CN115778994B - 红花叶总黄酮提取纯化方法及其应用 - Google Patents
红花叶总黄酮提取纯化方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115778994B CN115778994B CN202211289551.5A CN202211289551A CN115778994B CN 115778994 B CN115778994 B CN 115778994B CN 202211289551 A CN202211289551 A CN 202211289551A CN 115778994 B CN115778994 B CN 115778994B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- safflower
- macroporous resin
- total flavonoids
- liver
- leaf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 title claims abstract description 212
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 title claims abstract description 211
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 title claims abstract description 98
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 title claims abstract description 98
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 title claims abstract description 97
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 45
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 144
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 88
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 88
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 claims description 82
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 claims description 82
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 claims description 82
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 claims description 82
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 82
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 claims description 53
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 231100000012 chronic liver injury Toxicity 0.000 claims description 25
- 231100000439 acute liver injury Toxicity 0.000 claims description 24
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 18
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 13
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 13
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 7
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 6
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 abstract description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 91
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 57
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 42
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 17
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 17
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 15
- SEBFKMXJBCUCAI-HKTJVKLFSA-N silibinin Chemical group C1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2[C@H](OC3=CC=C(C=C3O2)[C@@H]2[C@H](C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)CO)=C1 SEBFKMXJBCUCAI-HKTJVKLFSA-N 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 10
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 9
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 9
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 9
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 8
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 8
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 6
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 5
