CN104861013A - 一种从白柳皮提取水杨苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从白柳皮中提取水杨苷的方法，采用灭菌、浸润、酶解提取、分离、干燥的工艺，得到了富含水杨苷的产品。本发明创造性地采用了酶解前灭酶和食盐水浸泡的工艺，并通过系统筛选确定酶解反应的酶种类，并经过两次柱层析分离，微波干燥后，得到水杨苷含量超过95%的白柳皮提取物。整个方法无需使用生石灰，且所用材料均为常规材料，成本低且收率高、且溶剂可循环利用，能降低环境污染，易于产业化。
Description
技术领域
本发明涉及一种从白柳皮提取高纯度水杨苷的制备方法。
背景技术
白柳皮是杨柳科植物白柳Salix alba L.的树皮，使用历史悠久，主要用于消炎、镇痛、退烧。后经科学研究，白柳皮中所含水杨苷成分是其抗炎症和减轻疼痛能力的效果来源，因此，水杨苷进入了大家的视野范围。水杨苷，又称水杨甙，分子式为C13H18O7，分子量286.28，为白色结晶，可溶于水，易溶于沸水，难溶于乙醇，不溶于醚或氯仿，但能溶于碱溶液、吡啶或冰醋酸中，具有解热、镇痛、抗风湿、抗炎的作用。最新研究还发现，水杨苷作为一种氧化酶抑制剂，可以促进皮肤的新陈代谢、增加皮肤光泽度及弹性，减少色素沉淀，还有报道称，富含水杨苷的植物提取物具有减肥降脂的效果，因此，富含水杨苷的天然植物提取物可应用于药品、保健品、化妆品等领域，具有广阔的市场前景。
目前，水杨苷通常是从柳皮、柳枝中提取得到，现有的提取方法很多，一般需要将原料与生石灰搅拌后，再经溶剂提取，得到提取物。例如CN 102731587B公开了一种从白柳皮中提取水杨甙的方法，采取了白柳枝皮与生石灰混拌后，80-95%乙醇超声波萃取，提取液经减压浓缩后上大孔吸附树脂柱，再用60-80%乙醇解析，得到水杨甙解析液，经两次结晶后，得到纯度在95%以上的水杨甙成品。也有人提出，用生石灰混拌不利于生产操作，因而提出了不需生石灰的制备方法，如CN 102558254B公开了一种以柳皮或柳枝为原料提取高纯度水杨苷的方法，包括直接水或醇溶液提取，超滤，滤液经吸附树脂吸附分离，上多氨基弱碱性离子交换树脂脱色，再加入活性炭或壳聚糖脱色，过滤，降温冷却结晶，得到纯度为99%的水杨苷提取物。此外，还有人利用二氧化碳超临界萃取法（如CN 104231014A）、复合酶解法（如CN 102453061B）来提取水杨苷。但是，上述各种方法都存在各自的优缺点，生石灰法不利于生产车间内粉末控制但工艺简单性价比高，二氧化碳超临界萃取法提取效率高但成本过高，二次结晶法需要耗费大量溶剂但纯度有限等。
因此，本申请的发明人为了提出一种收率高、成本低、且溶剂可循环利用，降低环境污染，易于产业化的方法，进行了深入研究，进而获得本发明。
发明内容
为了实现上述目的，本发明提供了一种从白柳皮中提取水杨苷的方法，包括如下步骤：
（1）取原料，切成或粉碎成1-2cm小段，紫外线照射30-50分钟；
（2）向灭酶后的原料中加入5-10倍水，加入3-8重量%食盐，常温浸泡1-2小时，过滤，得浸润后的原料；
（3）向浸润后的原料中加入原料重量1.5-2倍的水，加入纤维素酶：碱性蛋白酶的复合酶（1:2），复合酶用量为原料的0.5-2重量%，在20-40℃下酶解1-3h，每隔15分钟超声处理酶解液15分钟，超声频率为40-80KHz，超声功率为200-300W，得酶解液；
（4）酶解液经浓缩后，通过聚酰胺层析柱，上样量与聚酰胺比为1∶5～1∶25，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，用乙醇水溶液梯度洗脱，收集40-70%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；
（5）水溶液浓缩后，通过中性氧化铝柱，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，分别用1-3倍柱体积水、1-2倍柱体积95％乙醇溶液洗脱除杂，用6-10倍柱体积的0.3-0.8%冰醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液，挥去冰醋酸后，微波真空干燥，得产品。
优选的，微波真空干燥温度：20-80℃，回差温度1-5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分钟。
优选的，微波真空干燥温度：40-60℃，回差温度2-4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分钟。
本发明通过对白柳皮的灭菌、浸润、酶解提取、分离、干燥的工艺，得到了富含水杨苷的产品：经过系统的筛选和优化，首先确定了酶解提取的步骤，由于酶解前要减少干扰，因此，在酶解前确定了预先杀灭材料自身所含酶以及经浸润步骤除去杂质和增大表面积的步骤，又由于酶解后白柳皮的大部分成分都被溶出，为了获得更高浓度的水杨苷，确定了聚酰胺柱和中性氧化铝柱的两次层析分离，并经微波干燥，得到了适应工业化生产的水杨苷最佳提取工艺。
