CN102382151A - 红花黄色素的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然药物提取领域，具体涉及红花黄色素的分离纯化方法。本发明所解决的技术问题是提供一种红花黄色素的分离纯化方法，可得到红花总黄色素含量＞96％的固形物。本发明红花黄色素的分离纯化方法，它是以红花为原料，以水为溶剂提取，提取物采用LX-68型大孔吸附树脂进行分离纯化，所得固形物中红花总黄色素含量＞96％，羟基红花黄色素A的含量＞16％，且操作简便、试剂消耗少、污染少。

Description

红花黄色素的分离纯化方法

技术领域

本发明属于天然药物提取领域，具体涉及红花黄色素的分离纯化方法。

背景技术

红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花。红花黄色素亦称红花黄，本发明简称SY，为红花主要有效组分，存在于红花的水溶性提取部位。羟基红花黄色素A，本发明简称HSYA，在红花黄色素中含量较高，具有抗肿瘤、抗凝血、抑制血栓形成、抗氧化、抗炎、降脂等作用^[1-4]。

红花中红花黄色素的含量差异较大，红花黄色素的提取纯化工艺研究一直是红花研究的热点问题。红花黄色素的传统制备工艺是用水提取、有机溶剂沉淀法精制，即红花-粉碎-蒸馏水浸提得浸提液-精制过滤-滤液减压浓缩-浓缩液沉淀-离心分离-真空干燥-粉碎-成品，但该方法所得产品纯度差，其中含有蛋白质、糖类、盐类等杂质，易吸潮，不易保存。近年来，大孔吸附树脂法成为分离纯化红花黄色素的研究热点，但不同的树脂类型，吸附系统均对红花黄色素的分离纯化有重大影响，因而高效的吸附系统一直是本领域技术人员追求的目标。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种红花黄色素的分离纯化方法，可得到红花总黄色素含量＞96％，羟基红花黄色素A的含量＞16％的固形物。

解决本发明技术问题是通过以下技术方案实现的：

A、提取；

B、提取液经吸附、洗脱；

C、收集洗脱液，干燥即得；

本发明分离纯化方法的关键之处在于：利用LX-68型大孔吸附树脂洗脱，得到红花黄色素含量达96％以上的固形物。其吸附、洗脱、分离过程如下：

(1)以LX-68型大孔吸附树脂洗脱，按1∶5～1∶10的径高比装柱，优选1∶9～1∶10；

(2)以红花总黄色素计，将步骤A所得提取液制成浓度为95mg·mL^-1～110mg·mL^-1的溶液，并以170～185mg·g^-1的比上样量，2.0～3.8BV·h^-1的流速上样；

(3)用5～7BV、pH值为2.0～3.0的水溶液清洗，用7～8BV、50～60％乙醇溶液以2.3～4.6BV·h^-1的流速进行洗脱。其中，(3)中pH值为2.0～3.0的水溶液称为“清洗液”。

上述分离纯化方法中，步骤A提取步骤具体是以红花为原料，以水为溶剂提取，得提取液；进而利用得到的提取液进行吸附、洗脱、分离。在利用水提取时，宜采用的提取条件为：水温50～60℃、提取次数为2～3次。

在本发明的制备方法的优选实施方式中，步骤A中提取用水量为红花生药重量的20～80倍，可根据制备条件和提取次数选择，每次40～60分钟。

在本发明的制备方法的优选实施方式中，步骤B中清洗液pH值调节剂为柠檬酸、苹果酸、乙酸、磷酸，均为食品添加剂，优选柠檬酸。

在本发明的制备方法的优选实施方式中，步骤B中乙醇的浓度采用酒精计测定。

采用本发明分离纯化方法，所得固形物中红花总黄色素含量＞96％，羟基红花黄色素A的含量＞16％，且操作简便、试剂消耗少、污染少。

附图说明

图1上样浓度曲线图。

图2上样量变化曲线图。

具体实施方式

以下对本发明具体实施方式进行描述说明但不限制本发明。

本发明分离纯化工艺是经过对分离纯化工艺中的关键参数：上样条件、清洗条件、洗脱条件进行考察，最终得到了本发明红花黄色素的最佳分离纯化方法，提高了固形物中红花总黄色素及羟基红花黄色素A的含量。

