CN103655928B - 一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法 - Google Patents

一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法。具体，茶叶渣水溶液以复合酶（果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶）酶解，酶解条件为pH5.0-6.5，温度50-60℃，酶解2-4h，而后煮沸2min，使酶失活；5-10％乙醇溶液浸提1-3h，共3次，合并浸提上清液，进行浓缩，回收溶剂，得浸膏，将浸膏溶于水中，加到大孔吸附树脂pH5.0-8.0中，加液量为柱体积1/3，先用水洗脱除杂，再用50-70%乙醇洗脱，用量为树脂体积的3-4倍，回收茶多酚。本发明与传统提取法比较具有提取速度快，成本低，不用重结晶，省时、省力；提取率高，杂质含量少，易于纯化；提取工艺不使用有毒溶剂，对环境友好等特点；项目适宜大规模工业化生产。

Description

一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法
技术领域
本发明属于天然产物或原料加工领域，具体涉及一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法。
背景技术
茶叶渣是茶叶冲泡后的茶叶渣滓。茶叶在泡水时只能把水溶性强的部分成分浸泡出来,茶多酚（TeaPolyphenols）是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等，未溶出成分主要是水难溶性成分，如黄酮类化合物。茶多酚是抗氧化剂，对人体内自由基具有清除作用，其清除自由基作用比VC、VE强很多倍，此外，茶多酚与抗氧化物还具有协同作用。对茶多酚提取分离的研究越来越引起世人的关注。茶叶渣滓直接丢弃造成巨大浪费，合理利用废弃茶叶渣，变废为宝具有很强的实际应用价值。
茶多酚的提取方法较多，但存在有以下问题，如水提法提取茶多酚含量很低；溶剂萃取法在提取过程中用到有机溶剂，使得茶多酚中残留有毒性物质，不安全；沉淀法提取茶多酚对于pH值的控制有很高要求，pH过高或过低对茶多酚的提取都不利，且对沉淀剂的选择要求高，有些金属盐离子容易产生残留，使茶多酚的安全性无法保证；超临界二氧化碳萃取法提取茶多酚无污染、无杂质，但是成本高，不适合大规模生产；膜技术的方法提取茶多酚，成本高、产量低。
发明内容
针对现有技术的上述问题，本发明提供一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法。该方法简单易行、成本低廉、适于大规模生产，提取的茶多酚产品安全、无污染。
为了实现上述目的，本发明包括以下技术方案：
一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法，该方法的步骤包括：
a、预处理：先将茶叶渣粉碎，将茶叶渣和水按重量比1：3-7混合，浸泡0.5-1小时；
b、复合酶解：向上述预处理液中，按茶叶渣重量的0.32%-1.16%加入复合酶，该复合酶为纤维素酶8-30重量份、果胶酶4-20重量份和木聚糖酶0.004-0.008重量份；用HCl调pH为5.0-6.5，温度为50℃-60℃时酶解2-4小时，而后煮沸2-4min，使酶失活；
c、乙醇浸取：使用5-10体积%乙醇对步骤b酶解后的混合物加热浸提，浸提温度75℃-80℃，将提取液离心，取上清液；
d、分离、提纯：将步骤c获得的上清液减压浓缩，得浸膏，加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏液缓慢滴加到大孔吸附树脂，用50-70体积%乙醇作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
如上所述的方法，优选地，所述步骤b中纤维素酶为60万U/g、果胶酶为80万U/g和木聚糖酶为4.2万U/g。
如上所述的方法，优选地，所述步骤c的具体操作为：向步骤b酶解后的混合物中加入无水乙醇，使乙醇终浓度达5-10体积%，加热至75℃-80℃浸提1-2h；过滤后的茶渣再用5-10体积%的乙醇浸提2次，每次所加5%-10%的乙醇为茶渣干重的5～10倍，浸提温度75℃-80℃，每次浸提1-2h，合并3次提取液，将提取液离心，取上清液。
如上所述的方法，优选地，所述步骤d中大孔吸附树脂为D-101、AB-8、X-5、LX-60、DM-130中的一种或几种,大孔吸附树脂中pH5.0-8.0。
如上所述的的方法，优选地，所述步骤b中复合酶中纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶添加量为重量比1500：1000：8。
如上所述的方法，优选地，所述步骤c中5-10体积%乙醇的浸提条件为，浸提温度80℃，每次浸提2h。
本发明所述的茶叶渣是茶叶冲泡后的茶叶渣滓。
本发明的有益效果为：
1、茶多酚具有明显的抗氧化、降血脂作用，用于制药、食品保健品行业，用途广泛。本专利研究了自茶叶渣中提取茶多酚的工艺制备的新方法。
2、本发明的提取方法以复合酶法进行酶解处理，成本低、环境友好、产量高、纯度高，适宜工业化生产。
3、整个提取过程操作简便，避免了有机溶剂带来的毒性成分。
4、本发明中使用5-10%乙醇提取，提取液澄清，粘度低，产品杂质少，后续处理方便。
5、本发明使用的大孔吸附树脂可反复使用，成本低。
6、本发明提取茶叶渣中的茶多酚，经复合酶处理，用50-70%乙醇洗脱，浸膏重量明显多于水提法，且50-70%乙醇洗脱浸膏中茶多酚的含量可达80%以上。说明通过使用本专利发明的复合酶酶解，5-10%乙醇提取，50-70%的乙醇洗脱就可将大部分的茶多酚富集，纯度大大增加。在复合酶中，木聚糖酶可分解原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低提取的粘度，促进有效成分茶多酚的释放，同时可降低提取液非淀粉多糖含量。本发明复合酶中包括少量木聚糖酶，提取率获得显著提高。
具体实施方式
以下实施例中所用茶树叶渣原料为：双子叶植物属被子植物门（Angiospermae）双子叶植物纲（Dicotyledoneae）山茶科（Theaceae）、山茶属（Camellia）茶Camelliasinensis(L.)O.Kuntze的嫩叶制成的各类茶叶。称取茶叶，用10倍重量的开水浸泡茶叶30-60分钟，连续浸泡三次，茶叶渣放在恒温干燥箱中干燥6小时至恒重。
所用纤维素酶为60万U/g、果胶酶为80万U/g、木聚糖酶为4.2万U/g。
实施例1
（1）取茶Camelliasinensis(L.)O.Kuntzes树叶渣500g，粉碎。
（2）加入3倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入果胶酶1.0g。
（3）HCl调pH为5.6，温度为50℃酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度77℃，每次1h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发,提取量为8.332mg/g。
（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到AB-8大孔吸附树脂，调pH6.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例2
（1）取茶叶Camelliasinensis(L.)O.Kuntze渣500g，粉碎。
（2）加入3倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入果胶酶1.5g。
（3）HCl调pH为5.6，温度为50℃酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度77℃，每次1h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液取上清液，减压蒸发,提取量为7.865mg/g。
（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到AB-8大孔吸附树脂，调pH7.2，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例3
（1）取茶叶Camelliasinensis(L.)O.Kuntze渣500g，粉碎。
（2）加入3倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入果胶酶2.0g。
（3）HCl调pH为5.6，温度为50℃酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度75℃，每次1h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发,提取量为7.241mg/g。
（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到LX-60大孔吸附树脂，调pH7.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例4
（1）取茶叶Camelliasinensis(L.)O.Kuntze渣500g，粉碎。
（2）加入3倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入果胶酶2.5g。
（3）HCl调pH5.6，温度50℃酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度76℃，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发,提取量为6.390mg/g。
（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到X-5大孔吸附树脂，调pH6.7，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例5
（1）取茶Camelliasinensis(L.)O.Kuntzes树叶渣500g，粉碎。
（2）加入3倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入纤维素酶1.5g。
