CN105085704A - 一种蛹虫草活性多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛹虫草活性多糖，由如下方法制备得到：蛹虫草子实体超细粉碎后用沸水提取，收集上清液；上清液浓缩后加入乙醇沉淀，沉淀部位过DEAE-sepharose柱，0-0.5N的部位脱盐后冷冻干燥获得。本发明涉及蛹虫草多糖提取物在制备抗肿瘤活性的产品上应用。

Description

一种蛹虫草活性多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及食用菌提取领域，具体的说涉及一种具有抗肿瘤活性的蛹虫草多糖的制备方法。

背景技术

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)，又名北冬虫夏草，是麦角菌科虫草属真菌。具有益肺肾、补精髓、止血化痰的功效，现代研究发现有延缓衰老、抗疲劳和耐缺氧，调节免疫系统，抗缺氧、增加心肌营养和血流量等多种作用。

目前市场上蛹虫草的保健产品越来越多，其中多糖类成分通过提高机体免疫功达到抗肿瘤的功效。由于目前提取方式单一，但目前对虫草多糖的化学组成、链结构、分子大小与抗肿瘤作用之间的关系研究较少，获得的产品多糖产品含量低、有效成分不明确，因此，蛹虫草多糖提取工艺与抗肿瘤活性之间的关系缺乏规律性。

目前国内外分离纯化菌类多糖大多采用粉碎，脱脂，水提，浓缩，醇沉，离心，冻干，溶解，脱蛋白，脱色，上柱纯化等步骤，工艺复杂，并需采用有机溶剂进行脱脂、脱蛋白，上柱纯化使用了一种分子筛凝胶(SephadexG-100或G-75)，分离样品需要手工收集，实验检测多糖(苯酚-硫酸法)，工艺路线长，生产效率底，产品成本高，难以实现大规模生产。

CN1560085A公开了:一种利用虫草人工培养中产生的培养基下脚料提取虫草多糖的工艺，该法可变废为宝，减少资源的浪费，提高经济效益，但是在多糖制备过程中使用了氯仿等有机溶剂，不利于食品安全。

CN102558264A公开了:提取蛹虫草中虫草多糖的方法，但是，使用食用酒精、丙酮、乙醚，工艺流畅过长。

CN101124988A公开了:一种从蛹虫草中提取精制虫草多糖的方法，为了得到精制蛹虫草多糖，需要使用木瓜蛋白酶脱蛋白处理，成本高。

CN101200491A公开了:蛹虫草子实体水溶性肽多糖的快速分离纯化方法，取蛹虫草子实体烘干、粉碎；超纯水提取得组分CF1；分子筛分离得组分CF1-1；离子交换柱分离、纯化得组分CF1-1-1与CF1-1-2；亲和层析柱分离、纯化得肽多糖CF1-1-1-1、CF1-1-2-1与CF1-1-2-2。

CN101805412A公开了:一种具有抗肿瘤活性的水溶性低分子多糖，由下法制得：用30％乙醇作提取剂，从虫草菌种深层发酵培养出的菌丝体中提取虫草多糖，通过单因素和正交实验确定了古尼虫草多糖的最佳提取工艺：温度为70℃，料液比为1：20，提取时间为2小时。提取液经去脂、去蛋白、50％、70％乙醇沉淀，冷冻干燥后得到粗多糖。经DEAESephadexA-25柱和SephadexG-75柱逐级纯化，冷冻干燥得到一种水溶性低分子多糖CPS-50-A1。

发明内容

本发明公开一种蛹虫草多糖的制备方法，该方法包括如下步骤：

蛹虫草子实体超细粉碎后用沸水提取，收集上清液；上清液浓缩后加入乙醇沉淀，沉淀部位过DEAE-sepharose柱，0-0.5NNaCL的部位脱盐后冷冻干燥获得蛹虫草活性多糖。