1.材料和仪器

红花：购于成都荷花池中药材市场，经裴瑾教授鉴定为菊科植物红花(Carthamus tinctoriusL.)的干燥花；羟基红花黄色素A对照品：经HPLC检测，纯度≥99％；LD605、D140、D141、D100、D160大孔吸附树脂由中蓝晨光化工研究院提供；HPD100、HPD300、HPD400A、HPD600、D900大孔吸附树脂由河北沧州宝恩化工有限公司提供；LX-68、LX-10、LX-10G、AB-8大孔吸附树脂由西安蓝晓科技有限公司提供；AB-8、D101大孔吸附树脂由天津市光复精细化工研究所提供。

UV1100型紫外可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司)；玻璃层析柱(2cm×50cm)；试剂均为分析纯。

2.测定方法

标准曲线的制备  精密称取羟基红花黄色素A对照品1.76mg于10mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用；分别精密量取羟基红花黄色素A对照品溶液0.5mL、0.8mL、1.0mL、1.3mL、1.6mL、2.0mL于5mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。以蒸馏水为空白，按照分光光度法(中国药典2010年版一部附录)在403nm的波长处测定吸光度。以吸光度为横坐标，羟基红花黄色素A浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得羟基红花黄色素A浓度(y)和吸光度(x)的相关回归方程：y＝0.0829x-0.0036，R＝0.9995，在0.0176mg·mL^-1～0.0704mg·mL^-1范围内线性关系良好。

3.样品溶液的制备

红花黄色素为水溶性成分，大量文献和实验表明以水为溶剂在一定温度下可有效提取，且能源消耗少、无溶剂残留。红花药材中红花黄色素的含量虽存在较大的差异。但本实验通过对红花黄色素提取条件工艺参数的考察表明，以红花生药重量的20～80倍的水，水温50～60℃、提取次数为2～3次，每次40～60分钟，即能有效提取红花中的红花黄色素，与文献相符。

称取一定量的红花，以蒸馏水为溶剂，在料液比为1∶20(g·mL^-1)、pH值为5.5、温度为50℃、时间为50min的条件下提取两次，合并滤液，浓缩，冷却至室温，备用。

4.不同大孔吸附树脂吸附性能的比较

将上述16种树脂分别置于相同的容器中，加入高于树脂层10cm的95％乙醇浸泡24h，放出浸液，用95％乙醇洗涤至洗涤液1份于5份水中不呈白色浑浊状时即可，水洗至无醇味，抽干，备用。

精密称取16种树脂各1.0g，各两份，置具塞锥形瓶中，分别加入20mL样品溶液，时时振摇，保持2h，静置18h，时时振摇，保持2h，静置2h，过滤，抽干，并用100mL蒸馏水清洗树脂，合并滤液，稀释测其吸光度。清洗后的大孔吸附树脂置具塞锥形瓶中，分别加入50％乙醇溶液20mL，密封静置解吸24h，并时时振摇，取解吸液稀释测其吸光度。计算比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率和损失率，结果见表1。比吸附量(比解吸量)为平均每克大孔吸附树脂吸附(解吸)的总黄色素的量。损失率为分离纯化过程中损失量与上样量的百分比。

结果表明：D160、D900、LX-68型大孔吸附树脂的比吸附量明显高于其他树脂。D900的比解吸量和解吸率都极低，损失率达95.31％，采用其他多种洗脱剂未见明显改善，则不予进行下一步研究。D160与LX-68型大孔吸附树脂差异较小，通过对浸膏得率和HPLC法测定羟基红花黄色素A含量的比较，选择LX-68型大孔吸附树脂对红花黄色素的纯化工艺进行下一步研究。

