CN104031159B - 采用732阳离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用732阳离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，包括如下步骤：A．原料的脱脂预处理；B．热水浸提制备粗多糖；C．粗多糖酶解；D．大孔吸附树脂732阳离子树脂处理；E．超滤去除小分子；F．真空冷冻干燥；制备桦褐孔菌多糖。使用该工艺最终得到脱色的并去除大部分蛋白和小分子杂质的桦褐孔菌精制多糖，适合产业化规模化生产桦褐孔菌精制多糖。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种采用732阳离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法。
背景技术
桦褐孔菌[Inonotusobliquus(Fr.)Pilat]是一著名的民间野生药用真菌。研究表明，桦褐孔菌多糖是重要的活性成分之一，具有增强免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖及抗病毒等多种药理活性，已成为国内外研究的热点领域之一。但目前对桦褐孔菌多糖的分离纯化的研究报道相对较少。
由于多糖的组成复杂性，多糖粗提物的分子量分布较广，多糖种类也很多，而且前期实验表明，提取后的桦褐孔菌粗多糖中含有一定量的蛋白、色素和小分子物质，影响多糖的生物活性的发挥和化学结构的进一步研究，因此有必要对粗多糖进一步分离纯化，但去除粗多糖中的蛋白和色素等杂质，一直是多糖分离纯化中的一大难题，传统的去蛋白以Sevage法为主，方法操作繁琐，效率低，采用的有机溶剂有毒性因而影响多糖的生物活性；活性炭法去除色素效果较好，但后期的活性炭粉末不易去除，过氧化氢法因为较强的抗氧化活性去除色素效果很好，但对多糖的活性影响较大，因此急需探索一种新的精制方法。
大孔树脂具有大孔立体三维网状结构和较大的比表面积，因此具有良好的交换吸附活性，近年来广泛用于天然产物的活性成分的精制，有些大孔树脂已经用以去除植物和真菌多糖中的蛋白和色素，并取得了很好的效果。采用大孔树脂去除桦褐孔菌粗多糖中色素和蛋白的研究尚未见有文献报道。
申请公布号CN102603906A（申请号201110461635.8）的中国专利文献公开了一种桦褐孔菌多糖水溶液的制备方法：一种桦褐孔菌多糖水溶液的制备方法，包括以下步骤：三氯乙酸脱蛋白：向桦褐孔菌提取物中加入三氯乙酸，静置，然后固液分离，取分离得到的固体物质；活性炭脱色：向步骤：所得固体物质按体积加入50～100倍的水，然后加入活性炭脱色，然后固液分离，取所得上清液；用天然澄清剂澄清：所得上清液加入天然澄清剂澄清。
发明内容
本发明的目是提供一种精制桦褐孔菌粗多糖的工艺，本发明的核心技术是：应用生物酶和阴离子交换吸附树脂替代传统的Sevage法、活性炭法和过氧化氢法去除蛋白和色素，克服了现有技术的缺陷，提供了一种新型的适合规模化制备桦褐孔菌精制多糖的方法。
本发明的技术方案如下：
采用732阳离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，其包括如下步骤：A．原料的脱脂预处理；B．热水浸提制备粗多糖；C．粗多糖酶解；D．大孔树脂732阳离子树脂处理；E．超滤去除小分子；F.真空冷冻干燥；制备得到桦褐孔菌精制多糖。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤A．原料的脱脂预处理是指，取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于4-8倍体积的60-95%乙醇溶液中浸泡16-24h（优选的，置于6-7倍体积的70-90%乙醇溶液中浸泡18-20h，更加优选的，置于6.5倍体积的80%乙醇溶液中浸泡20h），以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤B．热水浸提制备粗多糖是指，预处理后的残渣风干后，加10-20倍蒸馏水（v/w），沸水提取1-3h，80-120目纱布过滤（优选的，加13-18倍蒸馏水（v/w），沸水提取1.5-2.5h，85-100目纱布过滤，更加优选的，加15倍蒸馏水（v/w），沸水提取2h，100目纱布过滤），滤渣重复提取1-3次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤C．粗多糖酶解是指，将粗多糖加水溶解，加入木瓜蛋白酶，35-45℃反应20-40min（优选的，36-42℃反应25-35min，更加优选的，40℃反应30min），得粗多糖的酶解液。更加优选的，粗多糖加水溶解后配制为0.5-2.0%（w/w）的水溶液（优选的，配制为0.6-1.8%（w/w）的水溶液，更加优选的，配制为1.5%（w/w）的水溶液）。更加优选的，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3-5%（w/w）（优选的，加入量为粗多糖水溶液的3.5-4.5%（w/w），更加优选的，加入量为粗多糖水溶液的4.0%（w/w））。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤D.大孔吸附树脂732阳离子树脂处理是指，粗多糖的酶解液加入经预处理的732阳离子树脂树脂层析柱中，按照732阳离子树脂树脂︰粗多糖酶解液=1.2-2.0︰1(w/v)，流速控制在1-3ml/min（优选的，按照732阳离子树脂树脂︰粗多糖酶解液=1.5-1.8︰1(w/v)，流速控制在1.5-2ml/min，更加优选的，按照732阳离子树脂树脂︰粗多糖酶解液=1.6︰1(w/v)，流速控制在1.8ml/min），收集流出液。更加优选的，所述的预处理是指，大孔吸附树脂732阳离子树脂先用水浸泡24h，用水洗至水液澄清，倾去水后加1MHC1溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤E．超滤去除小分子是指，采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤F.真空冷冻干燥是指，先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3h，然后转入-80℃下冷冻6h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
本发明公开了一种桦褐孔菌精制多糖及其制备工艺，制备工艺如下：1、原料的预处理；2、桦褐孔菌粗多糖的溶出；3、蛋白酶水解；4、阴离子树脂处理；5、超滤，然后干燥。使用该工艺最终得到脱色的并去除大部分蛋白和小分子杂质的桦褐孔菌精制多糖，获得较高的多糖保留率、脱色率、蛋白脱除率和得率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案详加描述，但保护范围不被此限制。实施例中所用的材料皆可从市场购买。
实施例1采用732阳离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，包括如下步骤：
A．原料的脱脂预处理：取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于4倍体积的60%乙醇溶液中浸泡16h，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
