CN105920089A - 一种从核桃青皮中高效分离制备植物总多酚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从核桃青皮中高效分离制备植物总多酚的方法，包括如下步骤；S1、以云南大理漾濞核桃青皮为原料，将核桃青皮自然风干至恒重并粉碎，去离子水7～12倍量加热回流提取2次，合并提取液，将提取液减压浓缩得到浸膏，离心除去残渣，备用；S2、取S1中0.5～2ml离心后的浸膏，30%乙醇25ml定容，稀释10倍后，用福林‑酚法测定测总多酚含量，计算浸膏中总多酚含量；另取S1中0.5～2ml离心后的浸膏于西林瓶，烘干至恒重，减重法计算所得固形物；两者之比为浸膏中多酚纯度。本发明方法简单，成本低廉并提取效率高；且高效提取的高纯度植物总多酚可广泛应用于生物农药、食品、医药领域。
Description
技术领域
本发明涉及有机物分离纯化技术领域，尤其涉及一种从核桃青皮中高效分离制备植物总多酚的方法。
背景技术
核桃，又称胡桃，羌桃，为胡桃科植物，被称为世界著名的“四大干果”之一。核桃树环境适应性强、病虫害少、果实贮运方便、经济和营养价值极高。核桃的种植在中国分布很广，其中云南是我国核桃原产地之一，在面积、产量、品质、及产值均居全国之首。截至2015年，云南省核桃种植面积已达4100万亩，成为云南种植栽培范围最广、面积最大、产量产值最高的经济林木，给云南省带来了巨大的经济效益。目前，已有漾濞、楚雄、大姚、南华、永平、凤庆、云龙、昌宁8个县(市)被授予“中国核桃之乡”称号。
随着核桃种植产业的迅速发展，种植面积不断扩大，导致大量的核桃青皮的产生。目前核桃的青皮只被作为农业废弃物处理，大量种植农户将核桃青皮未经处理就地废弃，其中的多类化学有害物质导致了当地土壤和水源等生态环境的严重污染。保护生态环境及农业废弃物的综合利用已成为国家最关注的热点之一。因此，近几年国内学者开展了针对核桃青皮提取物的综合利用的研究。研究发现核桃青皮中的植物源色素可应用于染织行业；提取的生物碱可作为药物利用；提纯的植物总多酚可用于害虫及病菌的综合防治。但是，核桃青皮中的植物总多酚物质的提取产量不高，纯度过低，导致其未能被综合利用，其中利用化学试剂提取和纯化多酚物质方法存在技术瓶颈。例如金属离子沉淀分离法存在技术离子与多酚类物质产生络合沉淀而难被分离，另外，金属盐的残留也导致多酚产品安全性存在隐患。微波辅助提取法和超声波辅助提取法加速溶质扩散速率从而加速多酚物质提取，但加热过程都导致多酚物质的不稳定而被破坏，从而提取有效成分效率偏低。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种从核桃青皮中高效分离制备植物总多酚的方法。
本发明提出的一种从核桃青皮中高效分离制备植物总多酚的方法，包括如下步骤；
S1、以云南大理漾濞核桃青皮为原料，将核桃青皮自然风干至恒重并粉碎，去离子水7～12倍量加热回流提取2次，合并提取液，将提取液减压浓缩得到浸膏，离心除去残渣，备用；
S2、取S1中0.5～2ml离心后的浸膏，30％乙醇25ml定容，稀释10倍后，用福林-酚法测定测总多酚含量，计算浸膏中总多酚含量；另取S1中0.5～2ml离心后的浸膏于西林瓶，烘干至恒重，减重法计算所得固形物；两者之比为浸膏中多酚纯度。
优选地，S1中加热回流提取2次，合并提取液时，第1次提取加去离子水10倍量，加热回流温度在40～60℃，加热回流时间80～120min，离心，收集提取液。第2次提取加去离子水10倍量，加热回流温度在40～60℃，加热回流时间80～120min，离心，合并2次提取液，减压浓缩。
优选地，S1中云南大理漾濞核桃青皮自然风干时，为通风处阴干，温度不超过45℃，以保证核桃青皮活性物质在风干过程中无损失。
优选地，S1中粉碎时，用市场上能买到的，各型号的粉碎机，容量不小于1000g，电机转速不大于25000r/min，以保证核桃青皮活性物质无机械损失。
优选地，S2中乙醇洗脱液浓度为30％，pH值6.0，洗脱液流速为2BV/h，洗脱时间为2.5小时，洗脱5倍柱体积，柱体积为20L；收集洗脱液减压浓缩回收后；取1ml洗脱液用30％乙醇25ml定容，稀释10倍后，福林-酚法测定测洗脱液总多酚含量；另取1ml洗脱液于西林瓶，烘干至恒重，减重法计算所得固形物；两者之比为洗脱液中多酚纯度。