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 5
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 4
- SEBFKMXJBCUCAI-UHFFFAOYSA-N NSC 227190 Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C2C(OC3=CC=C(C=C3O2)C2C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)CO)=C1 SEBFKMXJBCUCAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 230000006996 mental state Effects 0.000 description 4
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 4
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 4
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 3
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 231100000832 liver cell necrosis Toxicity 0.000 description 3
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 230000007863 steatosis Effects 0.000 description 3
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 3
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 206010019837 Hepatocellular injury Diseases 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDQAOULAVFHKBX-UHFFFAOYSA-N Isosilybin A Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C2C(OC3=CC(=CC=C3O2)C2C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)CO)=C1 FDQAOULAVFHKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- VLGROHBNWZUINI-UHFFFAOYSA-N Silybin Natural products COc1cc(ccc1O)C2OC3C=C(C=CC3OC2CO)C4Oc5cc(O)cc(O)c5C(=O)C4O VLGROHBNWZUINI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 2
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 125000004073 flavone group Chemical group 0.000 description 2
- -1 flavonoid compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 231100000849 liver cell damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 2
- 229940043175 silybin Drugs 0.000 description 2
- 235000014899 silybin Nutrition 0.000 description 2
- 229960004245 silymarin Drugs 0.000 description 2
- 235000017700 silymarin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 2
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 2
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 2
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 241000208838 Asteraceae Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 206010024642 Listless Diseases 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003123 carboxymethyl cellulose sodium Polymers 0.000 description 1
- 229940063834 carboxymethylcellulose sodium Drugs 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009693 chronic damage Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 208000017971 listlessness Diseases 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 102000014898 transaminase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
- A61K36/286—Carthamus (distaff thistle)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明提出了红花叶总黄酮提取纯化方法及其应用，属于中药活性成分提取及中药活性成分应用技术领域，其方法包括采用乙醇对红花叶进行加热回流，乙醇与红花叶的体积比为20‑30:1，浓缩，形成浓缩滤液，利用大孔树脂对浓缩滤液进行吸附，用乙醇对吸附后的大孔树脂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩至无乙醇味，干燥，即得红花叶总黄酮粉末。本发明对红花叶进行分析，提取红花叶中的总黄酮，并研究提取的总黄酮的应用，将红花的资源进行更好的利用。
Description
技术领域
本发明属于中药活性成分提取及中药活性成分应用技术领域，具体为红花叶总黄酮提取纯化方法及其应用。
背景技术
红花为菊科植物的干燥管状花，是中国传统的珍贵药材，也是蒙医临床应用最广泛的药材之一。本药性凉，味微苦，归心，肝经，是活血通经，去淤止痛之良药。一直以来，人们对红花的使用和研究只集中于其药花，但是红花植物的花产量很低，这就使得红花的研究价值和开发利用价值受到了很大的限制，人们采集红花的药花分析其化学成分，也主要是对红花药花中的生物碱和萜类进行研究。
