CN105294789A - 一种高纯度红景天苷的制备方法 - Google Patents

一种高纯度红景天苷的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高纯度红景天苷的制备方法,包括将红景天原材料粉碎后加入95%乙醇溶液浸泡、渗滤;吸取渗滤液静置后的上清液,使用弱极性的大孔树脂吸附去除多糖和蛋白质;上样后使用纯化水冲洗至无色,再进行梯度洗脱;将红景天苷粗品采用高效反相液相色谱柱内进行分离,以甲醇水溶液作为流动相进行梯度洗脱;当目标物峰出现时分段收集洗脱液;将红景天苷纯度高于98%的洗脱液进行冷冻干燥,得到高纯度的红景天苷。本发明通过渗滤、大孔树脂吸附去除包括糖类和蛋白质的杂质得到红景天苷粗品,去除糖类和蛋白质杂质后有利于提高高效反相液相色谱的纯化度,并通过合理的梯度洗脱和洗脱液,进一步提高产品的纯度和收率。

Description

一种高纯度红景天苷的制备方法
技术领域
本发明涉及中药有效成分提取方法技术领域,具体涉及到一种高纯度红景天苷的制备方法。
背景技术
红景天为景天科红景天属多年生草本植物或亚灌木野生植物,植物资源丰富,品种众多,全世界约有96种,我国有73种。红景天中的红景天苷是该种植物所特有的有效成分,具有扶正固本、调和阴阳、滋补强身等作用,现代药理研究证明,红景天苷具有预防和抗痴呆作用、抗缺氧作用、延缓衰老作用和抑制快速型室性心率失常的作用,临床上用来治疗冠心病、高原低血压症、高原性红细胞增多症。毒性试验表明,红景天苷毒性甚小:红景天苷1g/Kg小鼠皮下注射,未见毒性反应。近年来,随着人们生活水平的提高,加上人口结构的老龄化,心血管疾病的发病率呈逐年上升的趋势,开发治疗效果较好的心脑血管疾病的药物已经成为当今药物研究的热点,临床研究报道显示:高纯度单一成分的红景天苷在治疗心脑血管方面具有良好的应用前景。
红景天苷,英文名salidroside,化学名“对羟苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-hydroxyphenethyl-β-D-glucoside)”,系统命名:1-(4-羟基)苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷,主要从高原药用植物“红景天”(Rhodiolasachalinensis)和常用中药“女贞子”(Ligustrumlucidum)中提取获得。药理实验表明,红景天提取物红景天苷有良好的心血管系统作用;在脑缺血、缺氧,神经元细胞凋亡方面均有一定的保护作用。
国家知识产权局于2006.6.14公开了一件申请号为200510111859.0,名称为“一种制备红景天苷的方法”的发明专利,该专利是一种以女贞子为原料、采用大孔吸附树脂纯化技术制备红景天苷粗品的方法,本发明改变了主要用藏药植物红景天制备红景天苷的现状,从而原料来源广,降低了成本,提取效果好。本发明方法为:用60-80%乙醇浸提粉碎女贞子得红景天苷提取液,将其经弱极性AB-8型大孔树脂吸附,先以纯净水冲洗,再经25-35%乙醇洗脱,收集洗脱液回收乙醇并浓缩后再经弱极性AB-8型大孔树脂吸附,经纯净水冲洗,25%~35%乙醇洗脱,回收乙醇浓缩即得红景天苷粗品。
由此可见,目前国内外对高纯度红景天甙的制备多采用传统方法,缺少能够工业化大规模生产高纯度红景天甙的工艺。传统方法采用多步溶剂萃取并结合硅胶柱和聚酰胺柱层析,具有浪费有机溶剂、高的能量消耗、分离效率低、有机溶剂残留和高劳动强度的缺点。虽然高速逆流色谱(HSCCC)可以用来制备高纯度的红景天苷,但该法也具有高成本、有机溶剂残留和不适合工业化实际的缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种从中药材中提取红景天苷的方法,该方法具有可以获得高纯度的红景天苷。