B．热水浸提制备粗多糖：预处理后的残渣风干后，加10倍蒸馏水（v/w），沸水提取1h，80目纱布过滤，滤液浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
C．粗多糖酶解：将粗多糖加水溶解，配制为0.5%（w/w）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3%（w/w），35℃反应20min，得粗多糖的酶解液。
D．大孔树脂732阳离子树脂处理：粗多糖的酶解液加入经预处理(大孔吸附树脂732阳离子树脂先用水浸泡24h，用水洗至水液澄清，倾去水后加1MHC1溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性)的732阳离子树脂树脂层析柱中，按照732阳离子树脂树脂︰粗多糖酶解液=1.2︰1（w/v），流速控制在1ml/min，收集流出液。
E．超滤去除小分子：采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质，得桦褐孔菌多糖样品。
F．真空冷冻干燥:先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3h，然后转入-80℃下冷冻6h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
实施例2采用732阳离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，包括如下步骤：
A．原料的脱脂预处理：取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于8倍体积的95%乙醇溶液中浸泡24h，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
B．热水浸提制备粗多糖：预处理后的残渣风干后，加20倍蒸馏水（v/w），沸水提取3h，120目纱布过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
C．粗多糖酶解：将粗多糖加水溶解，配制为2.0%（w/w）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的5%（w/w），45℃反应40min，得粗多糖的酶解液。
D．大孔树脂732阳离子树脂处理：
大孔吸附树脂732阳离子树脂预处理，先用水浸泡24h，用水洗至水液澄清，倾去水后加1MHC1溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性。
粗多糖的酶解液加入经预处理的732阳离子树脂树脂层析柱中，按照732阳离子树脂树脂︰粗多糖酶解液=2.0︰1(w/v)，流速控制在3ml/min，收集流出液。
E．超滤去除小分子：采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。
F．真空冷冻干燥：先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3h，然后转入-80℃下冷冻6h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
实施例3采用732阳离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，其包括如下步骤：
A．原料的脱脂预处理：取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于7倍体积的90%乙醇溶液中浸泡20h，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
B．热水浸提制备粗多糖：预处理后的残渣风干后，加18倍蒸馏水（v/w），沸水提取2.5h，100目纱布过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
C．粗多糖酶解：将粗多糖加水溶解，配制为1.8%（w/w）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的4.5%（w/w），42℃反应35min，得粗多糖的酶解液。
D．大孔树脂732阳离子树脂处理：粗多糖的酶解液加入经预处理（预处理方式与是实施例1-3相同）的732阳离子树脂树脂层析柱中，按照732阳离子树脂树脂︰粗多糖酶解液=1.8︰1(w/v)，流速控制在2ml/min，收集流出液。
E．超滤去除小分子：采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。
F.真空冷冻干燥：先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3h，然后转入-80℃下冷冻6h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
实施例4采用732阳离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，包括如下步骤：
A．原料的脱脂预处理：取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于6倍体积的70%乙醇溶液中浸泡18h，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
B．热水浸提制备粗多糖：预处理后的残渣风干后，加13倍蒸馏水（v/w），沸水提取1.5h，85目纱布过滤，提取1次，滤液浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
C．粗多糖酶解：将粗多糖加水溶解，配制为0.5%（w/w）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3.5%（w/w），36℃反应25min，得粗多糖的酶解液。
D．大孔树脂732阳离子树脂处理：粗多糖的酶解液加入经预处理（大孔吸附树脂732阳离子树脂先用水浸泡24h，用水洗至水液澄清，倾去水后加1MHC1溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性）的732阳离子树脂树脂层析柱中，按照732阳离子树脂树脂︰粗多糖酶解液=1.5︰1（w/v），流速控制在1.5ml/min，收集流出液。
E．超滤去除小分子：采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。
F．真空冷冻干燥：先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3h，然后转入-80℃下冷冻6h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
实施例5采用732阳离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，其包括如下步骤：