表1 16种大孔吸附树脂吸附性能比较表

5.大孔吸附树脂分离纯化条件的考察

5.1上样条件的考察

上样条件直接影响着提取纯化结果，本研究对相关上样条件(上样浓度、上样pH值、上样流速、径高比、上样量)进行了系统考察和确定。

5.1.1上样浓度的考察

称取预处理好的树脂7g，湿法装柱，以不同浓度相同比上样量上样，第一次吸附后，浸置30min，用等量蒸馏水清洗，用等量50％乙醇解吸，测其比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率、损失率及成品中红花总黄色素与HSYA的含量，结果见表2、图1。

表2上样浓度考察表

结果表明：当上样浓度大于100mg·mL^-1时吸附率趋于稳定，上样浓度为113.28mg·mL^-1时损失率最小，上样浓度越大成品中红花总黄色素与HSYA含量越高。结合比解吸量和变化曲线图分析表明，上样浓度以95～110mg·mL^-1为宜。

5.1.2上样流速的考察  称取预处理好的树脂7g，湿法装柱，将一定浓度的样品溶液以不同流速上样，其他操作同5.1.1。结果见表3。

表3上样流速考察表

结果表明：上样流速越低其比吸附量和吸附率越高，当吸附流速为3.82BV·h^-1时，损失率明显增大。上样流速对成品中主要成分含量的影响不大，但流速过低不利于操作，则上样流速以2.0～3.8BV·h^-1为宜。

5.1.3径高比的考察  称取适量预处理好的树脂，湿法装柱，测定径高比，将一定浓度的样品溶液以相同流速上样，其他操作同5.1.1。结果见表4。

表4径高比考察表

结果表明：径高比对吸附率和解吸率均有较大影响。当径高比为1∶9、1∶10时，吸附率、解吸率均较高；当径高比为1∶5时，损失率最小；当径高比为1∶7时，损失率最大，但HSYA含量相对较高；当径高比小于1∶5，在去除树脂表面沉积的杂质时，易造成流速的快速增大，同时柱内液体的量对压力、流速的影响也明显增大，以致损失率增大且不稳定；当径高比大于1∶10时，树脂柱内气泡明显增多，亦有压力不稳或堵塞的情况，吸附率明显下降，且操作不便。故径高比以1∶5～1∶10为宜，1∶9～1∶10最佳。

5.1.4上样量的考察  按径高比为1∶10，称取预处理好的树脂，湿法装柱，以相同浓度不同上样量上样，结果见表5。

表5比上样量考察

结果表明：比上样量越高比吸附量越高，但吸附率随之降低；比解吸量和解吸率逐渐升高；当比上样量为124.36mg·g^-1、153.87mg·g^-1时，损失率差异较小，但比解吸量差异明显。结合比解吸量、损失率及变化曲线图分析表明，当比上样量为170～185mg·g^-1为宜。

5.2清洗条件的考察

对吸附后的树脂进行清洗可有效除去树脂空隙中残留的提取液和杂质，对固形物纯度的影响也较大^[5]。本研究对清洗液pH值、清洗流速、清洗液用量进行了考察。为减少误差，均按上述试验结果进行静态吸附后进行清洗试验。

5.2.1清洗液pH值的考察  分别用等量pH值为2、3、4、6.0的蒸馏水溶液，以3.82BV·h^-1的流速清洗，测其比吸附量和吸附率。结果见表6。

表6清洗液pH值、流速考察表

结果表明：清洗液pH值越低，其比吸附量和吸附率越大。当pH值为2.0、3.0时吸附率差异较小，则清洗液pH值以2.0～3.0为宜。

5.2.2清洗流速的考察  用等量pH值为2.0的蒸馏水溶液，以不同流速清洗，测其比吸附量和吸附率。结果见表6。结果表明：清洗流速对吸附结果影响甚小，清洗流速可根据实际情况适量增大。

5.2.3清洗液用量的考察  用pH值为2.0的蒸馏水，以3.82BV·h^-1的流速清洗，采用Molish反应判断清洗终点^[5]，测其清洗液用量、比清洗量、比吸附量和吸附率。比清洗量为平均每克树脂清洗的红花总黄色素的量。结果见表7。

