CN104945530A

CN104945530A - 一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法

Info

Publication number: CN104945530A
Application number: CN201510416405.8A
Authority: CN
Inventors: 王立坚; 王道武; 王晓明
Original assignee: Changchun Wancheng Bioelectronic Engineering Co Ltd
Current assignee: Changchun Wancheng Bioelectronic Engineering Co Ltd
Priority date: 2015-07-16
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2015-09-30

Abstract

本发明涉及一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法，属于生物技术领域。在众多大孔吸附树脂中筛选出三种可用于精制松塔多糖的树脂，分别是D301G阴离子、732阳离子、D101三种大孔吸附树脂，包括如下步骤：原料的脱脂预处理，热水浸提制备粗多糖，粗多糖酶解，大孔吸附树脂处理，超滤去除小分子，真空冷冻干燥，制备松塔多糖。使用本发明方法最终得到脱色的并去除大部分蛋白和小分子杂质的红松松塔多糖，获得较高的多糖保留率、脱色率、蛋白脱除率和得率，并适合产业化规模化生产红松松塔精制多糖。

Description

一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是涉及利用大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法。

背景技术

红松(Pinus koraiensis Sieb.et Zucc)又名果松，属于松科植物，主要分布在我国东北长白山到小兴安岭一带。很早之前日本民间就流传用松塔煮水治疗胃癌的偏方。化学成分研究表明，红松松塔中含有萜类、木质素、黄酮、挥发油、维生素类、棕榈碱、矿物质、多糖、蛋白质，以及脂肪等多种成分。

药理研究证实松塔多糖具有抗氧化、调节免疫机能、抑制肿瘤、抗菌、抗病毒等功效，其中调节免疫机能及抑制肿瘤等功效尤为突出。在日本已将松塔多糖作为健康食品和医药品的原料。但长期我国的红松松塔要末被人弃用，要末作为柴薪和工艺品，利用率和附加值低。急需开发一种，具有良好的应用前景，适合产业规模化生产红松松塔多糖的方法。

大孔吸附树脂是一类不含交换基团的高分子吸附材料，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，具有很好的吸附活性。大孔吸附树脂是近代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，70年代末开始将其应用于中草药成分的提取分离。大孔吸附树脂是分离中草药水溶性成分的一种有效方法。不同结构的大孔吸附树脂对亲水性酚类衍生物的吸附作用研究表明不同类型大孔吸附树脂均能从极稀水溶液中富集微量亲水性酚类衍生物，且易洗脱，吸附作用随吸附物质的结构不同而有所不同，同类吸附物质在各种树脂上的吸附容量均与其极性水溶性有关。

某些大孔树脂已经用到多糖中的去蛋白研究中，取得了很好的效果。采用大孔吸附树脂精制红松松塔多糖去除蛋白和色素还未见报道。其优点集中在以下四点：

一.能缩小剂量，提高中药内在质量和制剂水平。经大孔树脂吸附技术处理后得到的多糖精制物可使药效成分高度富集，杂质少，提取得率仅为原生药的5－8％，而一般水煮法为20－30％左右，醇沉法为15％左右，可见，剂量缩小了，杂质少了，内在质量提高了，有利于制成现代剂型的中药，也便于质量控制。药效学和临床使用都证实了同一类药采用此工艺后药效的提高。该工艺1次完成了除杂和浓缩两道工序。中药水提取物体积大，有效成分含量低，剂量太大剂型选择困难，给生产带来难题，如果大孔树脂吸附技术处理，问题就较好解决了。

二.减少产品的吸潮性。传统工艺制备的中成药大部分具有较强的吸潮性，是中药生产及贮藏中长期存在的难题。而经大孔树脂吸附技术处理后，可有效地去除水煎液中大量的蛋白、无机盐、黏液质等吸潮成分，有利于多种中药剂型的生产，增强产品的稳定性。

三.大孔树脂吸附技术能缩短生产周期、所需设备简单。免去了静置沉淀、浓缩等耗时多的工序。节约包装，降低成本，为中药进入国际市场创造了条件。

四.提高了蛋白和色素的脱除率。也是最重要的一点，由于多糖的组成复杂性，多糖粗提物的分子量分布较广，多糖种类也很多，而且前期实验表明，提取后的红松松塔多糖中含有一定量的蛋白和色素，影响多糖的化学结构和生物活性的研究，因此有必要对多糖进行分离纯化。但去除粗多糖中的蛋白和色素，一直是多糖分离纯化中的一大难题，传统的去蛋白和去色素的方法操作繁琐、效率低。传统的去蛋白以三氟乙酸、Sevage法为主，方法操作繁琐，效率低，采用的有机溶剂有毒性因而影响多糖的生物活性，活性炭法去除色素效果较好，但后期的活性炭粉末不易去除，过氧化氢法因为较强的抗氧化性去除色素效果较好，但对多糖的活性影响较大，本专利应用的三种大孔吸附树脂蛋白和色素的脱除率远远超过了以上方法。