红花的药花被采收后，产生的大量红花叶被弃掉而出现资源的浪费，然而红花叶也有很大的应用价值，其除了与红花的药花一样含有生物碱和萜类外，其还含有黄酮类化合物，且植物源黄酮类化合物具天然低毒的特点，但是现有技术中却很少对红花叶的价值进行研究，造成天然的资源被浪费。
发明内容
针对上述所描述的现有技术中很少有对红花叶的价值进行研究，造成天然的资源被浪费的问题，本发明提出了红花叶总黄酮提取纯化方法及其应用。
本发明提出了对红花叶中的总黄酮进行提取纯化的方法，并对提取纯化的红花叶总黄酮的价值进行分析、研究，对红花叶中的总黄酮进行利用，将红花的资源进行更好的应用，其具体技术方案如下：
红花叶总黄酮提取纯化方法，包括以下步骤：
采用乙醇对红花叶进行加热回流，乙醇与红花叶的体积比为20-30:1，浓缩，形成浓缩滤液，利用大孔树脂对浓缩滤液进行吸附，用乙醇对吸附后的大孔树脂进行洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发仪浓缩至无醇味，-80℃冷冻过夜，使用真空冷冻干燥机，即得红花叶总黄酮粉末。
进一步限定，所述加热回流的条件为：用体积浓度为70％-90％的乙醇对红花叶进行加热回流1-3次，每次加热回流时间为30min-90min。
进一步限定，所述步骤还包括对大孔树脂进行预处理：用质量浓度为0.3％-0.5％的HCl浸泡大孔树脂，水洗涤至中性；用质量浓度为0.3％-0.5％的NaOH浸泡大孔树脂，水洗涤至中性；用无水乙醇浸泡大孔树脂，水洗涤至大孔树脂无乙醇味；用90％-95％的乙醇浸泡大孔树脂后湿法装柱。
进一步限定，所述大孔树脂为HPD-600大孔树脂、HPD-100大孔树脂、D-101大孔树脂、HP-20大孔树脂或AB-8大孔树脂。
进一步限定，所述大孔树脂的质量为80g-120g；所述浓缩滤液中红花叶提取物的体积为100ml-150ml。
进一步限定，所述步骤还包括：调节洗脱液的PH＝7。
上述的红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮。
上述的红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮在制备护肝药物或辅助护肝保健品方面的应用。
进一步限定，所述红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮在制备急性肝损伤药物方面的应用。
进一步限定，所述的红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮在制备慢性肝损伤药物方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明红花叶总黄酮提取纯化方法，其对红花叶中的总黄酮进行提取，提取工艺简单，提取效率高，实现了红花叶总黄酮提取，便于将红花的资源进行更好的应用。
2、本发明对大孔树脂进行预处理，使得大孔树脂处于中性环境，便于浓缩滤液中的红花叶提取物进行更好的吸附。
3、本发明对红花叶中提取的总黄酮进行分析、研究，发现其在保肝、护肝方面都有很好的应用效果，实现了红花叶总黄酮的进一步应用，可显著增加H2O2诱导人肝L02氧化损伤细胞的细胞活力(P<0.05)。
4、本发明提取的红花叶总黄酮对急性肝损伤有很好的应用效果，实现了红花叶总黄酮的进一步应用，对急性肝损伤小鼠的肝脏病理结构、肝脾脏器指数、肝功能等指标均有显著的改善作用(P<0.05)。
5、本发明提取的红花叶总黄酮对慢性肝损伤有很好的应用效果，实现了红花叶总黄酮的进一步应用，对慢性肝损伤大鼠的肝脏病理结构、肝脾脏器指数、肝功能指标、氧化因子和炎症因子等均有显著的改善作用(P<0.05)。
附图说明
图1为H2O2诱导L02肝细胞损伤的影响柱状图，注：***p<0.001，vs对照组；
图2为红花叶总黄酮对L02细胞毒性的影响柱状图；
图3为红花叶总黄酮对H2O2诱导L02肝细胞活力的影响柱状图，注：###p<0.001，vs对照组；**p<0.01，***p<0.001，vs模型组；
图4为红花叶总黄酮对CCl4致小鼠慢性肝损伤肝脾指数的影响柱状图，注：a为肝脏指数，b为脾脏指数；
图5为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、TBA水平的影响，其中，a为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠血清中ALT水平的影响，b为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠血清中AST水平的影响，c为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠血清中TBA水平的影响；注：#p<0.05，###p<0.001，vs对照组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，vs模型组；
图6为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠肝组织病理图，其中，a为肝组织外观形态图，b为肝组织切片后HE染色放大图，c肝组织切片后Masson染色放大图；
图7为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠肝组织病理变化影响的柱状图，注：###p<0.001，vs对照组；**p<0.01，***p<0.001，vs模型组；
图8为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠肝组织中SOD、MDA、GSH和CAT含量的影响图，其中，a为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠肝组织中SOD的影响图，b为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠肝组织中MDA的影响图，c为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠肝组织中GSH的影响图，d红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠肝组织中CAT的影响图；注：##p<0.01，###p<0.001，vs对照组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，vs模型组；
图9为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平，其中，a为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠血清中IL-1β的表达水平图，b为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠血清中IL-6的表达水平图，c为红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠血清中TNF-α的表达水平图，注：##p<0.01，###p<0.001，vs对照组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，vs模型组；
