CN104151439A - 一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，包括：S1：蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的提取：以蝙蝠蛾拟青霉菌丝体为原料，超微粉碎至粒径为7～11μm的超细粉末，加入至水中，浸泡，再加热至沸腾，保持微沸，离心，取上清液即为蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液；S2：浓缩得浓缩液；S3：沉淀：加入乙醇，边加边搅拌，静置，离心，收集沉淀；S4：干燥：冷冻干燥，即得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖。该方法是一种简便、高效、成本低、多糖得率及含量高，且适合规模化生产的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物领域中的一种菌丝体多糖，具体涉及一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法。
背景技术
蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝又称为虫草发酵菌丝Cs-4(Cs为Cordyceps sinensis的缩写，即冬虫夏草，后边的4为菌种编号)，其菌丝体含有较高含量的多糖，此多糖在保健食品、医药等领域具有重要的作用，但目前对该蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中的多糖提取方法存在不足使得多糖的提取率较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，该方法是一种简便、高效、成本低、多糖得率及含量高，且适合规模化生产的方法，克服了现有技术中的一些不足。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1：蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的提取：以蝙蝠蛾拟青霉菌丝体为原料，超微粉碎至粒径为7～11μm的超细粉末，加入至水中，浸泡，再加热至沸腾，保持微沸60-120分钟，离心；分离沉淀和上清液，取沉淀并按上述步骤重复再提取1～2次，取每次离心分离后的上清液并合并，即为蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液；
S2：浓缩：将步骤S1中蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液进行减压蒸馏，浓缩至液体和原料的比例(质量/体积)为2∶1～4∶1，得到浓缩液；
S3：沉淀：向步骤S2中所述的浓缩液中缓慢加入乙醇，边加边搅拌，然后室温静置12-18小时，离心，弃上清液，收集沉淀；
S4：干燥：向步骤S3中所述的沉淀中加水溶解，加热除去乙醇，然后进行冷冻干燥，即得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖，得率大于20％。
进一步地，步骤S1中，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的提取的具体方法为：以蝙蝠蛾拟青霉菌丝体为原料，超微粉碎为粉末，加入到15-20倍原料重量的水中，常温浸泡30-60分钟，再加热至沸腾，保持微沸60-120分钟后离心；分离沉淀和上清液，取沉淀并按上述步骤重复再提取1～2次，取每次离心分离后的上清液并合并，即为蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液。
进一步优选地，将所述蝙蝠蛾拟青霉菌丝体超微粉碎至粒径为10μm的超细粉末。
进一步优选地，常温浸泡后再加热至沸腾，保持微沸90-105分钟。
进一步优选地，所述离心的时间为20min。
进一步地，步骤S2中，将蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液浓缩至液体和原料的比例(质量/体积)为3∶1时为止。
进一步地，步骤S3中，所述乙醇加至乙醇含量达到70％-80％时停止。
进一步优选地，所述乙醇为无水乙醇。
本发明提供了一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，其主要具有的有益效果为：该制备方法通过超微粉碎来破坏细胞壁再经过一些列的提取过程，得到的粗多糖得率高，且纯多糖的得率超过20％；该多糖对RAW264.7巨噬细胞株释放NO有明显的促进作用；此外，该方法是一种简便、高效、成本低且适合规模化生产的方法。
附图说明
下面根据附图对本发明作进一步详细说明。
图1是本发明实施例所述的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明实施例所述的一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的提取：以蝙蝠蛾拟青霉菌丝体为原料，通过超微粉碎将颗粒细度粉碎为粒径10μm的超细粉末，通过超微粉碎后，称取50g超微粉碎后的粉末，再加入1000mL蒸馏水，常温浸泡60分钟，加热至沸腾，保持微沸120分钟，8000g离心20min；分离沉淀和上清液，取沉淀并按上述步骤重复再提取1次，即在该沉淀中加蒸馏水、常温浸泡、加热至沸腾，保持微沸后离心，取上清液，合并两次离心所得的上清液，即为蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液。
蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖粗提液的浓缩：将上述的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液于旋转蒸发仪中减压浓缩至100mL，得浓缩液。
乙醇沉淀：向上述浓缩液中缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到70％时，室温静置12小时，离心除去乙醇上清液，收集沉淀。
干燥：沉淀加70mL水溶解，水浴锅上挥去乙醇，置于-20℃冰箱中冻存12h后放入冷冻干燥机中冷冻干燥，即得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖，该多糖为含有微量杂质的粗多糖；蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的得率为21.13％。
实施例2
蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的提取：以蝙蝠蛾拟青霉菌丝体为原料，通过超微粉碎将颗粒细度粉碎为粒径9μm的超细粉末，称取50g超微粉碎后的粉末，再加入800mL蒸馏水，常温浸泡40分钟，加热至沸腾，保持微沸100分钟，8000g离心20min；分离沉淀和上清液，取沉淀并按上述步骤重复再提取1次，即在该沉淀中加蒸馏水、常温浸泡、加热至沸腾，保持微沸后离心，取上清液，合并两次离心所得的上清液，即为蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液。蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖粗提液的浓缩：将上述的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液于旋转蒸发仪中减压浓缩至100mL，得浓缩液。乙醇沉淀：向上述浓缩液中缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到75％时，室温静置15小时，离心除去乙醇上清液，收集沉淀。干燥：沉淀加70mL水溶解，水浴锅上挥去乙醇，置于-20℃冰箱中冻存12h后放入冷冻干燥机中冷冻干燥，即得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖，该多糖为含有微量杂质的粗多糖；蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的得率为21.50％。
实施例3
上表中为通过本发明所述的方法6次提取所得的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的提取率以及通过现有技术6次提取所得的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的提取率。
由于本发明首先通过超微粉碎，能够将蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的细胞壁等均粉碎，再通过后续的一系列提供方法，能够更彻底更有效的将蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中的多糖进行提取；而现有技术不经过超微粉碎，只通过简单的浸泡等常规方法进行提取。
由于提取后蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖中还含有微量的其它杂质，故在计算纯多糖(本发明中所述的多糖均指蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖)时，是测量吸光度，再根据标准曲线计算样品浓度，最后推出纯多糖的质量，最后计算纯多糖的含量。
由上表可知，所提取的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖精品(即纯多糖，对应上表中的多糖)的提取率高，均在20％以上，比现有技术提高1～3个百分点，且不同批次的提取过程中偏差比较小，在实际的工业生产中具有重要的意义。
实施例4
样品制备：称取5mg依据本发明所制备的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖，加入1mL HPLC流动相，充分溶解，13200r/min离心10min，上清液经0.25μm的水相微孔膜过滤后进行HPLC分析。
色谱分析条件：分析柱选TSK PWXL6000和TSK PWXL3000凝胶色谱柱串联后分析，流动相为含0.05mol/L的NaH2PO4和0.15mol/L的NaNO3溶液(pH＝7，0.02％叠氮钠)，流速为0.5mL/min，色谱柱温用柱温箱恒定在35℃；检测器为示差检测器；所得色谱图如图1所示。
实施例5
采用该蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖体外刺激巨噬细胞释放一氧化氮(NO)的活性测定，发现该多糖对RAW264.7巨噬细胞株释放NO有明显的促进作用，可明显增强巨噬细胞的吞噬杀伤能力，从而增强机体的抗肿瘤能力。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下所作的有关本发明的任何修饰或变更，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
S1：蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的提取：以蝙蝠蛾拟青霉菌丝体为原料，超微粉碎至粒径为7～11μm的超细粉末，加入至水中，浸泡，再加热至沸腾，保持微沸60-120分钟，离心；分离沉淀和上清液，取沉淀并按上述步骤重复再提取1～2次，取每次离心分离后的上清液并合并，即为蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液；
S2：浓缩：将步骤S1中蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液进行减压蒸馏，浓缩至液体和原料的比例为2∶1～4∶1时为止，得到浓缩液；
S3：沉淀：向步骤S2中所述的浓缩液中缓慢加入乙醇，边加边搅拌，然后室温静置12-18小时，离心，弃上清液，收集沉淀；
S4：干燥：向步骤S3中所述的沉淀中加水溶解，加热除去残留乙醇，然后进行冷冻干燥，即得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖，得率大于20％。
2.根据权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，其特征在于：步骤S1中，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的提取的具体方法为：以蝙蝠蛾拟青霉菌丝体为原料，超微粉碎为粒径在7～11μm的超细粉末，加入到15-20倍原料重量的水中，常温浸泡30-60分钟，再加热至沸腾，保持微沸60-120分钟后离心；分离沉淀和上清液，取沉淀并按上述步骤重复再提取1～2次，取每次离心分离后的上清液并合并，即为蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液。
3.根据权利要求2所述的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，其特征在于：将所述蝙蝠蛾拟青霉菌丝体超微粉碎至粒径为10μm的超细粉末。
4.根据权利要求2所述的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，其特征在于：常温浸泡后再加热至沸腾，保持微沸90-105分钟。
5.根据权利要求2所述的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，其特征在于：所述离心的时间为20min。
6.根据权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，其特征在于：步骤S2中，将蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的粗提液浓缩至液体和原料的固体的比例为3∶1时为止。
7.根据权利要求1所述的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述乙醇加至乙醇含量达到70％-80％时停止。
8.根据权利要求7所述的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖的制备方法，其特征在于：所述乙醇为无水乙醇。
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