A．原料的脱脂预处理:取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于6.5倍体积的80%乙醇（质量浓度）溶液中浸泡20h，以除去脂肪、部分寡糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
B．热水浸提制备粗多糖：预处理后的残渣风干后，加15倍蒸馏水（v/w），沸水提取2h，100目纱布过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
C．粗多糖酶解：将粗多糖加水溶解，配制为1.5%（w/w）的水溶液,加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的4.0%(w/w),40℃反应30min，得粗多糖的酶解液。
D．大孔树脂732阳离子树脂处理：粗多糖的酶解液加入经预处理（所述的预处理是指，大孔吸附树脂732阳离子树脂先用水浸泡24h，用水洗至水液澄清，倾去水后加1MHC1溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性）的732阳离子树脂树脂层析柱中，按照732阳离子树脂树脂︰粗多糖酶解液=1.6︰1(w/v)，流速控制在1.8ml/min，收集流出液。
E．超滤去除小分子：采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。
F．真空冷冻干燥：先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3h，然后转入-80℃下冷冻6h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
试验例实施例5所得桦褐孔菌多糖多糖含量和蛋白含量的测定，以及蛋白脱除率、色素脱除率和多糖保留率的计算。其中多糖含量(%)=总糖的含量(%)-还原糖的含量(%)。
总糖含量测定采用苯酚-硫酸法；还原糖含量测定采用DNS法；蛋白含量测定采用Bradford法。
式中：A0、A1分别为脱色前和脱色后溶液在波长450nm处的吸光度。
式中：C0、C1分别为脱色前和脱色后溶液在波长450nm处的吸光度。
式中：M0、M1分别为处理前后的多糖含量。
本发明与Sevage法、活性炭法和过氧化氢法精制桦褐孔菌粗多糖的结果比较，由此可以看出，大孔树脂732阳离子树脂，兼具去除蛋白和色素的能力。见下表：
本发明采用732阳离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，不仅可以去除蛋白，还兼具去除色素的能力，因此制备的多糖纯度较高，与处理之前的粗多糖相比较，色素脱除率为89.6%、蛋白脱除率为78.9%，多糖保留率70.2%。
最后应说明的是，实施例只是本发明最优的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.采用732阳离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，其特征是，包括如下步骤：
A．原料的脱脂预处理：取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于4-8倍体积的60-95%乙醇溶液中浸泡16-24h，以除去脂肪、部分单糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干；
B．热水浸提制备粗多糖：预处理后的残渣风干后，加10-20倍蒸馏水（v/w），沸水提取1-3h，80-120目纱布过滤，滤渣重复提取1-3次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖；
C．粗多糖酶解：粗多糖加水溶解后配制为0.5-2.0%（w/w）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3-5%（w/w），35-45℃反应20-40min，得粗多糖的酶解液；
D．大孔吸附树脂732阳离子树脂处理：粗多糖的酶解液加入经预处理的732阳离子树脂层析柱中，按照732阳离子树脂︰粗多糖酶解液=1.2-2.0︰1（w/v），流速控制在1-3ml/min，收集流出液；所述的预处理是指，大孔吸附树脂732阳离子树脂先用水浸泡24h，用水洗至水液澄清，倾去水后加1MHC1溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性；
E．超滤去除小分子：采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质，得桦褐孔菌多糖样品；
F．真空冷冻干燥；制备桦褐孔菌多糖：所述真空冷冻干燥是指，先将桦褐孔菌多糖样品放置于-20℃下3h，然后转入-80℃下冷冻6h以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤A：置于6-7倍体积的70-90%乙醇溶液中浸泡18-20h，以除去脂肪、部分单糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，步骤A：置于6.5倍体积的80%乙醇溶液中浸泡20h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤B：加13-18倍蒸馏水（v/w），沸水提取1.5-2.5h，85-100目纱布过滤，滤渣重复提取1-3次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，步骤B：加15倍蒸馏水（v/w），沸水提取2h，100目纱布过滤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤C：36-42℃反应25-35min，得粗多糖的酶解液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤C：粗多糖加水溶解后配制为0.6-1.8%（w/w）的水溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是，步骤C：粗多糖加水溶解后配制为1.5%（w/w）的水溶液。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征是，步骤C：木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3.5-4.5%（w/w）。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征是，步骤C：木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的4.0%（w/w）。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤D：按照732阳离子树脂︰粗多糖酶解液=1.5-1.8︰1（w/v），流速控制在1.5-2ml/min，收集流出液。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征是，步骤D：按照732阳离子树脂︰粗多糖酶解液=1.6︰1（w/v），流速控制在1.8ml/min。
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