具体的说，本发明的一种蛹虫草提取物的制备方法，包括如下步骤：

1、蛹虫草原料的粉碎：以蛹虫草子实体为原料，粉碎成粗粒，再进行超细粉碎至300-500目；

2、蛹虫草粗多糖的提取：蛹虫草细粉，加入20倍重量的蒸馏水中，搅匀并加热至沸腾，保持微沸60-120分钟，过滤保留滤液，弃去残渣；

3、蛹虫草粗提液的浓缩：滤液用10000×g的速度离心30min，上清液减压浓缩至料液比为1:1-1:2；

4、乙醇沉淀及洗涤：向上述滤液中加入无水乙醇，至乙醇含量达到40％-50％，离心去除醇沉上清，收集沉淀，用40％-50％的乙醇洗涤沉淀6-7次；

5、沉淀加水溶解，过DEAE-sepharose柱，先用水洗脱，再用0-1N的NaCL梯度洗脱，收集0-0.5NNaCL部位的多糖，浓缩，超滤脱盐，冷冻干燥即获得所需的近白色的蛹虫草多糖。

本发明制备得到的蛹虫草多糖得率约为0.35％，多糖含量达到80％以上。

本发明涉及蛹虫草多糖提取物在制备抗肿瘤活性的组合物上应用。

本发明涉及蛹虫草多糖提取物在制备抗肺癌活性的组合物上应用。

本发明涉及蛹虫草多糖提取物的产品包括而不限于药品、食品、保健食品、化妆品，其赋形剂或载体为制药或食品领域中常用的赋形剂或载体，如稀释剂，崩解剂，润滑剂等。

本发明涉及蛹虫草多糖的分析方法，采用HPLC对提取物中的蛹虫草多糖进行含量分析。

本发明涉及蛹虫草多糖制剂的分析方法，采用HPLC对制剂中的蛹虫草多糖进行含量分析。

HPLC色谱条件：

Waters2695高效液相色谱(Waters,USA)，配备TSK-GELG6000PWXL分析柱(7.8mm×300mm)，Waters2414示差折光检测器(Waters,USA),visioStar-II粘度计(Wyatt,USA),DAWN8⁺激光散射仪(Wyatt,USA),waters2998光电二极管阵列检测器(Waters,USA).

流动相MilliQwater(去离子水)配制缓冲液，

用1mol/L的NaOH溶液将pH值调到7.0，再加10mL的10mg/mLNaN₂PO₄，所配制的溶液用0.45μm的滤膜过滤，并用超声或真空脱气，得到缓冲液。

缓冲液中NaH₂PO₄和NaNO₃的浓度分别为0.1mol/L和0.3mol/L。

流速为0.5mL/min。

柱温和检测器温度40℃。多糖样品用流动相配成2mg/mL溶液，上样量50μL。

本发明涉及的蛹虫草多糖的制备方法是一种高效、多糖含量高、颜色浅的生产方法。

本发明涉及的蛹虫草原料包括而不限于：张家港顺泰元生物科技有限公司的蛹虫草。

本发明HPLC色谱条件的优选过程：

流动相：含有0.1mol/LNaH₂PO₄和0.3mol/LNaNO₃的水溶液(pH至7.0)，，

流动相的配制方法：取MilliQwater(去离子水)，使得NaH₂PO₄和NaNO₃的浓度分别为0.1mol/L和0.3mol/L，用1mol/L的NaOH溶液将pH值调到7.0，所配制的溶液用0.45μm的滤膜过滤，并用超声或真空脱气，得流动相。

柱温：对室温、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃进行比较分析，40℃效果较好，因此选择40℃。

流速为0.5mL/min。

本发明提取工艺的优选过程：

用HPLC分析对蛹虫草子实体水提液中粗多糖分布，发现15min左右有一大分子量单一对称糖峰；

用乙醇将水提液的醇浓度分别调节30％、35％、40％、45％、50％、55％和60％，沉淀后10000g离心30min，取沉淀，挥去乙醇，用蒸馏水溶解，结合HPLC色谱图分析不同醇沉浓度得到的多糖分子量分布，结果显示，醇沉浓度为45％时，可将大分子量的单一对称糖峰与其它部位分离。

取醇沉得到的粗多糖溶液，上SepharoseFastFlow离子交换柱层析，用AKTAprime层析系统(AmershamBioscience)，先用蒸馏水洗脱1个柱体积，再用0-1NNaCl梯度洗脱，流速4mL/min，分部收集洗脱液，每管15mL，用苯酚-硫酸法检测糖峰，绘制曲线，得到3个分离的糖峰，根据曲线优化洗脱过程，缩短洗脱时间，同时3个糖峰也能有效分开，