图10为红花叶总黄酮对急性肝损伤小鼠肝、脾脏器指数的影响，其中，a为红花叶总黄酮对急性肝损伤指数的影响，b为红花叶总黄酮对急性脾脏损伤指数，注：#P<0.05，vs对照组；*P<0.05，**P<0.01，vs模型组；
图11为红花叶总黄酮对急性肝损伤小鼠血清生化指标的影响，其中，a为红花叶总黄酮对CCl4致急性肝损伤小鼠血清中ALT水平的影响，b为红花叶总黄酮对CCl4致急性肝损伤小鼠血清中AST水平的影响，c为红花叶总黄酮对CCl4致急性肝损伤小鼠血清中TBA水平的影响，注：###P<0.001，vs对照组；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，vs模型组；
图12为红花叶总黄酮对急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响，其中，A为空白组对急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响，B为模型组对急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响，C为水飞蓟素组对急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响，D为红花总黄酮低剂量组对急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响，E为红花总黄酮高剂量组对急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明的技术方案进行进一步地解释说明，但本发明并不限于以下说明的实施方式。
实施例1
本实施例红花叶总黄酮提取纯化方法，其包括以下步骤：
取体积比为26:1的乙醇和红花叶，该红花叶是阴干粉碎并过筛后形成的红花叶碎片，此处所使用的乙醇的体积浓度为80％，将乙醇加入红花叶中，进行加热回流2次，浓缩，形成浓缩滤液，利用大孔树脂对浓缩滤液进行吸附，接着用体积浓度为95％的乙醇进行洗脱，将大孔树脂吸附的有效成分洗脱至洗脱液中，收集洗脱液，旋转蒸发仪浓缩至无醇味，-80℃冷冻过夜，使用真空冷冻干燥机，即得红花叶总黄酮粉末。
实施例2
本实施例红花叶总黄酮提取纯化方法，其包括以下步骤：
取体积比为26.8:1的乙醇和红花叶，该红花叶是阴干粉碎并过筛后形成的红花叶碎片，此处所使用的乙醇的体积浓度为80％，将乙醇加入红花叶中，通过乙醇对红花叶进行加热回流2次，每次加热回流的时间为60分钟，对加热回流后形成的滤液进行浓缩，形成浓缩滤液，优选的，本实施中，大孔树脂的质量为100g，对应的浓缩滤液中红花叶提取物的体积为120ml，该利用大孔树脂对浓缩滤液进行吸附，接着用体积浓度为95％的乙醇进行洗脱，将大孔树脂吸附的有效成分洗脱至洗脱液中，收集洗脱液，调节洗脱液的酸碱度，使洗脱液的PH＝7，旋转蒸发仪浓缩至无醇味，-80℃冷冻过夜，使用真空冷冻干燥机，即得红花叶总黄酮粉末。
本实施例中的大孔树脂需要进行预处理，其预处理过程为：用质量浓度为0.4％的HCl浸泡大孔树脂，浸泡后用蒸馏水洗涤至中性；用质量浓度为0.4％的NaOH浸泡大孔树脂，浸泡后用蒸馏水洗涤至中性；用无水乙醇浸泡大孔树脂，浸泡后用蒸馏水洗涤至大孔树脂无乙醇味；之后再用体积浓度为95％的乙醇浸泡大孔树脂后湿法桩柱。
本实施例中的大孔树脂为HPD-600大孔树脂、HPD-100大孔树脂、D-101大孔树脂、HP-20大孔树脂或AB-8大孔树脂，优选的，本实施例的大孔树脂为AB-8大孔树脂。
本实施中大孔树脂洗涤的过程除了用蒸馏水，还可以用纯净水、二次蒸馏水等。
本实施例中乙醇和红花叶的体积比还可以是：20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1或30:1。
实施例3
本实施例红花叶总黄酮提取纯化方法，其包括以下步骤：
取体积比为20:1的乙醇和红花叶，该红花叶是阴干粉碎并过筛后形成的红花叶碎片，此处所使用的乙醇的体积浓度为70％，将乙醇加入红花叶中，通过乙醇对红花叶进行加热回流1次，每次加热回流的时间为90分钟，对加热回流后形成的滤液进行浓缩，形成浓缩滤液，优选的，本实施例中大孔树脂的质量为80g，浓缩滤液中红花叶提取物的体积为100ml，利用大孔树脂对浓缩滤液进行吸附，接着用体积浓度为90％的乙醇进行洗脱，将大孔树脂吸附的有效成分洗脱至洗脱液中，收集洗脱液，调节洗脱液的酸碱度，使洗脱液的PH＝7，旋转蒸发仪浓缩至无醇味，-80℃冷冻过夜，使用真空冷冻干燥机，即得红花叶总黄酮粉末。
本实施例中的大孔树脂需要进行预处理，其预处理过程为：用质量浓度为0.3％的HCl浸泡大孔树脂，浸泡后用蒸馏水洗涤至中性；用质量浓度为0.3％的NaOH浸泡大孔树脂，浸泡后用蒸馏水洗涤至中性；用无水乙醇浸泡大孔树脂，浸泡后用蒸馏水洗涤至大孔树脂无乙醇味；之后再用体积浓度为95％的乙醇浸泡大孔树脂后湿法桩柱。
本实施例中的大孔树脂为HPD-600大孔树脂、HPD-100大孔树脂、D-101大孔树脂、HP-220大孔树脂或AB-8大孔树脂，优选的，本实施例的大孔树脂为AB-8大孔树脂。
本实施中大孔树脂洗涤的过程除了用蒸馏水，还可以用纯净水、二次蒸馏水等。
实施例4
本实施例红花叶总黄酮提取纯化方法，其包括以下步骤：
取体积比为30:1的乙醇和红花叶，该红花叶是阴干粉碎并过筛后形成的红花叶碎片，此处所使用的乙醇的体积浓度为90％，将乙醇加入红花叶中，通过乙醇对红花叶进行加热回流3次，每次加热回流的时间为30分钟，对加热回流后形成的滤液进行浓缩，形成浓缩滤液，优选的，本实施例中大孔树脂的质量为100g，浓缩滤液中红花叶提取物的体积为150ml，利用大孔树脂对浓缩滤液进行吸附，接着用体积浓度为95％的乙醇进行洗脱，将大孔树脂吸附的有效成分洗脱至洗脱液中，收集洗脱液，调节洗脱液的酸碱度，使洗脱液的PH＝7，旋转蒸发仪浓缩致无醇味，-80℃冷冻过夜，使用真空冷冻干燥机，冷冻干燥即得红花叶总黄酮粉末。
本实施例中的大孔树脂需要进行预处理，其预处理过程为：用质量浓度为0.5％的HCl浸泡大孔树脂，浸泡后用蒸馏水洗涤至中性；用质量浓度为0.5％的NaOH浸泡大孔树脂，浸泡后用蒸馏水洗涤至中性；用无水乙醇浸泡大孔树脂，浸泡后用蒸馏水洗涤至大孔树脂无乙醇味；之后再用体积浓度为90％的乙醇浸泡大孔树脂后湿法桩柱。
本实施例中的大孔树脂为HPD-600大孔树脂、HPD-100大孔树脂、D-101大孔树脂、HP-20大孔树脂或AB-8大孔树脂，优选的，本实施例的大孔树脂为AB-8大孔树脂。
本实施中大孔树脂洗涤的过程除了用蒸馏水，还可以用纯净水、二次蒸馏水等。
本申请中的红花叶总黄酮是指从红花叶中提取的总黄酮。
上述实施例1-实施例4任一项的红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮。
为了获取本申请的最佳提取效果，分别采用单因素试验和响应面法对本申请的红花叶总黄酮提取纯化方法进行优化，其优化过程为：
单因素试验：
