑制作用，可以作为免疫调节剂或者抗肿瘤药物开发中的原料。
对照试验例如下：
201410293682.X专利主要以灵芝提取后的残渣为主提取多糖，提取所得的成分β-葡聚糖含量只有50％左右，还含有其他组分，本专利主要是从灵芝子实体的水提物中直接分离，两者之间原料来源上有很大差别。201410293682.X的实施例1公开了：
1、灵芝提取残渣的获得：以赤灵芝子实体为原料，粉碎成粗粒，称取200g，加入3L水，常温浸泡30分钟，加热至沸腾，保持120分钟，过滤。滤渣重复上述步骤，再提取1次，过滤后，所得残渣在60℃鼓风干燥器中烘干。
2、灵芝残渣的超微粉碎：将干燥后的灵芝提取残渣采用超微粉碎震动磨机粉碎30min，过200目筛，收集超细粉。
3、灵芝多糖的提取分离：称取上述灵芝残渣超细粉150g，加入2L蒸馏水，常温60分钟，加热至沸腾，保持微沸60分钟，离心。沉淀重复提取1次，离心后，收集合并提取液，减压浓缩至料液比为1∶1(质量/体积，单位：千克/升)，缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到50％，室温静置4小时，离心去除醇沉上清，收集沉淀。
4、干燥：沉淀加水溶解，挥干乙醇后置于-20℃冰箱中冻存2h，然后再放到-80℃冰箱中冷冻3h，最后放入冷冻干燥机中冻干，即获得所需的灵芝多糖。
制备所得灵芝多糖的得率为0.91％，多糖含量为82.52％，β-葡聚糖含量为53.21％。
与201410293682.X的实施例1相比，本发明在如下方面进行了创新：
乙醇沉淀粗多糖：向上述浓缩液中缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到40％-50％，室温静置6-8小时，离心去除醇沉上清，收集沉淀。沉淀加水溶解后在60-80℃水浴锅上挥去乙醇，冷冻干燥后得灰白色棉絮状固体样品。
β-葡聚糖的纯化：取上述固体样品，加适量蒸馏水溶解，离心取上清液进行DEAE柱层析分离，先以1倍柱体积的蒸馏水做洗脱液进行洗脱，再以2倍柱体积的0-1M NaCl盐溶液进行线性洗脱，收集盐相部分浓缩，透析后冷冻干燥即获得所需的灵芝β-葡聚糖。
其中，乙醇沉淀粗多糖的工艺优选过程是：对灵芝子实体提取物浓缩液分别以终浓度为20％、30％、40％、50％的乙醇进行沉淀，对所得的组分进行了分析比较，发现随着乙醇浓度的增加，灵芝粗多糖的得率从0.4％提高到1.25％，且乙醇浓度为40％-50％范围内，得率较稳定，此时β葡聚糖含量达到75.4％。
其中，β-葡聚糖的纯化的工艺优选过程是：将上述灵芝粗多糖进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析分离，对上样体积、洗脱条件进行了优化，并且对分离所得的水相组分和盐相组分进行分析比较，发现盐相组分的得率较高，可以达到80％，经检测，该组分β-葡聚糖含量也达到90％以上。
在β-葡聚糖的纯化过程中，经液相检测，含有如下两个峰，第一个主峰的出峰时间为22.40-38.9min，另一个峰主要为46.7-53.2min，经检测，主峰为主要的多糖组分，次要峰在紫外280nm处有很强的吸收峰，含蛋白类成分。
在β-葡聚糖的纯化过程中，经液相检测，仅含有如下一个峰，主峰的出峰时间为22.40-38.9min，经检测，主峰为主要的多糖组分。
附图说明
图1灵芝子实体β-葡聚糖的高效液相图谱
图2灵芝子实体β-葡聚糖的红外分析图谱
图3灵芝子实体β-葡聚糖甲基化产物的GC分析图谱
图4：灵芝子实体β-葡聚糖的1H-NMR谱图
图5：灵芝子实体β-葡聚糖的13C-NMR谱图
图6：灵芝子实体β-葡聚糖的1H-13C HMQC图谱
图7：灵芝子实体β-葡聚糖刺激小鼠脾淋巴细胞增殖作用
图8：灵芝子实体β-葡聚糖对PMA诱导THP-1细胞形成的巨噬细胞释放TNF-α的影响
具体实施方式：
实施例1：灵芝子实体β-葡聚糖的制备
取赤芝子实体(购自浙江龙泉基地)粉碎后过10目筛，称取2kg加入40L蒸馏水中，常温浸泡30分钟，加热至沸腾，保持微沸120分钟，过滤。滤渣再加入30L蒸馏水煮沸提取90-120min，过滤后合并滤液。滤液先用100-200目的滤网粗滤，减压浓缩至10L后，再用离心机以8000rpm转速离心20min，向上清液中缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到40％，室温静置6-8小时，8000rpm离心收集沉淀，加水溶解挥干乙醇后冷冻干燥得到25g灰白色固体产物(得率为1.25％)。
取1g上述固体样品，加100mL水溶解后，离心，上清液采用prime plus层析系统分离，经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析柱(XK50/100)对样品进行离子交换层析分离。先以1倍柱体积的蒸馏水做洗脱液进行洗脱，再以2倍柱体积的0-1M NaCl盐溶液进行线性洗脱，具体洗脱程序如下表1。收集盐相部分浓缩，透析后冷冻干燥即得灵芝多糖(800mg)，苯酚硫酸法检测其多糖含量为94.3％。