有关松塔多糖制备方面的专利有，专利1：一种红松松塔多糖的制备方法(申请公开号CN102020721A)就是采用三氟乙酸去蛋白，过氧化氢去色素的方法；专利2：一种从松塔中提取多糖和萜类化合物的方法(申请公开号CN102649821A)基本就是水提醇沉后得到的粗多糖，没有进一步精制和纯化。

发明内容

本发明提供一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法，应用生物酶和大孔吸附树脂替代传统的Sevage法、活性炭法和过氧化氢法去除蛋白和色素，适合规模化产业化制备红松松塔精制多糖。

本发明采取的技术方案是：包括如下步骤：

A.原料的脱脂预处理；

取干燥的红松松塔粉碎，置于4-8倍体积的60-95％乙醇溶液中浸泡16-24h，残渣阴凉处风干；

B.热水浸提制备粗多糖；

预处理后的残渣风干后，加10-20倍蒸馏水(V/W)，沸水提取1-3h，80-120目纱布过滤，滤渣重复提取1-3次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖；

C.粗多糖酶解；

将粗多糖加水溶解后配制0.5-2.0％(V/W)的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖的3-5％(V/W)，35-45℃，反应20-40min，得粗多糖的酶解液；

D.大孔吸附树脂处理；

粗多糖的酶解液加入预处理好的树脂层析柱中，大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝1.2-2.0:1V/W，流速控制在1.5-2.2ml/min，收集流出液；

E.超滤去除小分子；

采用超滤分子量1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质，得红松松塔多糖样品；

F.真空冷冻干燥，

先将红松松塔多糖样品放置于-20℃,3h，然后转入-80℃冷冻6h-10h，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的红松松塔多糖。

本发明一种实施方式是：A.原料的脱脂预处理；置于6.5倍体积的80％乙醇溶液中浸泡20h。

本发明一种实施方式是：B.热水浸提制备粗多糖；

加15倍蒸馏水(V/W)，沸水提取2h，100目纱布过滤。

本发明一种实施方式是：C.粗多糖酶解；将粗多糖加水溶解后配制0.5-2.0％(V/W)的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3.5-4.5％(V/W)，36-42℃，反应25-35min，得粗多糖的酶解液。

本发明一种实施方式是：C.粗多糖酶解；将粗多糖加水溶解后配制0.5-2.0％(V/W)的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的4.0％(V/W)，40℃,反应30min，得粗多糖的酶解液。

本发明一种实施方式是：D.大孔吸附树脂处理；所述的预处理是指，大孔吸附树脂先用无水乙醇浸泡24h，并用无水乙醇洗脱至无色，然后用水洗至无色，然后水洗至无醇味，然后加1MHCl溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性。

本发明一种实施方式是：D.大孔吸附树脂处理；

按照D301G阴离子大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝1.5:1(V/W)，流速控制在1.8ml/min，收集流出液。

本发明一种实施方式是：D.大孔吸附树脂处理；

按照732阴离子大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝1.6:1(V/W)，流速控制在1.7ml/min，收集流出液。

本发明一种实施方式是：D.大孔吸附树脂处理；

按照D101大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝1.7:1(V/W)，流速控制在1.8ml/min，收集流出液。

本发明应用生物酶和大孔吸附树脂替代传统的Sevage法、活性炭法和过氧化氢法去除蛋白和色素，适合规模化产业化制备红松松塔精制多糖。

使用本发明方法最终得到脱色的并去除大部分蛋白和小分子杂质的红松松塔多糖，获得较高的多糖保留率、脱色率、蛋白脱除率和得率，并适合产业化规模化生产红松松塔精制多糖。

具体实施方式

以下实施例中，三种大孔吸附树脂：D301G阴离子大孔吸附树脂、732阴离子大孔吸附树脂和D101大孔吸附树脂的预处理方法分别是：大孔吸附树脂先用无水乙醇浸泡24h，并用无水乙醇洗脱至无色，然后用水洗至无色，然后水洗至无醇味，然后加1MHCl溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性。