（3）HCl调pH5.6，温度57℃酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度74℃，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发,提取量为6.777mg/g。
（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到D-101大孔吸附树脂，调pH7.8，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例6
（1）取茶叶Camelliasinensis(L.)O.Kuntze渣500g，粉碎。
（2）加入3倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入纤维素酶2.0g。
（3）HCl调pH5.6，温度55℃酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度78℃，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发,提取量为8.406mg/g。
（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到X-5大孔吸附树脂，调pH6.5，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例7
（1）取茶叶Camelliasinensis(L.)O.Kuntze渣500g，粉碎。
（2）加入3倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入纤维素酶2.5g。
（3）HCl调pH为5.6，温度为50℃酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度73℃，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发,提取量为9.821mg/g。
（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到D-101大孔吸附树脂，调pH7.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例8
（1）取茶叶Camelliasinensis(L.)O.Kuntze渣500g，粉碎。
（2）加入4倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入纤维素酶1.0g。
（3）HCl调pH5.6，温度50℃酶解2.5h，，而后煮沸3min，使酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度77℃，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发,提取量为9.056mg/g。
（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到AB-8大孔吸附树脂，调pH8.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的55%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例9
（1）取茶叶Camelliasinensis(L.)O.Kuntze渣500g，粉碎。
（2）加入4倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入纤维素酶3g、果胶酶1.5g、木聚糖酶10mg。
（3）HCl调pH6.0，温度为55℃酶解2h，而后煮沸2min，使酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度80℃，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发,提取量为14.210mg/g。
（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到X-5大孔吸附树脂，调pH7.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例10
（1）取茶叶Camelliasinensis(L.)O.Kuntze渣500g，粉碎。
（2）加入5倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入纤维素酶2g、果胶酶1.0g、木聚糖酶8mg。
（3）HCl调pH6.0，温度55℃酶解3h，而后煮沸2min，使酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度80℃，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发,提取量为11.527mg/g。
（（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到LX-60大孔吸附树脂，调pH7.5，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例11
（1）取茶叶Camelliasinensis(L.)O.Kuntze渣500g，粉碎。
（2）加入5倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入纤维素酶1.8g、果胶酶1.2g、木聚糖酶6mg。
（3）HCl调pH6.5，温度60℃，酶解4h，而后煮沸2min，酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度80℃，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发,提取量为10.454mg/g。
（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到X-5大孔吸附树脂，调pH7.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的65%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例12
（1）取茶叶Camelliasinensis(L.)O.Kuntze渣500g，粉碎。
（2）加入4倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入纤维素酶0.8g、果胶酶0.4g、木聚糖酶10mg。
（3）HCl调pH为5.5，温度为55℃酶解5h，而后煮沸3min，酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度70℃，每次1h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发,提取量为10.836mg/g。
（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到LX-60大孔吸附树脂，调Ph8.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例13
（1）取茶叶Camelliasinensis(L.)O.Kuntze渣500g，粉碎。
（2）加入3倍量的蒸馏水，浸泡1小时，加入纤维素酶2.5g，果胶酶1.0g。
（3）HCl调pH为5.6，温度为50℃酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
（4）加乙醇，使乙醇终浓度达5体积%，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积%的乙醇溶液浸提2次。提取条件为：温度73℃，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发,提取量为10.06mg/g。
（5）上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到D-101大孔吸附树脂，调pH7.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
（6）选用4倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
实施例14茶多酚的含量检测
（一）标准品的配制：茶多酚含量测定按GB/T8313—2002《茶：茶多酚的测定》进行。准确称取标准品茶多酚5mg，加蒸馏水定容至25ml，混匀，分别吸取茶多酚标准溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml于25ml容量瓶中，各加蒸馏水5ml，酒石酸亚铁溶液5ml，最后加入PH7.5的磷酸缓冲液至刻度，摇匀。利用空白的试剂作参照，用紫外分光光度计于539nm处测定吸光度。
（二）样品（洗脱液）测定：准确吸取浸提液（洗脱液）0.2mL，加水至5mL至25mL容量瓶，加酒石酸亚铁5mL，充分混合，加pH7.5磷酸盐缓冲液至刻度，用10mm比色杯，用紫外-可见分光光度计在波长539nm处，以试剂空白溶液做参比，测定吸光度，计算茶多酚提取率和含量。
各实施例茶多酚提取率和各洗脱液的含量
（三）结论：上述结果表明，利用纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶三种复合酶提取茶叶渣中茶多酚：五个因素影响产量的顺序分别为酶配比及含量＞酶解温度＞PH值＞酶解时间。最佳提取工艺条件是：以500g茶叶渣为例，最佳条件是维素酶：果胶酶：木聚糖酶=(0.8-3.0)g:(0.4-2.0)g：(0.4-0.8)mg，酶解温度为50～60℃，pH值5.0-6.5，酶解时间2-3小时。5-10％乙醇溶液提取1-3h，共3次。浓缩，回收溶剂。大孔吸附树脂pH5.0-8.0加样，加液量为柱体积1/3，先用水洗脱除杂，采用50-70%乙醇洗脱，用量为树脂体积的3-4倍，回收茶多酚。
通过使用本专利发明的复合酶处理，直接用5-10%的乙醇提取，利用大孔吸附树脂D-101、AB-8、X-5、LX-60、DM-130分离，50-70%洗脱即可将大部分的茶叶渣茶多酚富集，且纯度较高。