表1 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析柱洗脱程序
经高效凝胶色谱(waters公司2695泵分离系统)串联TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色谱柱(7.8mm×300mm，TOSOH，日本)进行分离，以0.15mol/L NaNO3和0.05mol/LNaH2PO4(pH＝7，0.02％叠氮钠)的水溶液为流动相，柱温：35℃；流速：0.5mL/min；进样量：100μL；
以八角度激光光散射检测器(MALLS，Wyatt公司)和Waters 2414示差检测器(RI)进行分析，激光检测器光源波长选用623.8nm。检测器的温度为室温。
多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146mL/g计算。使用Astra(version6.1.1，Wyatt Technology，Santa Barbara，CA)数据分析软件对光散射数据进行采集和分析，计算灵芝子实体多糖分子量为260万道尔顿。
单糖组成分析结果显示该多糖为葡聚糖。用NMR、IR和甲基化分析证明该灵芝多糖为β-葡聚糖，平均每3个主链葡萄糖残基上含有1个以1，6-键连接的葡萄糖侧基。
通过GC-MS的MS图谱分析，GC图谱中保留时间11.12min的为t-末端葡萄糖，保留时间15.91min的为1，3-linked-葡萄糖残基，保留时间23.67min的为1，3，6-linked-葡萄糖残基，其摩尔比约为1∶2∶1。
结合1H-NMR、13C-NMR、C-H二维谱图、推测灵芝子实体多糖具有以下的结构单元：
实施例2：灵芝子实体β-葡聚糖体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖
1、样品的配制
精密称取样品约5mg，加入定量的PBS溶液使其充分溶解后，18000g离心30min除菌，上清液转移至无菌管中，稀释成一系列浓度备用。
2、小鼠脾淋巴细胞的制备
选取8-10周龄，体重28±1g的BALB/c小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗3-4次。将脾脏磨碎后过100目筛，过筛后的混悬液以1000rpm离心6min。吸去上清液，沉淀中按每只小鼠1.5mL的量加入氯化铵溶液，反复冲打，静置10min后，加PBS至50mL，然后以400g/min离心6min，吸去上清液，加PBS缓冲液冲洗并离心2遍后，吸去上清，加入培养基混匀，用细胞计数仪计数并稀释成2×106cells/mL细胞液备用。
3、小鼠脾淋巴细胞增殖率的测定
将2×106cells/mL淋巴细胞悬浮液加至96孔板中，每孔加180μL，同时加入20μL样品液(或每孔加199μL细胞悬液，同时加入1μL样品液)，以20μLPBS(或1μLDMSO)和20μL的60μg/mL的PHA溶液分别作阴、阳性对照。于37℃、含5％的CO2条件下培养3d，加入20μL AlamarBlue试剂，再培养，加Alamar Blue试剂前及变色后分别用ELISA自动读板仪测定570nm和600nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂公式计算各种样品对淋巴细胞增殖率。
计算公式为：
淋巴细胞增殖率(％)＝[117216×A570(样品)-80586×A600(样品)]/
[117216×A570(对照)-80586×A600(对照)]×100％
对实施例1中的灵芝子实体β-葡聚糖样品进行了活性测试，结果见(图7灵芝子实体β-葡聚糖刺激小鼠脾淋巴细胞增殖作用)。可以看出，灵芝β-葡聚糖具有刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的作用，可以增强机体的免疫力。
实施例3：灵芝子实体β-葡聚糖体外刺巨噬细胞释放TNF-α活性分析
1、样品的配制
精密称取样品约5mg，加入定量的PBS溶液使其充分溶解后，18000g离心30min除菌，上清液转移至无菌管中，稀释成一系列浓度备用。
2、THP-1细胞培养及巨噬细胞的诱导
细胞株THP-1在RPMI1640完全培养基中，37℃、含5％CO2条件下培养到对数期后，180×g离心后收集细胞，稀释成5×105个/mL的细胞液。将细胞液按照每孔1mL的体积转入24孔板中，加入终浓度为30ng/mL的PMA诱导细胞成巨噬细胞，48h后诱导结束。
3、THP-1细胞诱导的巨噬细胞上清液中TNF-α含量的测定及比较
将上述诱导成巨噬细胞的培养液上清弃去，加入含有不同浓度的样品的培养基至细胞中，共同培养48h后取上清，利用北京正四柏公司的TNF-α测定用ELISA试剂盒测定上清液中TNF-α的含量。