为达上述目的,本发明的一个实施例中提供了一种高纯度红景天苷的制备方法,包括以下步骤:
(1)、将红景天原材料粉碎成粗粉,在粗粉中加入1倍粗粉重量的95%乙醇溶液浸泡;浸泡完毕后加入65%~75%乙醇溶液浸渍20h~30h进行渗滤;收集渗滤液后浓缩,静置10h以上,得到渗滤液;
(2)、吸取渗滤液静置后的上清液,使用弱极性的大孔树脂吸附去除多糖和蛋白质;上样后使用纯化水冲洗至无色,再依次使用洗脱液10%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇和30%乙醇进行梯度洗脱,分别收集各梯度洗脱液并浓缩得到五组红景天苷粗品A1~A5;
(3)、将红景天苷粗品A1~A5分别采用高效反相液相色谱柱进行分离,均以甲醇水溶液作为流动相进行梯度洗脱;当目标物峰出现时分段收集洗脱液;
(4)、将红景天苷纯度高于98%的洗脱液进行冷冻干燥,得到高纯度的红景天苷。
本发明的优化实施例中,浸泡时间为1h;浸渍时间为24h。
本发明的优化实施例中,大孔树脂为AB-8型大孔树脂。
本发明的优化实施例中,多糖为鼠李糖和阿拉伯糖。
本发明的优化实施例中,纯化水的体积为1倍柱体积,流速为2ml/min。
本发明的优化实施例中,步骤(2)中梯度洗脱的洗脱液流速为2ml/min。
本发明的优化实施例中,步骤(3)中洗脱液甲醇水溶液的洗脱梯度依次为95%、90%、85%、80%、70%。
本发明的优化实施例中,步骤(3)中包括将纯度低于98%的洗脱液重新洗脱进行精制的过程。
本发明的优化实施例中,高效反相液相色谱柱的填料为C18。
综上所述,本发明具有以下优点:
本发明通过渗滤、大孔树脂吸附去除包括糖类和蛋白质的杂质得到红景天苷粗品,去除糖类和蛋白质杂质后有利于提高高效反相液相色谱的纯化度,并通过合理的梯度洗脱和洗脱液,进一步提高产品的纯度和收率;
本发明的未采用柱层析中使用的大量有机溶剂,使用的有机溶剂仅为乙醇,产品无有机溶剂残留,安全性高;并且可以重复利用大孔树脂,在保证分离效果的同时,提高了资源利用率。
具体实施方式
实施例1
预处理:取狭叶红景天饮片,将其粉碎成粗粉;参照流浸剂与浸膏剂的渗滤法使用与粗粉等重量的95%乙醇(质量分数)搅拌均匀浸泡1h;
粗提:将65%乙醇溶液加入浸泡中的粗粉内,使粗粉完全浸渍在乙醇溶液中,浸渍24h后渗滤,收集渗滤液后低温真空浓缩,回收溶剂乙醇,浓缩液为渗滤液。
大孔树脂纯化:吸取渗滤液静置后的上清液,使用弱极性的AB-8型大孔树脂吸附去除多糖和蛋白质。去除多糖和蛋白质的具体步骤为:上清液上样后使用纯化水冲洗至无色,纯化水的体积为1倍柱体积,流速为2ml/min。再依次使用洗脱液10%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇和30%乙醇进行梯度洗脱,洗脱液流速为2ml/min。分别收集各梯度洗脱液并浓缩得到五组红景天苷粗品;即使用10%乙醇溶液洗脱后得到粗品A1、使用15%乙醇溶液洗脱后得到粗品A2、使用20%乙醇溶液洗脱后得到粗品A3、使用25%乙醇溶液洗脱后得到粗品A4、使用30%乙醇溶液洗脱后得到粗品A5。
高效反相液相色谱纯化:将红景天苷粗品A1~A5分别采用高效反相液相色谱柱进行分离,均以甲醇水溶液作为流动相进行梯度洗脱;高效反相液相色谱柱的填料为C18;洗脱液甲醇水溶液的洗脱梯度依次为95%、90%、85%、80%、70%。当目标物峰出现时分段收集洗脱液;并检测各组各分段中洗脱液中红景天苷的纯度;
冷冻干燥:将红景天苷纯度高于98%的洗脱液进行冷冻干燥,得到高纯度的红景天苷;将纯度低于98%的洗脱液再次使用高效反相液相色谱纯化直至纯度高于98%。
实施例2
预处理:取狭叶红景天饮片,将其粉碎成粗粉;参照流浸剂与浸膏剂的渗滤法使用与粗粉等重量的95%乙醇(质量分数)搅拌均匀浸泡1h;
粗提:将65%乙醇溶液加入浸泡中的粗粉内,使粗粉完全浸渍在乙醇溶液中,浸渍24h后渗滤,收集渗滤液后低温真空浓缩,回收溶剂乙醇,浓缩液为渗滤液。