本发明一种从核桃青皮中高效分离制备植物总多酚的方法，其优势在于核桃青皮经自然干燥至恒重，加去离子水回流，减压浓缩，然后以乙醇为溶剂采用大孔树脂柱色谱技术对提取物中的植物总多酚进行洗脱提纯，经富集纯化后多酚纯度可达到30.02％；精制倍数达到3.2倍，发现30％乙醇洗脱核桃青皮总多酚效果最好，洗脱率达到36.8％；本发明方法简单，成本低廉并提取效率高；且高效提取的高纯度植物总多酚可广泛应用于生物农药、食品、医药领域。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
本实施例提出了一种从核桃青皮中高效分离制备植物总多酚的方法，包括如下步骤；
1、试验材料和试剂
材料：核桃品种选取漾濞核桃，主产于云南省大理白族自治州漾濞彝族自治县，该品种种植历史达3000多年，是果油兼优的优良品种，是目前云南商品核桃生产最主要的栽培品种；
试剂：食用乙醇、去离子水、没食子酸、福林酚、碳酸钠、无水乙醇均为分析纯；
仪器：酶标仪，玻璃层析柱、日本三菱HP20大孔吸附树脂；
2、核桃青皮提取物减压浓缩处理
干燥核桃青皮2kg，以去离子水10倍量加热回流提取2次，合并提取液，利用单效浓缩器将提取液减压浓缩得到浸膏，最终浓缩至体积为2L，离心除去残渣备用。
3、生物多酚以没食子酸为标准建立标准曲线
1)实验溶液
(1)10％福林酚溶液：取10mL福林酚试剂，加入100mL棕色容量瓶中，加去离子水定容，锡箔纸包裹，放置通风柜；
(2)7.5％Na2CO3溶液：取7.5％Na2CO3，加入100mL白色容量瓶中，加去离子水定容；
(3)没食子酸贮备溶液：0.5mg/mL没食子酸(500ppm)：取25mg没食子酸对照品置于50mL容量瓶中加去离子水定容；
(4)没食子酸标准系列溶液：配制没食子酸对照品浓度分别为0、25、50、75、100、150ppm。
2)酶标仪检测波长
根据多个波段检测没食子酸标准系列溶液，最终选取的检测波长为765nm；
3)标准曲线的建立
选取没食子酸标准系列溶液，浓度依次为0.025，0.05，0.075，0.1，0.15mg/ml，在765nm进行读数，利用回归方程最终公式为Y＝6.1494x+0.0061。其R2达到0.9991。结果表明该标准曲线达到检测生物多酚浓度的标准。
表1没食子酸标品标准曲线的建立
4、核桃青皮植物总多酚含量的测定
1)核桃青皮植物总多酚含量测定方法的建立
(1)分别在96孔板上移入25μl稀释成不同浓度的样品待测液；
(2)倒取10％福林-酚试剂至塑料容器中，用排枪在每个孔中加入125μl福林-酚试剂；
(3)轻轻震荡混匀96孔板，静置10min；
(4)倒取7.5％Na2CO3至塑料容器中，用排枪在每个孔中也加入125μlNa2CO3，静置不少于30min，用密封膜密封；
(5)将核桃青皮提取物(浸膏)进行HP20大孔吸附树脂柱色谱，柱体积为20L，依次以水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱部位，减压回收。
(6)在酶标仪765nm下读数，根据没食子酸标准品的线性回归方程，计算样品总多酚含量。
2)待测样品含量测定结果
精密量取100mL核桃青皮提取液(浸膏)定容至1000mL后，取1ml经10％福林-酚试剂处理10min，加入7.5％Na2CO3静置处理30min后。稀释25倍后测定，总多酚浓度为0.132mg/mL，因此100mL浸膏中含总多酚为：0.132mg/mL*25*1000mL＝3300mg＝3.3g，多酚提取率为3.3％。
精密量取100mL核桃青皮提取液(浸膏)定容至1000mL后，取1mL于西林瓶，烘干至恒重，减重法计算净重为0.0348g，则1000mL净重为34.8g，则核桃青皮浸膏中总多酚的纯度为3.3g/34.8g*100％＝9.5％。
5、与其他方法提取效率的比较
采用几种常见提取核桃青皮的方法，进行了相关的多酚物质提取，选取方法及操作步骤如表2所示，结果发现其他方法核桃青皮总多酚提取率基本在2.5％左右。而采用本专利的提取方法多酚提取率为3.3％，明显高于所采用的其他方法。
表2其他核桃青皮多酚提取方法的步骤及提取率