与现有技术相比，本发明创造性地采用了酶解前灭酶和食盐水浸泡的工艺，并通过系统筛选确定酶解反应的酶种类，并经过两次柱层析分离，微波干燥后，得到水杨苷含量超过95%的白柳皮提取物。整个方法无需使用生石灰，且所用材料均为常规材料，成本低且收率高、且溶剂可循环利用，能降低环境污染，易于产业化。
本发明还提供了上述制备方法制得的白柳皮提取物。
以下将详细介绍本发明的研发过程。
一、酶解工艺的研究
实验材料：灭菌后的白柳皮粉末，纤维素酶、碱性蛋白酶、果胶酶、淀粉酶、脂肪酶、溶菌酶
实验方法：取灭菌后的白柳皮粉末，加入原料重量1.5-2倍的水，并加入1%的酶，超声处理。测定酶解后的上清液中水杨苷的含量，实验结果见表一。
表一 酶的筛选
| 酶种类 | 水杨苷（mg/100ml） |
| 纤维素酶 | 28.22 |
| 碱性蛋白酶 | 19.71 |
| 果胶酶 | 12.59 |
| 淀粉酶 | 25.27 |
| 脂肪酶 | 13.11 |
| 溶菌酶 | 10.89 |
| 纤维素酶：碱性蛋白酶（1:1） | 30.45 |
| 纤维素酶：碱性蛋白酶（1:2） | 39.25 |
| 纤维素酶：淀粉酶（1:1） | 27.54 |
| 纤维素酶：碱性蛋白酶：淀粉酶（1:1:1） | 28.82 |
| 纤维素酶：碱性蛋白酶：果胶酶：淀粉酶：溶菌酶（1:1:1:1:1） | 24.10 |
由此可见，纤维素酶与碱性蛋白酶的复合酶对水杨苷的溶出非常有利。
二、酶解前工艺的研究
实验材料：灭菌后的白柳皮粉末、食盐水、水、纤维素酶、碱性蛋白酶
实验方法：取灭菌后的白柳皮粉末，分别加入5-10倍水、食盐水浸润1.5小时后，进行酶解（纤维素酶：碱性蛋白酶（1:2）），测定酶解上清液中水杨苷的含量，实验结果见表二。
表二 酶解前工艺的筛选
| 工艺 | 水杨苷（mg/100ml） |
| 灭菌后直接酶解 | 38.91 |
| 水浸润后酶解 | 40.13 |
| 1%食盐水浸润后酶解 | 44.59 |
| 5%食盐水浸润后酶解 | 51.68 |
| 10%食盐水浸润后酶解 | 36.02 |
由此可见，经适量浓度的食盐水浸润后，可以极大提高水杨苷的溶出。发明人着重考察了配方中的粘合剂和填充剂。
三、聚酰胺柱层析纯化
实验方法：取酶解后的上清液，浓缩后，置预处理好的各型号树脂100g中，摇床动态吸附8小时后，装柱，依次用水洗洗脱3个柱体积、20％乙醇洗脱5个柱体积、60％乙醇洗脱5个柱体积，收集60％乙醇洗脱液进行水杨苷含量测定，部分洗脱液蒸干计算干膏量，结果见表三。
表三 树脂型号的确认
| 树脂型号 | 干膏量（g） | 水杨苷含量 |
| 聚酰胺 | 6.25 | 90.21 |
| D101 | 3.69 | 67.09 |
| D311 | 5.02 | 78.54 |
| AB-8 | 4.85 | 87.67 |
| LH-20 | 1.85 | 81.28 |
结果表明，以上树脂型号聚酰胺的效果最好。
四、干燥方法研究
实验方法：取两次柱层析后的洗脱液4份，分别采用真空干燥、冷冻真空干燥、喷雾干燥、微波真空干燥，得到产品，测定产品中的水杨苷含量，结果见表四。
表四 干燥方法研究结果
| 真空干燥 | 冷冻真空干燥 | 喷雾干燥 | 微波真空干燥 | |
| 水杨苷含量 | 96.92 | 98.58 | 95.41 | 99.01 |
| 水分 | 1.51 | 1.25 | 2.10 | 0.81 |
| 干燥时间 | 2h | 2h | 2h | 2h |
| 溶剂残留 | 无 | 无 | 1.5 | 无 |
结果表明：水杨苷用微波真空干燥工艺效果最好，处理量大，干燥温度低，时间段，所得产品指标良好。
具体实施例
实施例1：一种从白柳皮中提取水杨苷的方法，包括如下步骤：
（1）取原料，切成或粉碎成1-2cm小段，紫外线照射40分钟；
（2）向灭酶后的原料中加入8倍水，加入5重量%食盐，常温浸泡1.5小时，过滤，得浸润后的原料；
（3）向浸润后的原料中加入原料重量12倍的水，加入纤维素酶：碱性蛋白酶的复合酶（1:2），复合酶用量为原料的1重量%，在20-40℃下酶解3h，每隔15分钟超声处理酶解液15分钟，超声频率为60KHz，超声功率为250W，得酶解液；
（4）酶解液经浓缩后，通过聚酰胺层析柱，上样量与聚酰胺比为1∶5～1∶25，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，用乙醇水溶液梯度洗脱，收集40-70%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；
（5）水溶液浓缩后，通过中性氧化铝柱，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，分别用2倍柱体积水、2倍柱体积95％乙醇溶液洗脱除杂，用6倍柱体积的0.3-0.8%冰醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液，挥去冰醋酸后，微波真空干燥，微波真空干燥温度：60℃，回差温度2℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率60KW，干燥120分钟，得产品。经测定，该产品中水杨苷含量为99.03%。