Claims (6)

1.一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法，其特征在于，该方法的步骤包括：
a、预处理：先将茶叶渣粉碎，将茶叶渣和水按重量比1：3-7混合，浸泡0.5-1小时；
b、复合酶解：向上述预处理液中，按茶叶渣重量的0.32%-1.16%加入复合酶，该复合酶为纤维素酶8-30重量份、果胶酶4-20重量份和木聚糖酶0.004-0.008重量份；用HCl调pH为5.0-6.5，温度为50℃-60℃时酶解2-4小时，而后煮沸2-4min，使酶失活；
c、乙醇浸取：使用5-10体积%乙醇对步骤b酶解后的混合物加热浸提，浸提温度75℃-80℃，将提取液离心，取上清液；
d、分离、提纯：将步骤c获得的上清液减压浓缩，得浸膏，加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏液缓慢滴加到大孔吸附树脂，用50-70体积%乙醇作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b中纤维素酶为60万U/g、果胶酶为80万U/g和木聚糖酶为4.2万U/g。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c的具体操作为：向步骤b酶解后的混合物中加入无水乙醇，使乙醇终浓度达5-10体积%，加热至75℃-80℃浸提1-2h；过滤后的茶渣再用5-10体积%的乙醇浸提2次，每次所加5%-10%的乙醇为茶渣干重的5～10倍，浸提温度75℃-80℃，每次浸提1-2h，合并3次提取液，将提取液离心，取上清液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d中大孔吸附树脂为D-101、AB-8、X-5、LX-60、DM-130中的一种或几种,大孔吸附树脂中pH5.0-8.0。
5.如权利要求1-4中任一项所述的的方法，其特征在于，所述步骤b中复合酶中纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶添加量为重量比1500：1000：8。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤c中5-10体积%乙醇的浸提条件为，浸提温度80℃，每次浸提2h。
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