CN101084967A - 红花黄酮类成分的提取纯化工艺 - Google Patents

Abstract

一种红花黄酮类成分的提取纯化工艺，其提取步骤为：1)取红花，以60％乙醇为溶剂，浸泡12小时，以药材质量20～30倍量的50～70％乙醇进行渗漉，收集渗漉液，减压回收乙醇至无醇味，得浓缩液；2)将步骤1)得到的红花药材提取液浓缩到每毫升含生药0.5克，过滤，滤液澄清后上清液应用D－101大孔树脂柱进行纯化，乙醇洗脱；3)收集步骤2)的乙醇洗脱液，减压浓缩到密度为1.05～1.10克/毫升，喷雾干燥，得提取物产品。本发明的红花药材提取物产品中总黄酮质量含量为38.5％，其红花总黄酮转移率达77.9％。与现有技术相比，本发明具有活性成分损失减少，有效成分转移率高，所用原材料价格较低，而且安全性较高。

Description

红花黄酮类成分的提取纯化工艺

技术领域

本发明涉及一种中药的提取方法，具体涉及红花的提取方法及其提取物。

背景技术

红花为菊科(Compositae)植物Carthamus tinctorius L.的干燥管状花。红花味辛、微苦、性温、归心、肝经，为活血通经、去淤止痛之良药，临床常用于高血压、冠心病及高脂血症等疾病的治疗。红花的化学成分比较复杂，因此自本世纪初就开始有科学家对其化学成分进行研究，先后分得黄酮、脂肪油、聚乙炔、5-羟色胺、甾族、木脂素、烷基二醇和甾醇等类化合物。据文献报道，黄酮类成分为其主要活性部位，有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、抗氧化等作用。

红花总黄酮主要成分为红花黄色素(safflor yellow，SY)，为查尔酮类结构，是多种水溶性成分的混合物。主要包括红花黄色素A(SY-A)、红花黄色素B(SY-B)、SY-C、羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)等，其中HSYA为红花黄色素中含量较高的成分。

药理研究表明红花总黄酮具有扩张冠状动脉、改善心肌缺血、降低血压、抗脑缺血、保护神经细胞及抑制血小板活化、缓解了血栓形成、减轻血液循环障碍等作用。因此，红花总黄酮的研究开发具有重要的经济效益和社会效益。

红花总黄酮提取方法有超声提取法、水温浸提取法等。超声提取法设备投资大，不适合大生产；水温浸提取法得到的提取液进行浓缩时需要较高的温度和时间，易造成黄酮成分的损失。本研究采用60％乙醇为溶剂进行渗漉提取，可减少黄酮成分的损失。采用正交设计试验法，对红花总黄酮的渗漉提取工艺及D-101大孔树脂纯化红花总黄酮纯化工艺进行全面系统研究。具有较强的实用价值。

当前，单味中药提取物作为一种新兴的产品正日渐受到重视，它以现代提取分离技术为依托，用规范的制备工艺生产的质量可控而稳定的提取物及其制剂；采用《中药材生产质量管理规范》(GAP)要求规范化种植采收和加工的质量可控的中药材为原料，用现代化的提取技术、再按《药品生产质量管理规范》(GMP)管理模式在完善质量监控系统下进行生产出的具有可控的质量标准的提取物产品。体现了中药产业的技术进步和中药现代化的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种红花的有效部位的提取、纯化和提取物的干燥方法。

本发明的又一目的在于提供了采用上述方法获得的红花提取物。

本发明一种红花药材提取方法由一下步骤组成：

红花乙醇渗漉提取，提取液浓缩后加水沉淀，过大孔树脂柱，先用水洗再用乙醇洗脱，浓缩乙醇洗脱液，喷雾干燥。

红花药材提取物的具体提取方法步骤为：

1)、取红花，以乙醇为溶剂，浸泡12小时，以药材质量20～30倍量的50～70％乙醇进行渗漉，流速为0.5毫升/分钟，收集渗漉液，减压回收乙醇，得提取液；

2)、将步骤1)得到的红花药材提取液浓缩到每毫升含生药0.5克，过滤，滤液应用D-101大孔树脂柱进行纯化，工艺条件为：吸附液流速为1～3倍柱体积/小时，吸附液量为1～2倍柱体积(1～2BV)，水洗速率为2倍柱体积/小时，水洗体积为3～4倍柱体积，洗脱用乙醇的浓度为30-70％，乙醇洗脱流速为2倍柱体积/小时，乙醇洗脱量为4～5倍柱体积；