1、将经过预处理的大孔树脂加入40mL、pH分别为2、4、7、10、12的实施例2中的浓缩滤液中，震荡吸附4h，静置12h，检测其中总黄酮含量，计算出吸附率，选出最佳PH值。
2、取红花叶提取液进行上样，分段收集流出液，每份40mL，收集10份流出液，测定总黄酮含量。流出液中总黄酮浓度如果达到上样液浓度的10％时，称为泄漏点，当流出液中总黄酮浓度达到上样液浓度的100％时，称为饱和点，收集流出液，测定流出液中总黄酮的含量。
3、称取10g吸附总黄酮达到饱和状态的大孔树脂，用去离子水对其进行清洗，分别加入体积浓度为20％、40％、60％、80％、95％的乙醇40mL，震荡洗脱2h。静置8h，检测其中总黄酮含量，计算出解吸率，由解吸率得出最适乙醇浓度。
4、准确称取10g干燥的红花叶粉末，加热回流提取，分别考察提取次数(1、2、3、4、5次)、提取时间(30、60、90、120、150min)、料液比(1:15、1:20、1:25、1:30、1:35g/mL)、乙醇浓度(50％、60％、70％、80％、90％)对总黄酮提取率的影响。将供试品溶液按照总黄酮含量测定方法操作，根据标准曲线计算提取率。
通过单因素试验得出，并综合考虑时间成本和经济成本，选择提取次数为2次，料液比为1:25，提取溶剂为80％乙醇，单次提取时间为60min。最优的浓缩滤液的pH＝7，浓缩滤液的最优上样量为120mL，最优的大孔树脂洗脱时使用的乙醇的体积浓度为95％，经过AB-8大孔树脂富集纯化后得到的红花叶总黄酮纯度达到61.42％。
响应面法：
根据单因素试验结果，固定提取次数2次的条件下，选取料液比(A)、乙醇浓度(B)、提取时间(C)3个因素为变量，以红花叶总黄酮提取率(X)为响应值，采用Box-Behnken法设计三因素三水平响应面试验。使用Design-Expert8.0.6软件对试验数据进行二次响应面回归分析，得到如下多元二次回归方程X(％)＝4.89+0.1449A+0.061B+0.0588C+0.0774AB+0.0831AC+0.0399BC-0.4463A2-0.5328B2-0.2238C2。对回归模型进行方差分析，该模型显著性检验的P值为<0.0001，表明该模型具有统计学意义，失拟项P＞0.05，CV％为1.57％，说明回归模型拟合较好，能较准确反映3个因素对红花叶总黄酮提取率的影响。另外乙醇浓度和提取时间、料液比和提取时间均有一定的交互作用，而料液比和乙醇浓度的等高线为椭圆形，3D响应面几乎无曲度，说明二者几乎无较大的交互作用，由此可知各因素对红花叶总黄酮提取率的影响大小为料液比>乙醇浓度>提取时间。
根据响应面法得到最优提取条件为：料液比1:26.852，乙醇浓度80.776％，提取时间65.175min，此条件下红花叶总黄酮的提取率理论值可达4.907％。考虑到实际可操作性，对最佳提取条件优化为料液比1:27，乙醇浓度80％，提取时间65min，得到实际提取率为4.921％，与理论值差0.014％，说明此模型预测较好且稳定。
本申请的红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮在制备护肝药物或辅助护肝保健品方面的应用。
具体的，本申请的红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮在制备肝损伤药物方面的应用。
试验过程主要是利用H2O2诱导L02肝细胞损伤：
H2O2配置：1640培养基稀释H2O2原液1mol/L，配成浓度250μmol/L的工作液。
10mg/mL本实施例2制备的红花叶总黄酮配置的贮存液。
一、H2O2诱导L02肝细胞损伤的条件筛选
取对数生长期L02细胞，胰酶消化后以1.5×104/孔接种于96孔培养板中，每孔100μL，接种12小时以后，细胞完全贴壁，分别用含有50μmol/L、100μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L的工作液替换原有培养基，并设置不含H2O2的空白对照孔，每组设置6个复孔。继续培养细胞4h，每孔加120μL MTT溶液(基培：MTT＝100:20)，孵育4h，弃上清，加入150μL二甲亚砜。震荡3min，在酶标仪490nm处测定吸光度值，重复实验3次，计算细胞存活率，选取适宜的H2O2浓度范围进行后续实验。
参见图1，与对照组相比，随着H2O2浓度的增加，L02肝细胞的存活率逐渐降低，当浓度为250μmol/L时，细胞存活率降为22.78％(P<0.001)。随双氧水浓度进一步升高，L02肝细胞存活率逐渐降低，且逐渐出现细胞生长稀疏，细胞膜破损、细胞结构不清。结果表明，可选择250μmol/L作为H2O2诱导L02肝细胞损伤的条件。
二、红花叶总黄酮对L02细胞毒性的影响
分别设置空白对照组、不同浓度的红花叶总黄酮处理组，该红花叶总黄酮采用的是实施例2制备的产物，每组设6个复孔。取对数生长期L02细胞，以1.5×104/孔接种于96孔培养板中，接种12小时以后，细胞完全贴壁，分别用含有1μg.mL-1、2μg.mL-1、5μg.mL-1、10μg.mL-1、20μg.mL-1、50μg.mL-1、100μg.mL-1、250μg.mL-1、500μg.mL-1以及1000μg.mL-1的工作液替换原有培养基，继续培养细胞24h，每孔加120μLMTT溶液(基培：MTT＝100:20)，孵育4h，弃上清，加150μL二甲亚砜。震荡3min，在酶标仪490nm处测定吸光度值，重复实验3次，计算细胞存活率，选取适宜的红花叶总黄酮浓度范围进行后续实验。
参见图2，红花叶总黄酮浓度在在2至20μg/mL范围内，对L02细胞无细胞毒性。
三、红花叶总黄酮对H2O2诱导L02肝细胞活力的影响
分别设置对照组、H2O2模型组(终浓度为250μmol/L)、H2O2组和红花叶总黄酮工作液(1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml以及100μg/ml)，该红花叶总黄酮采用的是实施例2制备的产物，每组设6个复孔。取对数生长期L02细胞，以1.5×104/孔接种于96孔培养板中，接种12小时以后，细胞完全贴壁，分别用含有1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml以及100μg/ml的红花叶总黄酮工作液替换原有培养基，预处理细胞24h，加入H2O2继续培养4h后，每孔加入120μL MTT(基培：MTT＝100:20)，孵育4h，弃上清，加150μL二甲亚砜。震荡3min，在酶标仪490nm处测定吸光度值，重复实验3次，计算细胞存活率，选取适宜的红花叶总黄酮范围进行后续实验。
参见图3，与对照组相比，250μmol/L的H2O2对L02细胞的活力造成了一定的损伤(P<0.001)。与模型组比较，在2μg·mL-1至20μg·mL-1范围内，红花叶总黄酮对H2O2诱导的人肝L02细胞氧化损伤有一定的保护作用，细胞活力由模型组的71.9％提升至85.4％以上，具有显著差异(P<0.001)。
通过实施例1和实施例3-4制备的红花叶总黄酮进行同样的利用H2O2诱导L02肝细胞损伤试验，其试验结果与上述结果近似，即本申请的红花叶总黄酮能够对肝细胞的损伤进行保护，具有一定的护肝作用，其可以用来制备肝损伤药物。
具体的，本申请的红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮在制备慢性肝损伤药物方面的应用。