实施例2：一种从白柳皮中提取水杨苷的方法，包括如下步骤：
（1）取原料，切成或粉碎成1-2cm小段，紫外线照射30分钟；
（2）向灭酶后的原料中加入5倍水，加入3重量%食盐，常温浸泡2小时，过滤，得浸润后的原料；
（3）向浸润后的原料中加入原料重量1.5倍的水，加入纤维素酶：碱性蛋白酶的复合酶（1:2），复合酶用量为原料的2重量%，在20-40℃下酶解2h，每隔15分钟超声处理酶解液15分钟，超声频率为40KHz，超声功率为250W，得酶解液；
（4）酶解液经浓缩后，通过聚酰胺层析柱，上样量与聚酰胺比为1∶5～1∶25，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，用乙醇水溶液梯度洗脱，收集40-70%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；
（5）水溶液浓缩后，通过中性氧化铝柱，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，分别用1倍柱体积水、2倍柱体积95％乙醇溶液洗脱除杂，用10倍柱体积的0.8%冰醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液，挥去冰醋酸后，微波真空干燥，微波真空干燥温度：80℃，回差温度1℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率80KW，干燥100分钟，得产品。经测定，该产品中水杨苷含量为98.52%。
实施例3：一种从白柳皮中提取水杨苷的方法，包括如下步骤：
（1）取原料，切成或粉碎成1-2cm小段，紫外线照射50分钟；
（2）向灭酶后的原料中加入10倍水，加入3重量%食盐，常温浸泡1.5小时，过滤，得浸润后的原料；
（3）向浸润后的原料中加入原料重量2倍的水，加入纤维素酶：碱性蛋白酶的复合酶（1:2），复合酶用量为原料的2重量%，在20-40℃下酶解1h，每隔15分钟超声处理酶解液15分钟，超声频率为80KHz，超声功率为250W，得酶解液；
（4）酶解液经浓缩后，通过聚酰胺层析柱，上样量与聚酰胺比为1∶5～1∶25，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，用乙醇水溶液梯度洗脱，收集40-70%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；
（5）水溶液浓缩后，通过中性氧化铝柱，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，分别用3倍柱体积水、1倍柱体积95％乙醇溶液洗脱除杂，用6倍柱体积的0.3-0.8%冰醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液，挥去冰醋酸后，微波真空干燥，微波真空干燥温度：40℃，回差温度5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率50KW，干燥200分钟，得产品。经测定，该产品中水杨苷含量为98.15%。
Claims (4)
1.一种从白柳皮中提取水杨苷的方法，包括如下步骤：
（1）取原料，切成或粉碎成1-2cm小段，紫外线照射30-50分钟；
（2）向灭酶后的原料中加入5-10倍水，加入3-8重量%食盐，常温浸泡1-2小时，过滤，得浸润后的原料；
（3）向浸润后的原料中加入原料重量1.5-2倍的水，加入纤维素酶：碱性蛋白酶的复合酶（1:2），复合酶用量为原料的0.5-2重量%，在20-40℃下酶解1-3h，每隔15分钟超声处理酶解液15分钟，超声频率为40-80KHz，超声功率为200-300W，得酶解液；
（4）酶解液经浓缩后，通过聚酰胺层析柱，上样量与聚酰胺比为1∶5～1∶25，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，用乙醇水溶液梯度洗脱，收集40-70%乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；
（5）水溶液浓缩后，通过中性氧化铝柱，树脂柱径高比为1∶4～1∶15，分别用1-3倍柱体积水、1-2倍柱体积95％乙醇溶液洗脱除杂，用6-10倍柱体积的0.3-0.8%冰醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液，挥去冰醋酸后，微波真空干燥，得产品。
2.优选的，微波真空干燥温度：20-80℃，回差温度1-5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分钟。
3.优选的，微波真空干燥温度：40-60℃，回差温度2-4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分钟。
4.上述方法制得的富含水杨苷的提取物。
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