4、结果分析
从图8(灵芝子实体β-葡聚糖对PMA诱导THP-1细胞形成的巨噬细胞释放TNF-α的影响)结果可以看出，灵芝子实体β-葡聚糖具有很好的刺激巨噬细胞释放TNF-α的活性，可明显增强巨噬细胞的吞噬杀伤能力，从而增强机体的抗肿瘤能力。
实施例4：灵芝子实体β-葡聚糖抑制小鼠Lewis肺癌活性试验
1、实验材料：生理盐水做溶剂；阳性对照品：顺铂10mg/瓶，齐鲁制药有限公司生产，批号111024CF；瘤源：小鼠Lewis肺癌模型由上海医药工业研究院药效学研究评价中心传代维持。
2、实验动物：C57BL/6小鼠由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，合格证号：SCXK(沪)2012-0002；雄性，18-20g，试验组及阳性对照组每组10只小鼠，阴性对照为两组。
3、剂量设置：样品设两个剂量组，分别为50mg/kg、12.5mg/kg。
4、给药方案：多糖给药方式采用腹腔给药，每天1次，连续14天。阴性对照组给以与试验组等体积等浓度的相应溶剂，阳性对照环顺铂2mg/kg/d每天腹腔给药一次，连续七天。
5、试验主要步骤：无菌条件下取生长旺盛的瘤源，以1∶8-10的比例匀浆制备成约2×107/mL细胞悬液，于相应宿主腋皮下接种0.2mL/每鼠，次日按实验设计方案给药，给药结束后约次日处死各组动物，称体重、脾脏重、胸腺重后剖取肿瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率：
肿瘤抑制率％＝[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％
试验结束后，取动物血清，按照ELISA试剂盒的方法对其中的IgG和IgM抗体量进行测定。
6、结果分析
多糖样品以腹腔注射，每天1次，连续14天(ig×14qd)的给药方案，对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤疗效试验，抑瘤率结果见表2。结果显示，灵芝β葡聚糖对应两个剂量组50mg/kg、12.5mg/kg，肿瘤抑制率分别为28.41％和12.53％，阳性对照顺铂2mg/kg，肿瘤抑制率为78.27％。
另外，表3结果显示，多糖给药组小鼠的脾脏指数、胸腺指数和血清中IgG、IgM的量都明显高于化疗组和模型组，证明多糖组老鼠的免疫系统没有受到明显的损伤，多糖可以增强荷瘤小鼠的免疫系统，从而起到抑制肿瘤的作用。
表2.灵芝子实体β-葡聚糖对小鼠Lewis肺癌的疗效试验
表3 灵芝子实体β-葡聚糖对Lewis肺癌小鼠脾脏指数、胸腺指数和血清中IgG、IgM的影响
实施例5：
灵芝子实体β-葡聚糖的剂型
灵芝子实体β-葡聚糖的片剂：灵芝子实体β-葡聚糖10mg，淀粉87g，硬脂酸镁2g
制备工艺：取实施例1的灵芝子实体β-葡聚糖过100目筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。
灵芝子实体β-葡聚糖的胶囊：灵芝子实体β-葡聚糖10mg，淀粉87g，硬脂酸镁2g
制备工艺：取实施例1的灵芝子实体β-葡聚糖过100目筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，装胶囊，即得。
灵芝子实体β-葡聚糖的冻干粉：
灵芝子实体β-葡聚糖2.0g，乙二胺四乙酸二钠4.0g，加水定容至1000mL；
制备工艺：灵芝子实体β-葡聚糖分散在水中，在超声或搅拌条件下将乙二胺四乙酸二钠加入，使成澄清透明溶液；补加水定容至足量；经0.22μM微孔滤膜过滤，冷冻干燥得到。
实施例6：片剂中灵芝子实体β-葡聚糖的含量的检测
样品经高效凝胶色谱(waters公司2695泵分离系统)串联TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色谱柱(7.8mm×300mm，TOSOH，日本)进行分离，以0.15mol/L NaNO3和0.05mol/L NaH2PO4(pH＝7，0.02％叠氮钠)的水溶液为流动相，柱温：35℃；流速：0.5mL/min；进样量：100μL；
以八角度激光光散射检测器(MALLS，Wyatt公司)和Waters 2414示差检测器(RI)进行分析，激光检测器光源波长选用623.8nm。检测器的温度为室温。
多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146mL/g计算。
片剂样品用流动相配成1mg/mL溶液，上样量50μL。对照样品是：实施例1的样品。
实施例7：胶囊中灵芝子实体β-葡聚糖的含量的检测
样品经高效凝胶色谱(waters公司2695泵分离系统)串联TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色谱柱(7.8mm×300mm，TOSOH，日本)进行分离，以0.15mol/L NaN03和0.05mol/L NaH2PO4(pH＝7，0.02％叠氮钠)的水溶液为流动相，柱温：35℃；流速：0.5mL/min；进样量：100μL；