试验过程主要是用红花叶总黄酮对四氯化碳诱导慢性肝损伤小鼠：
一、红花叶总黄酮长期给药对小鼠体重、脏器指数和生化指标的影响
将SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分成3组，每组10只。将3组分别标记为空白组、红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组，对照组给予0.5％羧甲基纤维素纳溶液，红花叶总黄酮低剂量组给予红花叶总黄酮20mg/kg，红花叶总黄酮高剂量组给予红花叶总黄酮40mg/kg，每天一次，连续灌胃给药6周。每周监测并记录小鼠体重；第6周末次给药16小时后，进行小鼠眼眶采血，称取小鼠肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏；通过全自动生化仪检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、总胆汁酸(Total bile acid，TBA)、白蛋白(Albumin，ALB)、总蛋白(Total Protein，TP)、肌酐(Creatinine，CREA)、尿素(UREA)、尿酸(Uric acid，UA)的生化指标含量。
如表1所示，在实验周期内与空白组相比，红花叶总黄酮低剂量组、红花叶总黄酮高剂量组对小鼠体重、各器官脏器指数和AST、ALT、ALP、TP、ALB、TBA、CREA、UREA、UA等血清生化指标无显著性差异。说明红花叶总黄酮给药周期内对正常小鼠体重、脏器指数、肝肾功能无显著影响。
表1红花叶总黄酮长期给药对正常小鼠小体重、脏器指数和血清生化指标的影响(n＝10)
二、CCl4慢性肝损伤造模及给药试验(本实验中的红花叶总黄酮是本申请实施例2的方法制备的)
将SPF级雄性C57BL/6小鼠，随机分成5组，每组12只。分别为对照组、模型组、水飞蓟宾组(阳性对照组)、红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组。除对照组外，模型组、阳性对照组、红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组的小鼠腹腔注射20％CCl4(CCl4﹕橄榄油＝1:4，2mL/kg)，对照组小鼠腹腔注射等量的橄榄油溶液，每周两次，共6周。水飞蓟宾和红花叶总黄酮分别混悬于0.5％CMC-Na溶液中，水飞蓟宾、TFFCL-L和TFFCL-H组分别灌胃给予水飞蓟宾100mg/kg、红花叶总黄酮20mg/kg和红花叶总黄酮40mg/kg，对照组和模型组灌胃给予等量的0.5％CMC-Na溶液，每天一次，连续灌胃给药6周。动物喂养期间每周监测并记录小鼠体重，第6周末次给药16小时后，进行小鼠眼眶采血，称取小鼠肝脏、脾脏，拍照并称重记录肝脏和脾脏湿重。计算脏器指数(脏器指数＝脏器质量/体质量×100％)。
对照组小鼠毛色光滑，精神状态较好。与对照组相比，模型组小鼠精神萎靡不振，食欲下降，体重明显减轻，其余给药组小鼠毛色、精神状态和摄食等明显优于模型组。如表2和图4所示，与对照组相比，模型组小鼠的肝脏、脾脏脏器指数升高具有极显著性差异(P<0.001)。与模型组相比，红花叶总黄酮各给药组及阳性组肝、脾脏器指数显著降低(P<0.05)。
表2：红花叶总黄酮对CCl4致小鼠慢性肝损伤肝脾指数的影响
注：###p<0.001，vs对照组；*p<0.05，**P<0.01，vs模型组
红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、TBA水平的影响，如表3和图5所示，为实验组小鼠血清所测得的肝生化指标水平，模型组小鼠与对照组相比，其ALT、TBA水平极显著升高(P<0.001)，AST水平显著升高(P<0.05)。说明CCl4成功诱导小鼠肝损伤。与模型组相比，红花叶总黄酮低剂量组、红花叶总黄酮高剂量组的ALT和AST等指标分别降至模型组的64.3和67.8％以下，具有显著差异(P<0.05)，红花叶总黄酮高剂量组的TBA降至模型组的72.9％，具有显著差异(P<0.05)，结果说明红花叶总黄酮可以较好的保护肝细胞、改善肝功能作用。
表3：红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、TBA水平的影响(n＝10)
注：#P<0.05，###P<0.001，vs对照组；**P<0.01，***P<0.001，vs模型组；
红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响，参见图6和图7，对照组小鼠肝脏外观表面光滑，色泽红润；模型组小鼠肝脏颜色暗沉，欠光泽，表面有明显的粗颗粒状物质，边缘钝化；阳性组和红花叶总黄酮给药组小鼠肝脏表面虽仍有细小颗粒状物质，但较模型组比均有不同程度的改善。HE染色法是判断炎症细胞浸润、细胞脂肪变性、坏死等肝损伤状态的常用病理检测手段。HE染色结果显示，对照组小鼠肝组织结构正常，肝细胞无坏死、排列整齐，大小均匀，以中央静脉为中心呈放射状排列，细胞核位于细胞中央，圆整、边界清晰，肝小叶结构完整；模型组小鼠肝细胞排列紊乱，纤维结缔组织增生，汇管区炎性细胞及坏死细胞增多，出现大量的脂肪变性及肝细胞坏死，明显的炎症细胞浸润；阳性组和红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组小鼠肝细胞变性、坏死及炎症细胞浸润的现象较模型组显著改善。
Masson染色法常用于鉴别胶原纤维和肌纤维的，可准确判断肝组织纤维化的程度。Masson染色结果显示，对照组小鼠肝组织切片细胞结构完整，未见明显的胶原纤维产生；CCl4组小鼠肝组织切片中可明显观察到大量增生的胶原纤维；阳性组、红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组小鼠肝组织切片中虽仍有一定量的胶原纤维形成，但与模型组相比较轻。红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组能不同程度地减少胶原纤维组织增生及纤维化程度。经各组小鼠肝脏胶原纤维阳性面积统计，模型组的胶原纤维阳性面积由空白组的1.01％增加至9.52％，两组间具有显著差异(P<0.001)；与模型组相比，阳性组和红花叶总黄酮组的胶原纤维阳性面积均降至3.47％以下，两组间具有显著差异(P<0.01)。结果说明红花叶总黄酮给药能不同程度地减少胶原纤维组织增生及纤维化程度。
如表4和图8所示，与对照组相比，模型组肝组织中SOD、CAT和GSH含量显著降低(p<0.01)，MDA含量显著增加(p<0.01)。与模型组相比红花叶总黄酮组和阳性药组可不同程度上改善慢性肝损伤小鼠的肝组织氧化指标(P<0.05)。结果说明红花叶总黄酮可通过抗氧化活性发挥肝保护的作用。
表4：红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠肝组织中SOD、MDA、GSH和CAT含量的影响
注：#P<0.05，###P<0.001，vs对照组；*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001，vs模型组