表7清洗液用量考察表

清洗液用量(BV)	比清洗量(mg·g-1)	比吸附量(mg·g-1)	吸附率(％)
				3.18	14.41	157.06	91.60
4.77	15.61	155.86	90.89
				5.41	16.09	155.38	90.62
6.05	16.52	154.94	90.36
				7.32	17.41	154.06	89.85
8.92	18.37	153.10	89.29
				10.51	19.28	152.20	88.76

结果表明：清洗液用量对吸附结果的影响并不明显。当清洗液用量为5.14BV时，Molish反应呈弱阳性；当清洗液用量为6.05BV时，Molish反应增强，随着清洗液用量的增大，Molish反应逐渐增强，而总黄色素的损失率也逐渐增大。清洗液用量不宜过大，以6BV为宜。

5.3洗脱条件的考察

洗脱条件直接影响着固形物的得率和纯度。本研究根据文献^[5～9]，对洗脱剂浓度、洗脱流速、洗脱剂用量进行了考察。为减少误差，均按上述试验结果进行静态吸附、清洗后进行洗脱试验。

5.3.1洗脱剂浓度的考察  分别用等量不同浓度的乙醇溶液，以相同流速进行洗脱，测其比解吸量、解吸率。结果见表8。

表8洗脱剂浓度、洗脱流速考察表

结果表明：50％、60％乙醇溶液的解吸效果基本相同，明显比40％、70％好，且成品中总黄色素与HSYA含量无明显差异，则洗脱剂浓度以50～60％为宜。

5.3.2洗脱流速的考察  用等量50％乙醇溶液，以不同流速进行洗脱，测其比解吸量、解吸率。结果见表8。结果表明：洗脱流速越低解吸效果越好，当洗脱流速为2.29BV·h^-1、4.59BV·h^-1相差较小，成品中总黄色素与HSYA含量均无明显差异，则洗脱流速以2.3～4.6BV·h^-1为宜。

5.3.3洗脱剂用量的考察  按上述试验结果进行吸附清洗后，用50％乙醇溶液以相同流速进行洗脱，测定每次洗脱剂用量、比解吸量和解吸率。结果见表9。

表9洗脱剂用量考察表

每次洗脱剂用量	1.2BV	1.2BV	1.2BV	1.2BV	1.2BV	1.2BV	1.2BV	1.2BV
									0比解吸量(mg·g-1)	87.22	46.70	12.50	5.63	3.98	2.24	0.96	0.76
解吸率(％)	50.95	31.56	7.45	3.81	1.67	0.50	0.31	0.12
									累计比解吸量(mg·g-1)	87.22	133.92	146.42	152.05	156.03	158.27	159.23	159.99
累计解吸率(％)	50.95	82.51	89.96	93.77	95.44	95.94	96.25	96.37
									总黄色素含量(％)	-	99.87	99.84	99.84	99.83	99.85	-	-
HSYA含量	-	22.10	20.89	19.90	19.17	18.89	-	-

结果表明：当洗脱剂用量为7.2BV后，比解吸量和解吸率的增加趋势明显减少，在此情况下继续解吸对能源和时间的消耗较大，则大规模生产中洗脱剂用量以7～8BV为宜，解吸液中总黄色素含量基本物变化，HSYA含量随洗脱剂用量的增大而略有减少。

6.验证试验

按径高比为1∶10，称取适量预处理好的LX-68型树脂，6份，(其中三份为使用第12次的树脂，另外三份为使用第2次的树脂)，湿法装柱，以181.49mg·g^-1为上样量，精密吸取浓度为100.40mg·mL^-1的样品溶液，以2.5BV·h^-1的流速上样吸附后，浸置30min，用6BV pH值为2.0的蒸馏水溶液，以10BV·h^-1的流速清洗后，用7BV 50％乙醇溶液，以2.5BV·h^-1洗脱。测其比吸附量、比解吸量、损失率。洗脱液在50℃，1.0kpa的条件下进行回收，得干燥品，并测定成品中红花总黄色素与HSYA的含量。结果见表10。