3)、收集步骤2)的乙醇洗脱液，减压浓缩到密度为1.05～1.10克/毫升，喷雾干燥，得提取物产品，提取物中总黄酮质量含量为38.5％。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置干燥处保存。

上述提取方法步骤1)中优化条件以60％乙醇为溶剂，浸泡12小时后，以药材质量25倍量的60％乙醇进行渗漉。

步骤2)中滤液应用D-101大孔树脂柱进行纯化工艺的优化条件为：吸附液流速为1倍柱体积/小时，吸附液量为1～2倍柱体积，水洗流速为2倍柱体积/小时，水洗体积为3～4倍柱体积，乙醇洗脱浓度为70％，乙醇洗脱流速为2倍柱体积/小时，乙醇洗脱量为4～5倍柱体积。

步骤3)中喷雾干燥的干燥器的进风口温度为170℃，出风口温度为80℃，雾化盘转速为20000转/分钟。

本发明的红花药材提取物产品中总黄酮质量含量为38.5％，其红花总黄酮转移率达77.9％。

本发明中所述乙醇浓度％是指100体积乙醇水溶液中含乙醇体积分数。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、有效成分转移率高。红花黄色素对热不稳定，本发明采用合适浓度的乙醇渗漉提取，减少黄酮成分的损失，提高了转移率。同时，本方法中将乙醇提取液浓缩到无醇味后，加蒸馏水溶解，过滤，滤液澄清，上清液过大孔树脂柱进行分离纯化。这样处理既保证有效成分的全部转移，上清液还有利于有效成分的吸附，而且可以有效地防止树脂柱的堵塞。保证大生产工艺的畅通性。

2、采用喷雾干燥可以明显缩短活性成分的受热时间，减少成分损失。

3、本工艺采用D101大孔树脂进行分离纯化。该树脂价格较低，而且安全性较高，是目前国内药品行业使用最多的一种大孔树脂。

附图说明

图1工艺过程流程图

图2红花药材提取液上大孔树脂柱吸附的泄漏曲线

图3以70％的乙醇作为洗脱剂洗脱红花总黄酮吸附柱的洗脱曲线

图1工艺过程说明：

红花用60％乙醇渗漉，渗漉液减压浓缩，回收乙醇至无醇味，浓缩液加水稀释，红花药材提取液药液上大孔树脂纯化，水洗去糖等杂质，70％乙醇洗脱，洗脱物浓缩喷雾干燥，收集喷雾干燥粉末保存，得产品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方法作进一步的说明。

实施例1红花总黄酮的提取工艺实验

(1)使用乙醇渗漉提取法进行实验，采用L₉(3⁴)正交实验法对乙醇浓度、乙醇用量(药材质量倍数)、流速、浸泡时间等条件进行了比较试验，采用高效液相色谱法测定提取物中羟基红花黄色素A的含量，采用分光光度法测定提取物中红花黄色素的含量，并以此为指标进行比较分析。结果见表1，表2，表3，表4。

表1  乙醇渗漉工艺因素水平表

水平	乙醇浓度(％)A	乙醇用量(倍数)B	流速(毫升/分钟)C	浸泡时间(小时)D
					123	506070	202530	0.51.01.5	122436