红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠血清炎性指标的影响，参见表5和图9，与对照组相比，模型组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著升高(p<0.001)。与模型组相比，TFFCL-L组显著抑制TNF-α和IL-1β和IL-6表达(P<0.01)，阳性组和TFFCL-H组不同程度上可降低TNF-α和IL-1β和IL-6的水平(P<0.05)。以上结果初步表明，红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组通过调节免疫，在一定浓度范围内可抑制肝纤维化小鼠血清中炎症因子的表达。从而发挥抗肝纤维化的作用。
表5：红花叶总黄酮对CCl4致慢性肝损伤小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平
注：#P<0.05，###P<0.001，vs对照组；*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001，vs模型组；
通过实施例1和实施例3-4制备的红花叶总黄酮进行同样的利用CCl4诱导致慢性肝损试验，其试验结果与上述结果近似，即本申请的红花叶总黄酮能够对肝细胞的慢性损伤进行保护，能够改善肝功能，减少肝组织胶原纤维组织增生及纤维化程度，并具有抗氧化活性，具有护肝的作用，其可以用来制备慢性肝损伤类的药物。
具体的，本申请的红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮在制备急性肝损伤药物急性肝损伤药物方面的应用。
试验过程主要是用红花叶总黄酮对四氯化碳诱导急性肝损伤小鼠：
实验选取50只健康雄性昆明小鼠，将小鼠随机分为空白组、模型组、水飞蓟素组(阳性对照组)、红花叶总黄酮低剂量(TFFCL-L)组和红花叶总黄酮高剂量(TFFCL-H)组，每组各10只。红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组分别给予实施例2制备的红花叶总黄酮提取物50mg/kg和100mg/kg，水飞蓟素组给予水飞蓟素100mg/kg，空白组和模型组灌胃给予等体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液，每天一次，连续灌胃给药14天。第14天末，除空白组腹腔注射等量的橄榄油溶液外，模型组、水飞蓟素组、红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组小鼠均腹腔注射含0.1％CCl4的橄榄油溶液10mL/kg。小鼠末次给药后间隔24h，眼球取血后处死，分取肝脏及脾脏并称取其重量，计算小鼠的肝脏指数及脾脏指数；收集血清，采用全自动生化分析仪检测小鼠血清中ALT、AST和TBA含量。
每周监测并记录小鼠体重，试验结束后摘取各组小鼠肝脏、脾脏，生理盐水清洗后用滤纸吸干，拍照并称重记录肝脏和脾脏湿重。计算脏器指数(脏器指数＝脏器质量/体质量×100％)，验证红花叶总黄酮对急性肝损伤小鼠肝、脾脏器指数的影响，参见图10，空白组小鼠毛色光滑，精神状态较好。与空白组相比，模型组小鼠精神萎靡不振，食欲下降，体重明显减轻，其余水飞蓟素组、红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组小鼠毛色、精神状态和摄食等明显优于模型组。与空白组相比，模型组小鼠的肝脏、脾脏脏器指数升高具有显著性差异(P<0.05)。与模型组相比，水飞蓟素药组肝脏指数显著降低(P<0.05)，红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组的肝、脾脏器指数在不同程度上降低(P<0.05)。
监测各组小鼠血清中血清AST、ALT和TBA的含量；参见图11，与空白相比，模型组小鼠ALT、AST、TBA水平显著升高(P<0.001)。说明模型组小鼠出现肝功能损伤。与模型组相比，水飞蓟素、红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组小鼠的ALT、AST、TBA均显著降低(P<0.05)，表明红花叶总黄酮可以较好改善急性肝损伤小鼠的肝功能。
将各组小鼠肝脏在4％多聚甲醛固定液中固定，肝脏组织进行石蜡包埋并切片(5μm)，常规方式脱蜡，进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察肝组织损伤的病理变化，HE染色结果如图12显示，空白组小鼠肝组织结构正常，肝细胞无坏死、排列整齐，大小均匀，以中央静脉为中心呈放射状排列，细胞核位于细胞中央，圆整、边界清晰，肝小叶结构完整；模型组小鼠肝细胞排列紊乱，纤维结缔组织增生，汇管区炎性细胞及坏死细胞增多，出现大量的脂肪变性及肝细胞坏死，明显的炎症细胞浸润；水飞蓟素组、红花叶总黄酮低剂量组和红花叶总黄酮高剂量组小鼠肝细胞变性、坏死及炎症细胞浸润的现象较模型组显著改善。
通过实施例1和实施例3-4制备的红花叶总黄酮进行同样的利用CCl4诱导致急性肝损试验，其试验结果与上述结果近似，即本申请的红花叶总黄酮能够对肝细胞的急性损伤进行保护，能够改善小鼠急性肝损伤，还能够改善小鼠肝细胞变性、小鼠肝细胞坏死及小鼠肝细胞炎症。具有护肝的作用，其可以用来制备急性肝损伤类的药物。
Claims (8)
1.红花叶总黄酮提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用乙醇对红花叶进行加热回流，乙醇与红花叶的体积比为20-30:1，浓缩，形成浓缩滤液，利用大孔树脂对浓缩滤液进行吸附，用体积浓度为95％的乙醇对吸附后的大孔树脂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩至无乙醇味，冷冻，干燥，即得红花叶总黄酮粉末；
所述加热回流的条件为：用体积浓度为70％-90％的乙醇对红花叶进行加热回流1-3次，每次加热回流时间为30min-90min；
所述大孔树脂为AB-8大孔树脂。
2.如权利要求1所述的红花叶总黄酮提取纯化方法，其特征在于，所述步骤还包括对大孔树脂进行预处理：用质量浓度为0.3％-0.5％的HCl浸泡大孔树脂，水洗涤至中性，用质量浓度为0.3％-0.5％的NaOH浸泡大孔树脂，水洗涤至中性，用无水乙醇浸泡大孔树脂，水洗涤至大孔树脂无乙醇味；用90％-95％的乙醇浸泡大孔树脂后湿法装柱。
3.如权利要求1所述的红花叶总黄酮提取纯化方法，其特征在于，所述大孔树脂的质量为80g-120g；所述浓缩滤液中红花叶提取物的体积为100ml-150ml。
4.如权利要求1所述的红花叶总黄酮提取纯化方法，其特征在于，所述步骤还包括：调节洗脱液的PH＝7。
5.利用权利要求1-4任一项所述的红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮。
6.利用权利要求1-2任一项所述的红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮在制备护肝药物或辅助护肝保健品方面的应用。