最终优化的洗脱程序为：SepharoseFastFlow柱(50mm×30cm)，流速4ml/min，A为1NNaCL

0→50min，0％A；

50→75min，0％→10％A；

75→127.5min，10％→100％A；

127.5→157.5min，：100％A

10-35min为第一个糖峰，50-70min为第二个糖峰，75-90min为第三个糖峰(见图1)，分别命名为P1、P2、P3，三个糖峰，分别浓缩，透析，冷冻干燥，测定得率、糖含量和体外免疫活性。经体免疫细胞活性测定P1没有免疫活性，P2和P3有活性，但P3得率低，仅为0.16％，多糖含量为37.9％，P3虽然有活性但得率和糖含量低于P2很多。

附图说明

图1：DEAE-Sepharose洗脱后有三个糖峰

图2：本发明的蛹虫草多糖的示差检测呈现单一对称峰

本发明制备工艺的优势：

1.工艺简单：采用水之后的乙醇沉淀物上层析柱分离纯化，省略了常规提取中的脱脂、己醇沉淀、脱蛋白和脱色的步骤，简化工艺。

2.绿色分离，常规工艺中一般均需采用乙醚或石油醚脱脂，乙醇沉淀多糖和蛋白质，再用氯仿丁醇或戊醇的Sevag法，三氟三氯乙烷法或三氯醋酸法脱蛋白，然后用活性炭吸附法或双氧水氧化脱色；而本发明不使用丙酮、乙醚，由于乙醇能回收使用，因此，本发明属于绿色分离。

3.效率高：省去了脱脂、乙醇沉淀、脱蛋白和脱色等步骤，。

4.成本低，本发明没有使用分子筛凝胶柱、亲和层析柱，仅仅使用离子交换柱DEAE-sepharose，就能得到的近白色的蛹虫草多糖。

5.产品纯度高：本发明的蛹虫草多糖的示差检测呈现单一对称峰(见附图2)。

具体实施方式：

实施例1：

1、蛹虫草原料的粉碎：蛹虫草子实体5Kg，粉碎机粉碎成粗粒，再用超细粉碎机进行超细粉碎至300目备用；

2、蛹虫草的提取：称取超细粉碎的蛹虫草1Kg，加入50000mL蒸馏水，加热至沸腾，保持微沸120分钟，10000g离心30min，取上清液合并；

3、蛹虫草粗提液的浓缩：上清液减压浓缩至料液比为1:1；

4、乙醇沉淀及洗涤：向上述浓缩液中加入无水乙醇，至乙醇含量达到40％-50％，离心去除醇沉上清，收集沉淀，用50％的乙醇洗涤沉淀3次；

5、沉淀1g加100mL水溶解，过1L的DEAE-sepharose柱，先用1-2个柱体积的水洗脱后，用0-1N的NaCL梯度洗脱2个柱体积，收集0-0.5NNaCL部位的多糖，浓缩，超滤脱盐，冷冻干燥即获得近白色的蛹虫草多糖。

制备所得蛹虫草多糖得率为0.35％。

实施例2：

多糖含量的检测：用苯酚-硫酸法测定，精密称取本品10mg置100ml容量瓶中，加水约80ml，溶解后冷却至室温，定容至100ml。精密吸取样品1.0ml，置15ml试管中，分别加入苯酚、硫酸试剂，充分反应后在490nm处测定吸光度值，以葡聚糖为标准品计算样品的糖含量。制备所得蛹虫草多糖多糖的多糖含量为80.4％。

实施例3：

实验材料：

取实施例1蛹虫草多糖样品用水溶解配制得到。实施例1蛹虫草多糖样品50mg/kg、12.5mg/kg，

阳性对照品：顺铂10mg/瓶，齐鲁制药有限公司生产，批号111024CF。

瘤源：小鼠Lewis肺癌模型由上海医药工业研究院药效学研究评价中心传代维持。C57BL/6小鼠由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，合格证号：SCXK(沪)2012-0002。动物数：试验组及阳性对照组每组10只小鼠，阴性对照为两组。剂量设置：样品50mg/kg、12.5mg/kg。