大孔树脂纯化:吸取渗滤液静置后的上清液,使用弱极性的AB-8型大孔树脂吸附去除多糖和蛋白质。去除多糖和蛋白质的具体步骤为:上清液上样后使用纯化水冲洗至无色,纯化水的体积为1倍柱体积,流速为2ml/min。再依次使用洗脱液10%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇和30%乙醇进行梯度洗脱,洗脱液流速为2ml/min,洗脱液的pH值为6.5。分别收集各梯度洗脱液并浓缩得到五组红景天苷粗品;即使用10%乙醇溶液洗脱后得到粗品A1、使用15%乙醇溶液洗脱后得到粗品A2、使用20%乙醇溶液洗脱后得到粗品A3、使用25%乙醇溶液洗脱后得到粗品A4、使用30%乙醇溶液洗脱后得到粗品A5。
检测实施例1和实施例2粗品A1~A5中鼠李糖的含量,可以得知,实施例2的A1~A5中的鼠李糖含量平均比实施例1的含量低15%~24%,具有显著性差异,说明实施例2粗品中鼠李糖含量分离效果更好,说明弱酸性环境可以提高鼠李糖的分离效果。
高效反相液相色谱纯化:将红景天苷粗品A1~A5分别采用高效反相液相色谱柱进行分离,均以甲醇水溶液作为流动相进行梯度洗脱;高效反相液相色谱柱的填料为C18;洗脱液甲醇水溶液的洗脱梯度依次为95%、90%、85%、80%、70%。当目标物峰出现时分段收集洗脱液;并检测各组各分段中洗脱液中红景天苷的纯度;每个粗品组通过5个梯度洗涤,形成5个分段,使得经过本发明的方法形成25个分段洗脱液。将实施例1中的所有洗脱液收集合并后检测得到其红景天苷的总纯度为92.1%,对于实施例2的方法总纯度为96.3%。由此可见,在鼠李糖含量降低后,红景天苷的分离纯化效果更好。
冷冻干燥:将红景天苷纯度高于98%的分段洗脱液进行冷冻干燥,得到高纯度的红景天苷;将纯度低于98%的分段洗脱液再次使用高效反相液相色谱纯化直至纯度高于98%。
实施例3
预处理:取狭叶红景天饮片,将其粉碎成粗粉;参照流浸剂与浸膏剂的渗滤法使用与粗粉等重量的95%乙醇(质量分数)搅拌均匀浸泡1h;
粗提:将65%乙醇溶液加入浸泡中的粗粉内,使粗粉完全浸渍在乙醇溶液中,浸渍24h后渗滤,收集渗滤液后低温真空浓缩,回收溶剂乙醇,浓缩液为渗滤液。
大孔树脂纯化:吸取渗滤液静置后的上清液,使用弱极性的AB-8型大孔树脂吸附去除多糖和蛋白质。去除多糖和蛋白质的具体步骤为:上清液上样后使用纯化水冲洗至无色,纯化水的体积为1倍柱体积,流速为2ml/min。再依次使用洗脱液30%乙醇进行洗脱,洗脱液流速为2ml/min。收集洗脱液并浓缩得到红景天苷粗品。经过检测,本实施例红景天苷粗品中鼠李糖的含量明显高于实施例1,再没有采用梯度洗脱的情况下,鼠李糖的分离效果较差。
高效反相液相色谱纯化:将红景天苷粗品采用高效反相液相色谱柱进行分离,均以甲醇水溶液作为流动相进行梯度洗脱;高效反相液相色谱柱的填料为C18;洗脱液甲醇水溶液的洗脱梯度依次为95%、90%、85%、80%、70%。当目标物峰出现时分段收集洗脱液;并检测各组各分段中洗脱液中红景天苷的纯度;
冷冻干燥:将红景天苷纯度高于98%的洗脱液进行冷冻干燥,得到高纯度的红景天苷;将纯度低于98%的洗脱液再次使用高效反相液相色谱纯化直至纯度高于98%。
实施例4
预处理:取圣地红景天饮片,将其粉碎成粗粉;参照流浸剂与浸膏剂的渗滤法使用与粗粉等重量的95%乙醇(质量分数)搅拌均匀浸泡1.5h;
粗提:将70%乙醇溶液加入浸泡中的粗粉内,使粗粉完全浸渍在乙醇溶液中,浸渍30h后渗滤,收集渗滤液后低温真空浓缩,回收溶剂乙醇,浓缩液为渗滤液。
大孔树脂纯化:吸取渗滤液静置后的上清液,使用弱极性的大孔树脂吸附去除多糖和蛋白质。去除多糖和蛋白质的具体步骤为:上清液上样后使用纯化水冲洗至无色,纯化水的体积为1倍柱体积,流速为2ml/min。再依次使用洗脱液10%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇和30%乙醇进行梯度洗脱,洗脱液流速为2ml/min。分别收集各梯度洗脱液并浓缩得到五组红景天苷粗品;即使用10%乙醇溶液洗脱后得到粗品A1、使用15%乙醇溶液洗脱后得到粗品A2、使用20%乙醇溶液洗脱后得到粗品A3、使用25%乙醇溶液洗脱后得到粗品A4、使用30%乙醇溶液洗脱后得到粗品A5。
高效反相液相色谱纯化:将红景天苷粗品A1~A5分别采用高效反相液相色谱柱进行分离,均以甲醇水溶液作为流动相进行梯度洗脱;高效反相液相色谱柱的填料为C18;洗脱液甲醇水溶液的洗脱梯度依次为95%、90%、85%、80%、70%。当目标物峰出现时分段收集洗脱液;并检测各组各分段中洗脱液中红景天苷的纯度;
冷冻干燥:将红景天苷纯度高于98%的洗脱液进行冷冻干燥,得到高纯度的红景天苷;将纯度低于98%的洗脱液再次使用高效反相液相色谱纯化直至纯度高于98%。
由此可见,本发明的方法先用大孔树脂吸附,再用反相高效色谱法纯化,可进一步提高红景天苷的纯度,且进一步提高收率;本发明的工艺涉及的设备简单,易操作,生产安全又降低成本;而且工艺涉及的大孔树脂可重复利用,分离效果好,资源综合利用率高。
本发明的工艺周期短,本发明从药材的粉碎提取到制备红景天甙产品,只需4天,本发明使用的溶剂仅为乙醇,无有机残留,安全性高,适合工业化大生产;制备出的红景天甙纯度高、溶解性、性能稳定。
本发明以渗滤法提取红景天方法采用常温不加热的方法,具有很高的安全价值。

Claims (10)

1.一种高纯度红景天苷的制备方法,包括以下步骤:
(1)、将红景天原材料粉碎成粗粉,在粗粉中加入1倍粗粉重量的95%乙醇溶液浸泡;浸泡完毕后加入65%~75%乙醇溶液浸渍20h~30h进行渗滤;收集渗滤液后浓缩,静置10h以上,得到渗滤液;
(2)、吸取渗滤液静置后的上清液,使用弱极性的大孔树脂吸附去除多糖和蛋白质;上样后使用纯化水冲洗至无色,再依次使用洗脱液10%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇和30%乙醇进行梯度洗脱,分别收集各梯度洗脱液并浓缩得到五组红景天苷粗品A1~A5;
(3)、将红景天苷粗品A1~A5分别采用高效反相液相色谱柱进行分离,均以甲醇水溶液作为流动相进行梯度洗脱;当目标物峰出现时分段收集洗脱液;
(4)、将红景天苷纯度高于98%的洗脱液进行冷冻干燥,得到高纯度的红景天苷。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述浸泡时间为1h。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述浸渍时间为24h。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述多糖为鼠李糖和阿拉伯糖。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述纯化水的体积为1倍柱体积,流速为2ml/min。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)中梯度洗脱的洗脱液流速为2ml/min。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(3)中洗脱液甲醇水溶液的洗脱梯度依次为95%、90%、85%、80%、70%。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(3)中包括将纯度低于98%的洗脱液重新洗脱进行精制的过程。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述高效反相液相色谱柱的填料为C18。
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