表2  渗漉正交试验设计及结果分析

实验号	因素				红花黄色素含量(毫克/毫升)	羟基红花黄色素A(毫克/毫升)	干膏收率(克/10克)
								A	B	C	D
	123456789	111222333	123123123	123231312								123312231	24.1723.7119.8722.5621.6425.6117.6322.6519.14	7.086.886.657.096.937.416.097.006.71	3.113.203.353.543.383.493.613.473.69
K1K2K3R					67.7569.8159.4210.39	64.3668.0064.623.64	72.4365.4159.1413.29	64.9566.9565.082.00	总黄酮含量分析

K1K2K3R

20.6121.4319.801.63

20.2620.8120.770.55

21.4920.6819.671.82

20.7220.3820.740.36

羟基红花黄色素A含量分析

表3  方差分析(SY)

因素	离差平方和	自由度	均方	F值	P
						ABCD	20.182.7529.470.83	2222	10.091.3714.730.42	24.173.2935.301.00	＜0.05＞0.05＜0.05＞0.05

表4  方差分析(HYSA)

因素	离差平方和	自由度	均方	F值	P
						ABCD	0.440.060.550.02	2222	0.220.030.280.01	16.232.3020.311.00	＞0.05＞0.05＜0.05＞0.05

注：查F值表F_0.05(2，2)＝19，F_0.01(2，2)＝99，取方差最小的D列作为误差项计算F值。

上述正交试验结果的直观分析和方差分析表明A₂B₂C₁D₂为最佳提取条件，考虑到D因素没有显著差异，并根据实际生产需要，选用D₁，即A₂B₂C₁D₁为优选的提取条件，且各因素对实验结果的影响次序为渗漉速度(C)＞乙醇浓度(A)＞乙醇用量(B)＞浸渍时间(D)。故确定红花黄酮类成分的渗漉提取工艺为：60％的乙醇浸渍12小时，以25倍量(质量)进行渗漉，渗漉速度为0.5毫升/分钟。

(2)验证试验：按最佳工艺条件进行验证试验，试验结果见表5。

表5  验证试验结果表

试验号	红花黄色素(毫克/毫升)	羟基红花黄色素A(毫克/毫升)	干膏收率(克/10克生药)
				12	24.7325.17	6.977.15	3.493.44

3RSD(％)

25.541.61

7.211.76

3.531.93

实施例2红花总黄酮的大孔树脂纯化工艺实验

用前述优选提取条件提取得到的红花提取液进行如下实验：

(1)大孔树脂的筛选实验

树脂的筛选结果见表5，表6。

表5  六种大孔树脂对红花提取液样品中SY的静态吸附和解吸附结果表

树脂种类	吸附量(毫克/克)	解吸附量(毫克)	解吸附率(％)
				D101(国产)AB-8(国产)SP825(进口)HP20(进口)SP70(进口)D4020(国产)	23.5228.5935.9429.0237.4720.33	21.0821.3932.8121.1732.4618.76	90.8675.5091.2972.9486.6392.28

D101树脂(天津市海光化工有限公司)，AB-8、D4020树脂(南开大学化工厂)，SP825、HP20、SP70(日本三菱公司)。

D101、AB-8、D4020为国产树脂，SP825、HP20、SP70为进口树脂。从表5可知国外树脂略优于国产树脂，但综合考虑经济、适用性等因素，拟选用国产树脂。

表6  三种大孔树脂动态筛选结果表

树脂种类	比上柱量(毫克/克)	比吸附量(毫克/克)	比洗脱量(毫克/克)
				D-101AB-8D-4020	44.4843.4741.21	25.7926.5224.44	23.5123.2014.81

注：比上柱量＝(M_上-M_残)/M，比吸附量＝(M_上-M_残-M_水洗)/M，比洗脱量＝M_醇洗/M，M为上柱树脂质量，M_上为上样液中SY的质量，M_残为上柱后流出液中SY的质量，M_醇洗为水洗脱下来SY的质量。

从表6中可以看出D-101和AB-8吸附性能接近，而D-4020树脂的比洗脱较小，由于D-101树脂应用较广，安全性更高，所以最终选用D-101树脂。

(2)D-101树脂纯化工艺实验

①吸附条件优选实验

采用正交试验方法以上样流速、药液的浓度(以样品中所含有的原药材量计)、径高比及上样药液的pH值作为考察因数，应用L₉(3⁴)正交表安排试验，因素及水平安排见表7。对以上9组试验分别测定总黄酮含量，并进行评价。分析结果见表8，表9。