给药方案：腹腔给药，每天1次，连续14天。试验对照：阴性对照组给以与试验组等体积等浓度的相应溶剂，阳性对照环顺铂2mg/kg/d每天腹腔给药一次，连续七天。

试验主要步骤：

无菌条件下取生长旺盛的瘤源，以1：8-10的比例匀浆制备成约2×107/ml细胞悬液，于相应宿主腋皮下接种0.2ml/每鼠，次日按实验设计方案给药，给药结束后约次日处死各组动物，称体重、脾脏重、胸腺重后剖取肿瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率：

肿瘤抑制率％＝[(对照组平均瘤重—给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％

多糖样品以腹腔注射，每天1次，连续14天(ig×14qd)的给药方案，对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤疗效试验，结果：实施例1蛹虫草多糖样品50mg/kg、12.5mg/kg，肿瘤抑制率分别为28.41％及12.53％。具有一定的抗肿瘤的效果，详见表。

表.多糖样品对小鼠Lewis肺癌的疗效试验

实施例4：

蛹虫草多糖的剂型

蛹虫草多糖的片剂：蛹虫草多糖10mg，淀粉87g，硬脂酸镁2g

制备工艺：取实施例1的蛹虫草多糖过100目筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。

蛹虫草多糖的胶囊：蛹虫草多糖10mg，淀粉87g，硬脂酸镁2g

制备工艺：取实施例1的蛹虫草多糖过100目筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，装胶囊，即得。

蛹虫草多糖的冻干粉：

蛹虫草多糖2.0g，乙二胺四乙酸二钠4.0g，加水定容至1000mL；

制备工艺：蛹虫草多糖分散在水中，在超声或搅拌条件下将乙二胺四乙酸二钠加入，使成澄清透明溶液；补加水定容至足量；经0.22μM微孔滤膜过滤，冷冻干燥得到。

实施例5：片剂中蛹虫草多糖的含量的检测

HPLC色谱条件：

Waters2695高效液相色谱(Waters,USA)，配备TSK-GELG6000PWXL分析柱(7.8mm×300mm)，Waters2414示差折光检测器(Waters,USA),visioStar-II粘度计(Wyatt,USA),DAWN8⁺激光散射仪(Wyatt,USA),waters2998光电二极管阵列检测器(Waters,USA).

流动相：含有0.1mol/LNaH₂PO₄和0.3mol/LNaNO₃的水溶液(pH至7.0)，，

流动相的配制方法：取MilliQwater(去离子水)，使得NaH₂PO₄和NaNO₃的浓度分别为0.1mol/L和0.3mol/L，用1mol/L的NaOH溶液将pH值调到7.0，所配制的溶液用0.45μm的滤膜过滤，并用超声或真空脱气，得流动相。

流速为0.5mL/min。

柱温和检测器温度40℃。片剂样品用流动相配成1mg/mL溶液，上样量50μL。对照样品是：实施例1的样品。

实施例6：胶囊中蛹虫草多糖的含量的检测

HPLC色谱条件：

Waters2695高效液相色谱(Waters,USA)，配备TSK-GELG6000PWXL分析柱(7.8mm×300mm)，Waters2414示差折光检测器(Waters,USA),visioStar-II粘度计(Wyatt,USA),DAWN8⁺激光散射仪(Wyatt,USA),waters2998光电二极管阵列检测器(Waters,USA).

流动相：含有0.1mol/LNaH₂PO₄和0.3mol/LNaNO₃的水溶液(pH至7.0)，，

流动相的配制方法：取MilliQwater(去离子水)，使得NaH₂PO₄和NaNO₃的浓度分别为0.1mol/L和0.3mol/L，用1mol/L的NaOH溶液将pH值调到7.0，所配制的溶液用0.45μm的滤膜过滤，并用超声或真空脱气，得流动相。

流速为0.5mL/min。

柱温和检测器温度40℃。胶囊内容物的样品用流动相配成1mg/mL溶液，上样量50μL。对照样品是：实施例1的样品。

实施例7：冻干粉中蛹虫草多糖的含量的检测

HPLC色谱条件：

Waters2695高效液相色谱(Waters,USA)，配备TSK-GELG6000PWXL分析柱(7.8mm×300mm)，Waters2414示差折光检测器(Waters,USA),visioStar-II粘度计(Wyatt,USA),DAWN8⁺激光散射仪(Wyatt,USA),waters2998光电二极管阵列检测器(Waters,USA).