表10验证试验

7.讨论

树脂的选择  不同厂家不同型号的大孔吸附树脂，对红花黄色素的吸附率和解吸率均不同。本研究根据文献^[5～8]和市场调查，选择了不同厂家、不同结构、不同极性的16种大孔吸附树脂进行筛选。结果表明：一定极性的树脂更适合红花黄色素的纯化，树脂的平均孔径越小吸附率越大；HPD400、D160、LX-68型树脂较适宜红花黄色素的纯化，其中LX-68型树脂为弱极性树脂，HPD400型树脂为中极性树脂，D160型树脂为极性树脂，三种树脂的平均孔径均明显小于其他树脂。另外，离子交换型树脂D900型的吸附率最大，但解吸率最低，比解吸量也最低，采用其他多种洗脱剂也未见改善，则未进行下一步研究。LX-68型大孔吸附树脂为一新型树脂，其结构为苯乙烯-二乙烯苯聚合物(其他树脂均为聚乙烯结构)，平均孔径也最小，主要用于色素类成分的纯化。LX-68型树脂与其他三种树脂相比，其吸附率最高，比解吸量与最高者仅差0.03％，而解吸率较低，则选择LX-68型大孔吸附树脂对红花黄色素纯化工艺进行优化。

上样条件  本研究对所有上样条件(上样浓度、上样pH值、上样流速、径高比、上样量)进行了考察和确定。据文献报道^[5，10]，当上样pH值为弱酸性时吸附效果较好。本研究采用饱和柠檬酸溶液对样品溶液进行pH值的调节，实验结果表明上样pH值对吸附率确有一定影响，但呈倒抛物曲线变化，而比解吸量变化较小。可见上样pH值对吸附过程的影响较复杂，且样品溶液本身呈酸性(pH值为4～5)，其比解吸量与最大解吸量差异较小，同时需加入大量的缓冲液才能改变其pH值，则不拟进行下一步研究。

清洗条件  本研究对清洗液pH值、清洗流速、清洗液用量进行了考察，结果表明清洗液pH值和清洗液用量对试验结果影响较大，尤其是清洗液的用量对吸附率的影响较为复杂。以Molish反应为基础^[5]，结合吸附率的变化确定了清洗液用量。而清洗流速对吸附率的影响甚小，可适当调大，更有利于工业化大规模制备红花黄色素。

洗脱条件  本研究对洗脱剂浓度、洗脱流速、洗脱剂用量进行了考察。根据文献，通过试验选择了合适的洗脱剂和洗脱流速，首次结合解吸率和比解吸率确定了洗脱剂用量，更有利于工业化大规模制备红花黄色素。

树脂使用次数  试验结果表明当树脂的使用次数为10次后，动态吸附量仅降低了0.3％。可见，该树脂经处理后可反复多次使用。该树脂在处理过程中只需用一定量的50％乙醇溶液浸泡即可，适当调整乙醇浓度有助于残留物的浸出。

得率与纯度  不同产地不同存贮时间的红花药材中红花总黄色素含量差异较大^[11]。本研究采用存放一年的红花，经确定的最佳工艺进行提取纯化后得浸膏，浸膏在五氧化二磷干燥器中干燥得固形物(干燥粉末)，固形物得率为11.92％，红花总黄色素转移率为52.17％，羟基红花黄色素A转移率为94.10％。分离纯化过程中，损失率约为16％。红花黄色素含多种黄色素类成分，其化学结构差异较小，提取纯化过程对提取液和纯化液进行长时间的加热浓缩，使得红花黄色素损失或转化较大。大孔吸附树脂已广泛应用于黄酮类化合物的纯化，对多糖、蛋白质等成分的祛除效果较好，但对鞣质的祛除效果较差。本研究采用一种新型树脂对红花黄色素进行纯化工艺的研究，其纯化干燥物中红花黄色素的含量＞99％，其中主要成分羟基红花黄色素A的含量＞18％，明显高于其他市售品。本课题组将结合现代科学技术对此工艺进行优化以减少损失提高固形物得率，并对红花黄色素中其他成分进行分析研究。

考察本发明红花黄色素分离纯化方法得到的红花黄色素，对比三种市售红花黄色素的总红花黄色素和羟基红花黄色素A，结果见下表11。

表11

综上可见，本发明分离纯化方法得到的红花黄色素以总黄色素计与市售产品相当，羟基红花黄色素A明显优于现有市售产品。

参考文件1：周剑.复方桃红四物汤中红花的物质基础研究[D].南京：南京中医药大学，2008.