表7  正交实验因素水平表

水平	A药液浓度(克生药/毫升)	B流速(倍柱体积/小时)	C径高比(φ∶L)	DpH
					123	0.10.30.5	123	1∶41：81∶12	345

表8  正交实验结果

试验号	因素				SY吸附量(毫克/克)
						A	B	C	D
	123456789	111222333	123123123	123231312						123312231	15.8517.5712.6722.4716.7611.5321.8114.5315.65
K1K2K3R					46.0950.7651.995.90	60.1348.8639.8520.28	41.9155.6951.2413.78	48.2650.9149.672.65

表9  方差分析

因素	离差平方和	自由度	均方	F	P
						ABCD	6.4668.8332.971.17	2222	3.2334.4116.490.59	5.5158.7328.131.00	＜0.05＞0.05＞0.05＜0.05

注：查F值表F_0.05(2，2)＝19，F_0.01(2，2)＝99，取方差最小的D列作为误差项计算F值。

结果表明，最佳吸附条件为A₃B₁C₂D₂，即当流速为1倍柱体积/小时，药液浓度为0.5克/毫升，径高比为1∶8，pH为4时树脂吸附量最大；药液浓度和pH值对吸附结果没有显著影响，而红花上柱药液的PH＝3.68，因此，结合实际生产需要，最终选定吸附条件为药液浓度为0.5克/毫升，流速为1倍柱体积/小时，径高比为1∶8，原药液上样进行吸附。

②泄漏曲线考察

在优选的吸附条件下进行吸附量的考察。即以0.5克/毫升的浓度，以1倍柱体积/分钟的流速上样，然后每5毫升为一个流分，连续接取。对流分进行紫外检测和液相检测，以药液体积为横坐标，以每份药液的浓度为纵坐标绘制泄漏曲线，结果见图2。

根据泄漏曲线可知上约液到20毫升时，上样液开始泄露；上样药液到100毫升时树脂达到饱和。最终确定上样量为1∶0.5大孔树脂/生药)。

③洗脱剂的考察

按上述所确定的吸附条件，取上样液分别通过4根D-101树脂柱，进行动态吸附，分别用30％、50％、70％、90％的乙醇进行洗脱，一直洗脱至洗脱液加2％FeCl₃乙醇液反应呈阴性为止。收集洗脱液，分别蒸干、称重，测定SY含量，计算总黄酮解吸率及回收率。

结果见表10。

表10  洗脱剂考察结果

乙醇浓度(％)	解吸率(％)	SY转移率(％)	醇洗物SY含量(％)
				30507090	50.2768.4691.8492.03	56.9162.2489.3088.34	39.4639.2838.7935.81

综合考察解吸率、总黄酮回收率以及醇洗物总黄酮含量，以70％的乙醇作为洗脱剂较为合适。

④洗脱速率考察

洗脱流速考察

D101树脂按上述所确定的吸附条件吸附饱和后，用70％乙醇分别以1、2、3、4倍柱体积/小时(BV/h)的流速进行洗脱，结果见表11。

表11  洗脱流速考察结果

洗脱流速(倍柱体积/小时)

解吸率(％)

SY转移率(％)

醇洗物SY含量(％)