流动相：含有0.1mol/LNaH₂PO₄和0.3mol/LNaNO₃的水溶液(pH至7.0)，，

流动相的配制方法：取MilliQwater(去离子水)，使得NaH₂PO₄和NaNO₃的浓度分别为0.1mol/L和0.3mol/L，用1mol/L的NaOH溶液将pH值调到7.0，所配制的溶液用0.45μm的滤膜过滤，并用超声或真空脱气，得流动相。

流速为0.5mL/min。

柱温和检测器温度40℃。冻干粉用流动相配成1mg/mL溶液，上样量50μL。对照样品是：实施例1的样品。

Claims (8)

1.一种蛹虫草多糖，其特征在于：由如下方法制备得到：

蛹虫草子实体超细粉碎后用沸水提取，收集上清液；上清液浓缩后加入乙醇沉淀，沉淀部位过DEAE-sepharose柱，0-0.5NNaCl的部位脱盐后冷冻干燥获得蛹虫草活性多糖。

2.根据权利要求1所述的.一种蛹虫草多糖的制备方法，其特征在于：该方法包括：

①蛹虫草原料的粉碎：以蛹虫草子实体为原料，粉碎成粗粒，再进行超细粉碎至300-500目；

②蛹虫草粗多糖的提取：蛹虫草细粉，加入20倍重量的蒸馏水中，搅匀并加热至沸腾，保持微沸60-120分钟，过滤保留滤液，弃去残渣；

③蛹虫草粗提液的浓缩：滤液用10000×g的速度离心30min，上清液减压浓缩至料液比为1:1-1:2；

④乙醇沉淀及洗涤：向上述滤液中加入无水乙醇，至乙醇含量达到40％-50％，离心去除醇沉上清，收集沉淀，用40％-50％的乙醇洗涤沉淀5-6次；

⑤沉淀加水溶解，过DEAE-sepharose柱，先用水洗脱，在用0-1N的NaCL洗脱，收集0-0.5NNaCL部位的多糖，浓缩，超滤脱盐，冷冻干燥即得。

3.根据权利要求1所述的一种蛹虫草多糖，其特征在于：在提取过程中用如下方法进行检测：

HPLC色谱条件：

Waters2695高效液相色谱(Waters,USA)，配备TSK-GELG6000PWXL分析柱(7.8mm×300mm)，Waters2414示差折光检测器(Waters,USA),visioStar-II粘度计(Wyatt,USA),DAWN8⁺激光散射仪(Wyatt,USA),waters2998光电二极管阵列检测器(Waters,USA)，

流动相为：含有0.1mol/LNaH₂PO₄和0.3mol/LNaNO₃的水溶液，pH7.0，，

流速为0.5mL/min，

柱温和检测器温度40℃，多糖样品用流动相配成2mg/mL溶液，上样量50μL。

4.根据权利要求1所述的一种蛹虫草多糖，其特征在于：由提取过程中用如下方法进行分离：

取醇沉得到的粗多糖溶液，洗脱程序为：SepharoseFastFlow柱，流速4ml/min，

0-200mL水，时间0-50min

200-300mLNaCl0-0.1mol/L，时间50-75min

300-510mLNaCl0.1-1mol/L，时间75-127.5min

510-630NaCl1mol/mL，时间127.5-157.5min。

5.根据权利要求1或2的蛹虫草多糖在制备抗肿瘤活性的组合物上应用。

6.根据权利要求1或2的蛹虫草多糖提取物在制备抗肺癌的组合物上应用。

7.根据权利要求1或2的蛹虫草多糖在制备抗肿瘤活性的组合物，包括而不限于药品、食品、保健食品。

8.根据权利要求1或2的蛹虫草多糖在制备抗肺癌的组合物，包括而不限于药品、食品、保健食品。