以八角度激光光散射检测器(MALLS，Wyatt公司)和Waters 2414示差检测器(RI)进行分析，激光检测器光源波长选用623.8nm。检测器的温度为室温。
多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146mL/g计算。
胶囊内容物的样品用流动相配成1mg/mL溶液，上样量50μL。
对照样品是：实施例1的样品。
实施例8：冻干粉中灵芝子实体β-葡聚糖的含量的检测
样品经高效凝胶色谱(waters公司2695泵分离系统)串联TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色谱柱(7.8mm×300mm，TOSOH，日本)进行分离，以0.15mol/L NaNO3和0.05mol/L NaH2PO4(pH＝7，0.02％叠氮钠)的水溶液为流动相，柱温：35℃；流速：0.5mL/min；进样量：100μL；
以八角度激光光散射检测器(MALLS，Wyatt公司)和Waters 2414示差检测器(RI)进行分析，激光检测器光源波长选用623.8nm。检测器的温度为室温。
多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146mL/g计算。
冻干粉用流动相配成1mg/mL溶液，上样量50μL。
对照样品是：实施例1的样品。
Claims (1)
1.一种灵芝β-葡聚糖在制备抑制肺癌的组合物的用途：其特征在于
灵芝子实体β-葡聚糖的制备
取赤芝子实体，购自浙江龙泉基地，粉碎后过10目筛，称取2kg加入40L蒸馏水中，常温浸泡30分钟，加热至沸腾，保持微沸120分钟，过滤，滤渣再加入30L蒸馏水煮沸提取90-120min，过滤后合并滤液，滤液先用100-200目的滤网粗滤，减压浓缩至10L后，再用离心机以8000rpm转速离心20min，向上清液中缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到40％，室温静置6－8小时，8000rpm离心收集沉淀，加水溶解挥干乙醇后冷冻干燥得到25g灰白色固体产物，得率为1.25%，
取1g上述固体样品，加100mL水溶解后，离心，上清液釆用 ÄKTA prime plus层析系统分离，经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析柱 XK50/100 对样品进行离子交换层析分离，先以1倍柱体积的蒸馏水做洗脱液进行洗脱，再以2倍柱体积的0-1M NaCl盐溶液进行线性洗脱，具体洗脱程序如下DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析柱洗脱程序，收集盐相部分浓缩，透析后冷冻干燥即得灵芝多糖 800mg ，苯酚硫酸法检测其多糖含量为94.3%，
时间min 水% 1M NaCl % 流速 mL/min
0 100 0 10
100 100 0 10
300 0 100 10
400 0 100 10
经高效凝胶色谱，waters公司2695泵分离系统，串联TSK-GEL系列 G6000PWXL和G4000PWXL色谱柱，7.8 mm × 300 mm，TOSOH，日本，进行分离，以0.15 mol/L NaNO3和0.05mol/L NaH2PO4 ，pH=7，0.02%叠氮钠，的水溶液为流动相，柱温：35℃；流速：0.5mL/min； 进样量：100μL；
以八角度激光光散射检测器，MALLS，Wyatt公司，和Waters 2414 示差检测器，RI，进行分析， 激光检测器光源波长选用623.8nm，检测器的温度为室温，
多糖在溶液中的折光指数增量，dn/dc，按照0.146mL/g计算，使用 Astra，version6.1.1, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA，数据分析软件对光散射数据进行采集和分析，计算灵芝子实体多糖分子量为260万道尔顿，
单糖组成分析结果显示该多糖为葡聚糖，用NMR、IR和甲基化分析证明该灵芝多糖为β-葡聚糖，平均每3个主链葡萄糖残基上含有1个以1,6-键连接的葡萄糖侧基，
通过GC-MS的MS图谱分析，GC图谱中保留时间11.12min的为t-末端葡萄糖，保留时间15.91min的为1,3-linked-葡萄糖残基，保留时间23.67min的为1,3,6-linked-葡萄糖残基，其摩尔比为1:2:1，
结合1H-NMR、 13C-NMR、C-H二维谱图、推测灵芝子实体多糖具有以下的结构单元：
。
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