1234

97.4794.0585.5878.84

92.8291.2772.6168.59

38.638.136.535.4

由表11可知，洗脱流速在1～2倍柱体积/小时时有较好的洗脱效果，为提高生产效率，确定洗脱流速为2倍柱体积/小时。

⑤洗脱曲线考察

将红花上样液按照上述所确定的吸附和洗脱条件，进行上柱、吸附和洗脱，分段收集洗脱液，测定每份洗脱液总黄酮浓度，绘制解吸曲线，见图3。

由洗脱曲线可知用5倍于湿树脂重量的乙醇量即可将SY解吸下来。

实施例3中试放大实验

取红花15千克，以60％乙醇为溶剂，浸泡12小时后以药材质量25倍量的60％乙醇进行渗漉，流速1倍柱体积/小时，收集渗漉液，减压回收乙醇至无醇味，得上样液。

将20千克药用级D101型大孔树脂用适量乙醇浸泡，湿法上柱，并用大量乙醇在柱上流动冲洗，不时检测流出的乙醇，至与水混合不呈白色浑浊为止(取1毫升乙醇加5毫升水)。然后用大量的蒸馏水洗去乙醇，备用。

以1倍柱体积/小时的上样流速进行吸附，树脂床φ∶L为1∶8(径高比为1∶8)，按此条件，进行吸附，吸附完毕后，用蒸馏水以2倍柱体积/小时的流速洗脱至α-萘酚反应(molish反应)为阴性，然后以4倍量树脂柱体积的70％乙醇，以2倍柱体积/小时的流速进行洗脱，收集洗脱液。

浓缩洗脱液到密度为1.05，，喷雾干燥(进风口温度为170℃，出风口温度为80℃，雾化盘转速为20000转/分钟)。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置干燥处保存。

采用紫外-可见分光光度法测量提取物中总黄酮的含量，计算转移率(转移率＝提取物中总黄酮的含量/原药材中总黄酮的含量×100％)和收膏率(收膏率＝提取物总重量/原药材总重量×100％)。

实验结果见表12。

表12  中试实验结果

试验批次	投药量(千克)	收膏率(％)	转移率(％)	提取物总黄酮含量(％)
					060810060822060903平均值	15.015.015.015.0	10.210.310.110.2	76.778.178.877.9	38.637.739.138.5

三批中试放大研究结果表明：其红花总黄酮转移率达77.9％，提取物中总黄酮质量含量为38.5％。表明本研究的工艺参数可行，工艺条件稳定，可望过渡到产业化生产。

Claims (5)

1、一种红花药材提取物，其特征是，所述提取物中总黄酮质量含量为38.5％。

2、权利要求1所述的红花药材提取物的提取方法，其特征是：提取步骤为：

1)、取红花，以乙醇为溶剂，浸泡12小时，以药材质量20～30倍量的50～70％乙醇进行渗漉，流速为0.5毫升/分钟，收集渗漉液，减压回收乙醇，得提取液；

2)、将步骤1)得到的红花药材提取液浓缩到每毫升含生药0.5克，过滤，滤液应用D-101大孔树脂柱进行纯化，工艺条件为：吸附液流速为1-3倍柱体积/小时，吸附液量为1～2倍柱体积，水洗速率为2倍柱体积/小时，水洗体积为3～4倍柱体积，洗脱用乙醇的浓度为30-70％，乙醇洗脱流速为2倍柱体积/小时，乙醇洗脱量为4～5倍柱体积；

3)、收集步骤2)的乙醇洗脱液，减压浓缩到密度为1.05～1.10克/毫升，喷雾干燥，得提取物产品，提取物中总黄酮质量含量为38.5％。

3、如权利要求2所述的红花药材提取物的提取方法，其特征是；所述步骤1)中以60％乙醇为溶剂，浸泡12小时后，以药材质量25倍量的60％乙醇进行渗漉。

4、如权利要求2所述的红花药材提取物的提取方法，其特征是所述步骤2)中滤液应用D-101大孔树脂柱进行纯化的工艺条件为：吸附液流速为1倍柱体积/小时，吸附液量为1～2倍柱体积，水洗流速为2倍柱体积/小时，水洗体积为3～4倍柱体积，洗脱用乙醇的浓度为70％，乙醇洗脱流速为2倍柱体积/小时，乙醇洗脱量为4～5倍柱体积。

5、如权利要求2所述的红花药材提取物的提取方法，其特征是所述步骤3)中喷雾干燥的干燥器的进风口温度为170℃，出风口温度为80℃，雾化盘转速为20000转/分钟。

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