实施例1

A.原料的脱脂预处理；

取干燥的红松松塔粉碎，置于4倍体积的60％乙醇溶液中浸泡16h，以除去脂肪、部分单(寡)糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。

B.热水浸提制备粗多糖；

预处理后的残渣风干后，加10倍蒸馏水(V/W)，沸水提取1h，80目纱布过滤，滤渣重复提取1次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖；

C.粗多糖酶解；

将粗多糖加水溶解后配制0.5％(V/W)的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖的3％(V/W)，35℃，反应20min，得粗多糖的酶解液；

D.大孔吸附树脂处理；

粗多糖的酶解液加入预处理好的树脂层析柱中，大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝1.2:1V/W，流速控制在1.5ml/min，收集流出液；

该大孔吸附树脂为D301G阴离子大孔吸附树脂或732阴离子大孔吸附树脂或D101大孔吸附树脂中的一种；

E.超滤去除小分子；

F.真空冷冻干燥，

先将红松松塔多糖样品放置于-20℃，3h，然后转入-80℃冷冻6h，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的红松松塔多糖。

实施例2

包括如下步骤：

A.原料的脱脂预处理；

取干燥的红松松塔粉碎，置于6倍体积的78％乙醇溶液中浸泡20h，以除去脂肪、部分单(寡)糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干；

B.热水浸提制备粗多糖；

预处理后的残渣风干后，加15倍蒸馏水(V/W)，沸水提取2h，100目纱布过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖；

C.粗多糖酶解；

将粗多糖加水溶解后配制1.25％(V/W)的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖的4％(V/W)，40℃，反应30min，得粗多糖的酶解液；

D.大孔吸附树脂处理；

粗多糖的酶解液加入预处理好的树脂层析柱中，大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝1.6:1V/W，流速控制在1.8ml/min，收集流出液；

E.超滤去除小分子；

F.真空冷冻干燥，

先将红松松塔多糖样品放置于-20°，3h，然后转入-80℃，冷冻8h，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的红松松塔多糖。

实施例3

包括如下步骤：

A.原料的脱脂预处理；

取干燥的红松松塔粉碎，置于8倍体积的95％乙醇溶液中浸泡24h，以除去脂肪、部分单(寡)糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干；

B.热水浸提制备粗多糖；

预处理后的残渣风干后，加20倍蒸馏水(V/W)，沸水提取3h，120目纱布过滤，滤渣重复提取1-3次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖；

C.粗多糖酶解；

将粗多糖加水溶解后配制2.0％(V/W)的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖的5％(V/W)，45℃反应40min，得粗多糖的酶解液。

D.大孔吸附树脂处理；

粗多糖的酶解液加入预处理好的树脂层析柱中，大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝2.0:1V/W，流速控制在2.2ml/min，收集流出液；

E.超滤去除小分子；

采用超滤分子量1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质，得红松松塔多糖样品。

F.真空冷冻干燥，

先将红松松塔多糖样品放置于-20℃，3h，然后转入-80℃，冷冻10h，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的红松松塔多糖。

实施例4

包括如下步骤：

A.原料的脱脂预处理；

取干燥的红松松塔粉碎，置于6.5倍体积的80％乙醇溶液中浸泡20h，以除去脂肪、部分单(寡)糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干；

以下步骤同实施例1或2或3。

实施例5

步骤A，B，C，E，F同实施例1或2或3；

D，大孔吸附树脂处理；

粗多糖的酶解液加入预处理好的D301G阴离子大孔吸附树脂层析柱中，按照D301G阴离子大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝1.5:1(V/W)，流速控制在1.8ml/min，收集流出液。

实施例6

步骤A，B，C，E，F同实施例1或2或3；

D，大孔吸附树脂处理；

粗多糖的酶解液加入预处理好的732阴离子大孔吸附树脂层析柱中，按照732阴离子大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝1.6:1(V/W)，流速控制在1.7ml/min，收集流出液。

实施例7

步骤A，B，C，E，F同实施例1或2或3；

粗多糖的酶解液加入预处理好的D101大孔吸附树脂层析柱中，按照D101大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝1.7:1(V/W)，流速控制在1.8ml/min，收集流出液。