6、核桃青皮总植物总多酚的纯化
吸附实验：利用预处理过的HP20大孔吸附树脂柱，吸附核桃青皮提取液浸膏。取100ml总多酚提取物(浸膏)定容于1000ml容量瓶，再梯度稀释5个系列后，测定吸光度，计算多酚浓度，为此系列浓度为上样浓度。动态吸附条件：树脂用量料液比1:20，流速为1.5BV/h，pH值：6.0，吸附时间：8小时。当流出液多酚浓度达到上样液浓度的1/100，达到吸附饱和，停止上样。
水洗：用三重蒸馏水以2BV/h流速进行冲洗，以去除未被树脂吸附的糖、蛋白质等杂质，直到浓硫酸一葱酮反应以及荀三酮显色反应呈阴性为止。
动态洗脱实验：依次以30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇在HP20大孔吸附树脂柱色谱洗脱，最佳洗脱条件为：乙醇洗脱液浓度为30％，pH值：6.0，洗脱液流速为2BV/h，洗脱时间为2.5小时，洗脱5倍柱体积，柱体积为20L。收集30％乙醇洗脱部位，减压回收减压浓缩回收后，简称洗脱液。
取1ml洗脱液用30％乙醇25ml定容，稀释10倍后，福林-酚法测定测洗脱液总多酚含量；吸光度平均值为0.528，终浓度为0.069mg/ml，计算获得1ml洗脱液总多酚0.069mg/ml*10*25＝17.25mg。
另取1ml洗脱液于西林瓶，烘干至恒重，减重法计算所得固形物净重为57.46mg。经过HP20大孔吸附树脂柱分离后，总多酚的纯度为17.25/57.46*100％＝30.02％。
实验表明HP20型大孔吸附树脂对富集纯化核桃青皮中的多酚具有较好的效果，将多酚纯度由9.5％提高到30.02％，精制倍数达到3.2倍，发现30％乙醇洗脱核桃青皮总多酚效果最好，洗脱率达到36.8％。因此，利用低浓度乙醇能有效提取核桃青皮中的植物总多酚，其产量和纯度可广泛应用于生物农药、食品、医药领域。
本发明以核桃青皮为研究材料，用HP20型大孔吸附树脂分离纯化核桃青皮水提液中的多酚类物质，有广泛的应用前景，为核桃青皮资源的开发、综合利用及环境保护提供新途径。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种从核桃青皮中高效分离制备植物总多酚的方法，其特征在于，包括如下步骤；
S1、以云南大理漾濞核桃青皮为原料，将核桃青皮自然风干至恒重并粉碎，去离子水7～12倍量加热回流提取2次，合并提取液，将提取液减压浓缩得到浸膏，离心除去残渣，备用；
S2、取S1中0.5～2ml离心后的浸膏，30%乙醇25ml定容，稀释10倍后，用福林-酚法测定测总多酚含量，计算浸膏中总多酚含量；另取S1中0.5～2ml离心后的浸膏于西林瓶，烘干至恒重，减重法计算所得固形物；两者之比为浸膏中多酚纯度。
2.根据权利要求1所述的一种从核桃青皮中高效分离制备植物总多酚的方法，其特征在于；S1中加热回流提取2次，合并提取液时，第1次提取加去离子水10倍量，加热回流温度在40～60℃，加热回流时间80～120min，离心，收集提取液。第2次提取加去离子水10倍量，加热回流温度在40～60℃，加热回流时间80～120min，离心，合并2次提取液，减压浓缩。
3.根据权利要求1所述的一种从核桃青皮中高效分离制备植物总多酚的方法，其特征在于；S1中云南大理漾濞核桃青皮自然风干时，为通风处阴干，温度不超过45℃，以保证核桃青皮活性物质在风干过程中无损失。
4.根据权利要求1所述的一种从核桃青皮中高效分离制备植物总多酚的方法，其特征在于；S1中粉碎时，用市场上能买到的，各型号的粉碎机，容量不小于1000g，电机转速不大于25000r/min，以保证核桃青皮活性物质无机械损失。
5.根据权利要求1所述的一种从核桃青皮中高效分离制备植物总多酚的方法，其特征在于；S2中乙醇洗脱液浓度为30%，pH值6.0，洗脱液流速为2BV/h，洗脱时间为2.5小时，洗脱5倍柱体积，柱体积为20L；收集洗脱液减压浓缩回收后；取1ml洗脱液用30%乙醇25ml定容，稀释10倍后，福林-酚法测定测洗脱液总多酚含量；另取1ml洗脱液于西林瓶，烘干至恒重，减重法计算所得固形物；两者之比为洗脱液中多酚纯度。
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