7.利用权利要求1-2任一项所述的红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮在制备急性肝损伤药物方面的应用。
8.利用权利要求1-2任一项所述的红花叶总黄酮提取纯化方法所制备的红花叶总黄酮在制备慢性肝损伤药物方面的应用。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211289551.5A CN115778994B (zh) | 2022-10-20 | 2022-10-20 | 红花叶总黄酮提取纯化方法及其应用 |
| US18/380,875 US20240226217A9 (en) | 2022-10-20 | 2023-10-17 | Method for extracting and purifying total flavonoids from carthamus tinctorius l. leaf (tffcl), and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211289551.5A CN115778994B (zh) | 2022-10-20 | 2022-10-20 | 红花叶总黄酮提取纯化方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115778994A CN115778994A (zh) | 2023-03-14 |
| CN115778994B true CN115778994B (zh) | 2024-03-01 |
Family
ID=85433367
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211289551.5A Active CN115778994B (zh) | 2022-10-20 | 2022-10-20 | 红花叶总黄酮提取纯化方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115778994B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101084967A (zh) * | 2007-07-05 | 2007-12-12 | 湖北中医学院 | 红花黄酮类成分的提取纯化工艺 |
-
2022
- 2022-10-20 CN CN202211289551.5A patent/CN115778994B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101084967A (zh) * | 2007-07-05 | 2007-12-12 | 湖北中医学院 | 红花黄酮类成分的提取纯化工艺 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 红花叶中 1 个新的生物碱类化合物;张东博等;中草药;第50卷(第1期);22-24 * |
| 红花药物分析、化学成分及现代药理研究进展;邵礼梅等;中医药信息;第34卷(第02期);123-125 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20240131101A1 (en) | 2024-04-25 |
| CN115778994A (zh) | 2023-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nabi et al. | Antidiabetic and antihyperlipidemic activity of Piper longum root aqueous extract in STZ induced diabetic rats | |
| CN100346805C (zh) | 治疗脑功能低下、抗糖尿病活性的文冠果果壳提取物 | |
| CN115252509A (zh) | 一种用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物及其制备方法和应用 | |
| CN115778994B (zh) | 红花叶总黄酮提取纯化方法及其应用 | |
| CN108567836A (zh) | 一种从山楂皮渣中联合提取分离黄酮和多糖的方法 | |
| CN110101731B (zh) | 具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物及其制备方法与应用 | |
| CN104983816B (zh) | 一种牡丹皮提取物及其在制备防治肺纤维化药物中的用途 | |
| CN104971088A (zh) | 藏茵陈提取物及其制备方法、药物组合物和用途 | |
| US20240226217A9 (en) | Method for extracting and purifying total flavonoids from carthamus tinctorius l. leaf (tffcl), and use thereof | |
| CN108542926A (zh) | 一种马齿苋提取物的制备方法和药物组合物及其应用 | |
| CN107412393B (zh) | 一种黄皮叶多酚提取物的制备方法及其应用 | |
| CN108210518B (zh) | 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病 | |
| CN108324737B (zh) | 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病 | |
| CN108310015B (zh) | 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病 | |
| CN104800344B (zh) | 治疗灰指甲的中药制剂及其制备方法 | |
| CN112168848A (zh) | 一种海蓬子降血糖组分的制备方法及应用 | |
| TW201306851A (zh) | 用於治療糖尿病之植物萃取物及其製備方法 | |
| CN107213176B (zh) | 一种八仙花叶提取物及其药物组合物、制备方法和应用 | |
| CN101574426B (zh) | 一种治疗肝病的中成药及其制备方法 | |
| CN1857378A (zh) | 野生猕猴桃复方吞咽片及其制备方法 | |
| CN110172439A (zh) | 一种胰岛细胞的提取及增殖方法 | |
| CN1628754A (zh) | 大蒜局部外用止痒涂剂 | |
| CN116251144B (zh) | 六堡茶提取物的制备方法及其在口腔微生态调节中的应用 | |
| AU2008300612B2 (en) | Production of leaf extracts of Pittosporum phillyraeoides and the use thereof in medicine | |
| CN108743658B (zh) | 一种青钱柳和核桃叶提取物组合 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |