CN103479751A

CN103479751A - 联合提取枇杷花中三萜酸、多酚和多糖的方法

Info

Publication number: CN103479751A
Application number: CN201310442734.0A
Authority: CN
Inventors: 郑美瑜; 陆胜民; 夏其乐; 汪文浩
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-09-25
Filing date: 2013-09-25
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-09-25
Also published as: CN103479751B

Abstract

本发明涉及联合提取枇杷花中三萜酸、多酚和多糖的方法，方法如下：1）将枇杷花原料，干燥至含水量≦5﹪，磨粉过30目筛后，备用；2）脱脂；3）三萜酸的提取；4）总黄酮的提取；5）多糖的提取。本发明提供的方法充分利用了枇杷花茶加工留下的废弃物，使这些废弃物中含有的有效成分得到利用，联合提取了枇杷花中的三萜酸、多酚黄酮和多糖，使其中的有效成分能够分段分步的得以提取，改变以往只提取一种的状况；本发明提供的方法工艺简单，安全环保，成本低廉，可操作性强，易于实际生产应用。

Description

联合提取枇杷花中三萜酸、多酚和多糖的方法

技术领域

本发明涉及农副产品有效成分的提取及纯化技术领域，具体涉及一种从枇杷花中联合提取多种活性成分的方法。

背景技术

枇杷花为蔷薇科植物枇杷（Eriobotrya japonica Lindl）的花，性温，味淡，香味特别清香，带有甜味，含有总黄酮和三萜皂甙等成分，具有化痰、止咳和清肺等功效，据《本草纲目》记载，枇杷花“止渴下气，利肺气，止吐逆，清上焦热，润五脏”，民间常用于治疗小儿肺热咳嗽，老年人久咳不愈患者。枇杷在栽种过程中，枇杷全树有80%~90%的枝条可形成花穗，每个花穗有70~250朵花，但只有5%~10%的花可结成果实，大量的花白白凋谢，在枇杷产地，为提高枇杷的质量，果农每年均将多余的花疏除，大概每亩枇杷可以疏花100公斤，浙江省枇杷种植面积接近15万亩，约可以疏掉1万多吨的枇杷花。这些枇杷花直接丢弃在田间地头，造成资源浪费。现在，大家开始对枇杷花进行利用，出现了枇杷花的产业化加工，主要是生产枇杷花茶，这些企业分布在浙江、福建、四川等地。但加工枇杷花茶时，只挑取正开发、形态、颜色较好的花，而疏下来处于花蕾期或末花期、外形较差的花，则还是被丢弃，丢弃的比例大约占50%，所以实际还是有相当一部分没有利用起来。

枇杷花中富含多种活性成分，其中，三萜酸、多酚黄酮和多糖的含量都较高，这几种物质都具有显著的生理活性。三萜酸中的熊果酸和齐墩果酸药理研究证明其具有显著的抗癌、促进免疫、降血脂和降血糖功效；黄酮具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抑菌、降血脂、抗衰老等功效；多糖也具有增强免疫、抗氧化、降血脂等功效。因此，如果从花茶的加工废弃物中提取这些活性成分，这可以变废为宝。以往对有效成分的提取，都只提取其中的一种，这样不能最大程度的利用。

发明内容

本发明设计了联合提取枇杷花中的三种有效成分，因为这三种成分具有不同的极性，通过不同极性溶剂，分步把三种物质提取出来，使枇杷花得到全利用。另外，本发明针对在加工枇杷花茶时剩下的大量废弃物，如花蕾期和末花期的花，以及花枝等进行利用，这些废弃物中还含有较多的活性成分，可以进行提取，提高其附加值。

本发明基于上述两点，对枇杷花茶加工废弃物中的含量较高的三萜酸、黄酮和多糖进行联合提取，因为这三种物质在性质上有些差别，它们的极性依次由弱到强，因为可以选用极性不同的溶剂进行分步提取，得到三种成分含量较高的分离物，使枇杷花得到较大的利用，提取出的分离物可以用于食品、保健品和化妆品等领域。

为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案得以实现：

联合提取枇杷花中三萜酸、多酚和多糖的方法，该方法包括以下的步骤：

1）将枇杷花原料，干燥至含水量≦5﹪，磨粉过30目筛后，备用；

2）脱脂：把干燥的原料用石油醚，按1∶2~4的固液比加入，回流提取2~4次，每次0.8~1.2h，把脱脂后的原料挥去石油醚；

3）三萜酸的提取：脱脂后的原料粉末适量，加入80～100%体积百分比浓度的乙醇溶液，在微波萃取仪中提取，提取结束后，过滤，把滤液通过真空浓缩除去乙醇，再用适量80～100℃的热水溶解，冷却，静置12～24h，使其中的三萜酸能充分析出，离心或过滤，把沉淀物烘干，得到三萜酸分离物；

4）总黄酮的提取：取前一步提取后过滤出来的残渣，略干燥，加入60～80%体积百分比浓度的乙醇溶液，在微波萃取仪中提取，提取结束后，过滤，把滤液通过真空浓缩成膏状，再进一步烘干，得到总黄酮分离物；

5）多糖的提取：把第二步提取后过滤出来的残渣，略干燥，加入水，在微波萃取仪中提取，提取结束后，过滤，滤液加入1∶1～1.5的乙醇，搅拌，静置，使多糖能够充分析出，离心或过滤，把沉淀物烘干，得到多糖分离物。

作为优选，所述的枇杷花原料采用花茶加工留下来的花蕾期和末花期的花和外形较差的花朵。

作为优选，所述的枇杷花原料还包括部分花枝。

本发明由于采用了上述的技术方案，有益效果是：

（1）本发明提供的方法充分利用了枇杷花茶加工留下的废弃物，使这些废弃物中含有的有效成分得到利用，当然，本方法也可以应用于枇杷花的提取；

（2）联合提取了枇杷花中的三萜酸、多酚黄酮和多糖，使其中的有效成分能够分段分步的得以提取，改变以往只提取一种的状况；

（3）本发明联合提取三种物质三萜酸、多酚黄酮和多糖，它们的提取率分别为0.8%、6.8%和0.45%，得到三种提取物，得率分别为16.9%、26.4%和2.2%，三种物质的含量分别达到了2.13%、28.25%和20.45%；

（4）本发明提供的方法工艺简单，安全环保，成本低廉，可操作性强，易于实际生产应用；

（5）本发明所采用的原料是加工副产物，而得到的提取物具有较高的附加值，如果把提取物作进一步的纯化，则其价值更高，因此本发明具有较好的经济效益。

附图说明

图1为枇杷花茶加工副产物的联合提取应用的流程图。

图2为三萜酸提取物中熊果酸的高效液相分析图谱。

图3为三萜酸提取物中齐墩果酸的高效液相分析图谱。

图4为熊果酸的高效液相分析标准曲线。

图5为齐墩果酸的高效液相分析标准曲线。

图6为总黄酮标准曲线。

图7为总酚标准曲线。

图8为总糖标准曲线。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1 枇杷花三萜酸的提取

枇杷花茶加工的废弃物，干燥，粉碎，过30目筛后备用。称取该粉末1g，于微波萃取仪的萃取瓶中，加入乙醇溶液进行微波辅助提取，提取结束后过滤，滤液减压浓缩至干燥，提取物用甲醇溶解并定容，进样到高效液相色谱仪测定熊果酸和齐墩果酸，测定方法见试验例1。按照下列正交表（见表1）中的条件进行微波辅助提取，采用高效液相法测定提取物中的熊果酸（UA）和齐墩果酸（OＡ），根据综合指标优选出三萜酸提取工艺参数。根据实验结果，发现枇杷花中OA、UA的含量比值大约为1:5，通过权重法计算，综合指标=（OA含量平均值/OA含量最大值）×0.17×100+（UA含量平均值/UA含量最大值）×0.83×100。实验结果如下表2。

表1 三萜酸的提取条件正交表

Figure 2013104427340100002DEST_PATH_IMAGE001

表2 三萜酸提取正交试验结果

通过正交试验极差分析，枇杷花中OA、UA的提取的最佳工艺组合为A₂B₂C₂D₃，即乙醇浓度80%，固液比40，提取时间50min，微波功率300W，在此条件下OA和UA的提取率分别为3.118 mg/g和0.482 mg/g。

在上述最优的工艺条件下，提取枇杷花茶加工废弃物中的三萜酸，提取结束后，把滤液通过真空浓缩得浸膏，再用适量80～100℃的热水溶解，冷却，静置12～24h，使其中的三萜酸能充分析出，离心，把沉淀物烘干，得到三萜酸分离物169mg，三萜酸的总含量为2.13%。

实施例２枇杷花中黄酮和多酚的提取

把前一段提取三萜酸后的残渣略干燥，加入６０～８０％的乙醇，在微波萃取仪中进行萃取，提取结束后过滤，采用分光光度法测定上清液中的总黄酮和总酚的含量，测定方法见试验例2。按照下列正交表（见表3）中的条件进行微波辅助提取，优选出黄酮和多酚提取的工艺参数，实验结果如下表４。

表3 黄酮和多酚的提取条件正交表

表4 黄酮和多酚提取正交试验结果

通过对比黄酮和多酚的总量，在这一步里，黄酮和多酚尽可能地被提取出来，而多糖保留在里面。通过正交试验极差分析，黄酮提取最佳的组合为A₃B₂C₂D₂，多酚提取的最佳组合为A₃B₁C₁D₁，因为提取物中多酚含量较高，所以最佳组合选取A₃B₁C₁D₁，在此条件下黄酮和多酚的提取率分别为13.75 mg/g和54.90 mg/g，而多糖的为1.02 mg/g。这个提取率与1号试验的很接近，但是1号更加节省能源，成本较低，因此，选择1号为最优条件，即提取温度为70℃，乙醇浓度为60%，液固比为10，提取时间10min。

在上述最优的工艺条件下，进行枇杷花联合提取的第二步，提取其中的黄酮和多酚，提取结束后，过滤，把滤液通过真空浓缩成浸膏，并进一步烘干，得到第二步分离物264 mg，其中总黄酮的含量为8.07%，总酚的含量为20.75%。

实施例3　枇杷花中多糖的提取

把第二段提取的残渣略干燥后，加入水，在微波萃取仪中进行萃取，提取结束后过滤，测定滤液中的多糖含量。按照下列正交表（见表5）中的条件进行微波辅助提取，优选出黄酮和多酚提取的工艺参数，实验结果如下表6。

表5 多糖提取实验正交表

表6 多糖提取正交试验结果

通过正交试验极差分析，最佳的组合A₃B₃C₃，在此条件下多糖的提取率为4.6 mg/g，因此选取该组合为最优工艺条件，即提取温度80℃，液固比为30，提取时间为50 min。

在上述最优的工艺条件下，对枇杷花经第一步和第二步的提取后的残渣进行多糖提取，提取结束后，过滤，把滤液进行浓缩一倍左右，加入1.5倍的无水乙醇，混匀后静置12 h，使多糖充分析出，离心，沉淀用乙醇洗涤后，烘干，得到多糖分离物22 mg，多糖含量20.45%。

试验例1 枇杷花提取物中熊果酸和齐墩果酸的测定

采用P1201高效液相色谱仪（D230+二极管阵列检测器、P230高压恒流泵、AS120自动进样器、AXW-5柱温箱）分析，色谱条件为色谱柱Waters C₁₈(4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇-0.1%冰醋酸水溶液(94:6)，流速0.5mlmin^-1，检测波长210nm，柱温25℃，进样量10μL。

标准曲线的绘制：精密配制OA和UA的标准品溶液，分别精密量取标准溶液0.25、0.5、1、2、3、4mL于10mL容量瓶中，甲醇定容。精密吸取上述不同浓度的混合标准溶液10μL,在上述色谱条件下进行测定。以标准溶液浓度(mg/mL)为横坐标，检测的峰面积作为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线和方程见附图4、5标准品与样品的HPLC色谱图如附图2、3所示。在上述色谱条件下，对照品与样品中OA、UA的出峰时间基本一致，且分离度大于1.5。

样品中OA、UA的检测：把第一步的提取液过滤，取上清液减压浓缩至干燥，残留物用甲醇溶解并定容，进样前过0.45μm滤膜，在上述色谱条件下进行检测，并通过标准曲线方程计算出第一步分离物中的OA、UA的含量。

试验例2 枇杷花提取物中总黄酮和总酚的测定方法

10.5mg芦丁标准品于25ml容量瓶中，用乙醇定容，配成标准溶液，分别取标准溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3ml于10ml容量瓶中，用乙醇定容，得到不同溶液的标准溶液。取1ml上述溶液两份，一份加入1ml 2%二氯氧锆，5ml乙醇，另一份加入6ml乙醇，30℃下水浴1h，分别测定络合前后的420nm处吸光度值，用乙醇调零。以络合前后的吸光度差值ΔA为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，作标准曲线，标准曲线和方程见附图6。样品测定以1ml提取液代替标准溶液，通过标准曲线方程计算出提取液中总黄酮的浓度，进而计算出提取率和含量。

精密称取105℃干燥2小时的没食子酸标准品50mg，置于50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，得到标准溶液。分别量取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml标准溶液于10ml容量瓶中，加水定容至刻度。从容量瓶中移取不同浓度的标准溶液1ml于6个25ml容量瓶中，各加水9ml，然后加入0.5ml福林酚试剂，5min后加5% Na₂CO₃溶液5ml，用蒸馏水定容，摇匀，在室温下静置60 min，检测750nm处吸光度值，制作标准曲线，标准曲线和方程见附图7。样品测定以1ml提取液代替标准溶液，通过标准曲线方程计算出提取液中总酚的浓度，进而计算出提取率和含量。

试验例3 枇杷花提取物中总糖的测定方法

精确称取5mg葡萄糖用少量蒸馏水溶解，转移到50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，制成100μg/ml 的葡萄糖溶液，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于试管中并加水补充至体积为1ml，加入5%苯酚1ml，快速加入5ml浓硫酸，冷却后，以零管调零，测定490nm处吸光度值。制作标准曲线，标准曲线和方程见附图8。样品测定以1ml提取液代替标准溶液，通过标准曲线方程计算出提取液中总酚的浓度，进而计算出提取率和含量。

Claims

1.联合提取枇杷花中三萜酸、多酚和多糖的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

2.根据权利要求1所述的联合提取枇杷花中三萜酸、多酚和多糖的方法，其特征在于：枇杷花原料采用花茶加工留下来的花蕾期和末花期的花和外形较差的花朵。

3.根据权利要求2所述的联合提取枇杷花中三萜酸、多酚和多糖的方法，其特征在于：枇杷花原料还包括部分花枝。