参考文件2：肖文英.红花黄色素研究进展[J].临床医药实践杂志，2006，15(9)：646-648.

参考文件3：Takahashi Y，Miyassaka N，Tasaka SH，et al.Constitution of two coloring mat ters in theflower petals of cart hamus tinc2 torius L[J]，Tet rahedron Let t，1982，23(49)：5.

参考文件4：黄明发，郭莉，苏学素，等.红花黄色素研究进展[J].中国调味品，2008，6：24-28.

参考文件5：宋洪涛，初阳，张倩，等.采用大孔吸附树脂纯化红花提取物的研究[J].福州总医院学报，2005，9(12)：181-184.

参考文件6：施峰，王光忠，刘焱文.大孔树脂分离纯化红花黄色素的研究[J].湖北中医学院学报，2007，3(9)：47-48.

参考文件7：彭永芳，马银海，阎孝金，等.AB-8树脂吸附和分离红花黄色素[J].食品科学，2001，22：39-41.

参考文件8：许珍珍，黄罗生，赵浩如，等.不同大孔树脂对红花黄色素吸附性能的比较[J].中成药，2008，30(7)：1062-1063.

参考文件9：金鸣，高子淳，李金荣，等.大孔树脂柱色谱法制备红花黄色素和羟基红花黄色素A[J].中草药，2004，35(1)：25-28.

参考文件10：雷玉霞，张长弓，赵丽，等.大孔吸附树脂分离纯化红花黄色素的工艺研究[J].医药导报，2007，26(6)：656-657.

参考文件11：郭美丽，张芝玉，张汉明，等.不同产地红花药材的质量评价[J].中国中药杂志，2000，25(8)：469-471.

Claims (6)

1.红花黄色素的分离纯化方法，包括以下步骤：

A、提取；

B、提取液经吸附、洗脱；

C、收集洗脱液，干燥即得；

其特征在于：

步骤A提取步骤如下：以红花为原料，以水为溶剂提取，得提取液；

步骤B洗脱步骤如下：

(1)以LX-68型大孔吸附树脂洗脱，按1∶5～1∶10的径高比装柱，优选1∶9～1∶10；

(2)以红花总黄色素计，将步骤A所得提取液制成浓度为95mg·mL^-1～110mg·mL^-1的溶液，并以170～185mg·g^-1的比上样量，2.0～3.8BV·h^-1的流速上样；

(3)用5～7BV、pH值为2.0～3.0的清洗液清洗，用7～8BV、50～60％乙醇溶液以2.3～4.6BV·h^-1的流速进行洗脱。

2.根据权利要求1所述的红花黄色素的分离纯化方法，其特征在于：步骤B洗脱步骤中LX-68型大孔吸附树脂按1∶9～1∶10的径高比装柱。

3.根据权利要求1或2所述的红花黄色素的分离纯化方法，其特征在于：步骤B洗脱步骤(3)中所述的清洗液采用柠檬酸、苹果酸、乙酸或磷酸为pH值调节剂。

4.根据权利要求3所述的红花黄色素的分离纯化方法，其特征在于：所述的pH值调节剂为柠檬酸。

5.根据权利要求1-4任一项所述的红花黄色素的分离纯化方法，其特征在于：步骤A中红花以水为溶剂提取，提取条件为：提取水温50～60℃、提取次数为2～3次。

6.根据权利要求5所述的红花黄色素的分离纯化方法，其特征在于：步骤A提取时，用水量为红花重量的20～80倍，提取时间为每次40～60分钟。

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