试验例本发明红松松塔多糖含量和蛋白含量的测定，以及蛋白脱除率、色素脱除率和多糖保留率的计算。其中多糖含量(％)＝总糖的含量(％)-还原糖的含量(％)。

总糖含量测定采用苯酚-硫酸法；还原糖含量测定采用DNS法；蛋白含量测定采用Bradford法。

色素脱除率％＝(A₀-A₁)/A₀×100％

式中：A₀、A₁分别为脱色前和脱色后溶液在波长450nm处的吸光度。

蛋白脱除率％＝(C₀-C₁)/C₀×100％

式中：C₀、C₁分别为脱色前和脱色后溶液在波长450nm处的吸光度。

多糖保留率％＝(M₀-M₁)/M₀×100％

式中：M₀、M₁分别为处理前后的多糖含量。

下面是本发明、Sevage法、活性炭法和过氧化氢法精制红松松塔多糖的结果比较，由此可以看出，大孔吸附树脂兼具去除蛋白和色素的能力。见下表：

	色素脱除率％	蛋白脱除率％	多糖保留率％	得率％
					D301G阴离子树脂	87.6	73.8	75.2	69.8
732阳离子树脂	92.3	78.5	71.2	65.7
					D101树脂	89.2	86.5	60.5	76.4
Sevage法	19.3	41.2	65.9	49.1
					活性炭法	53.8	14.5	34.6	47.6
过氧化氢法	74.1	13.9	34.0	35.1

本发明采用三种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法，不仅可以去除蛋白，还兼具去除色素的能力，因此制备的多糖纯度较高，三种树脂处理后的多糖与处理之前的粗多糖比较，色素脱除率、蛋白脱除率以及多糖保留率都显著提高，并且各有细微的特点，根据产品的要求都可以选择性的用来纯化粗多糖，例如产品注重蛋白脱除率可选择D101树脂，产品注重多糖保留率可选择D301G阴离子树脂，产品注重色素脱除率可选择732阳离子树脂。

Claims

1.一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法，其特征在于包括如下步骤：

A.原料的脱脂预处理；

B.热水浸提制备粗多糖；

预处理后的残渣风干后，加10-20倍蒸馏水V/W，沸水提取1-3h，80-120目纱布过滤，滤渣重复提取1-3次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖；

C.粗多糖酶解；

将粗多糖加水溶解后配制0.5-2.0％V/W的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖的3-5％V/W，35-45℃，反应20-40min，得粗多糖的酶解液；

D.大孔吸附树脂处理；

E.超滤去除小分子；

F.真空冷冻干燥，

先将红松松塔多糖样品放置于-20℃,3h，然后转入-80℃，冷冻6h-10h，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的红松松塔多糖。

2.根据权利要求1所述的一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法，其特征在于所述步骤A.原料的脱脂预处理中：置于6.5倍体积的80％乙醇溶液中浸泡20h。

3.根据权利要求1所述的一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法，其特征在于所述步骤B.热水浸提制备粗多糖：加15倍蒸馏水V/W，沸水提取2h，100目纱布过滤。

4.根据权利要求1所述的一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法，其特征在于所述步骤C.粗多糖酶解：将粗多糖加水溶解后配制0.5-2.0％V/W的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3.5-4.5％V/W，36-42℃，反应25-35min，得粗多糖的酶解液。

5.根据权利要求4所述的一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法，其特征在于所述步骤C.粗多糖酶解：将粗多糖加水溶解后配制0.5-2.0％V/W的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的4.0％V/W，40℃,反应30min，得粗多糖的酶解液。

6.根据权利要求1所述的一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法，其特征在于所述步骤D.大孔吸附树脂处理中，所述的预处理是指，大孔吸附树脂先用无水乙醇浸泡24h，并用无水乙醇洗脱至无色，然后用水洗至无色，然后水洗至无醇味，然后加1MHCl溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性。

7.根据权利要求1所述的一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法，其特征在于所述步骤D.大孔吸附树脂处理：按照D301G阴离子大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝1.5:1V/W，流速控制在1.8ml/min；收集流出液。

8.根据权利要求1所述的一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法，其特征在于所述步骤D.大孔吸附树脂处理：按照732阴离子大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝1.6:1V/W，流速控制在1.7ml/min，收集流出液。

9.根据权利要求1所述的一种大孔吸附树脂精制红松松塔多糖的方法，其特征在于所述步骤D.大孔吸附树脂处理：按照D101大孔吸附树脂：粗多糖酶解液＝1.7:1V/W，流速控制在1.8ml/min，收集流出液。