CN115252509A - 一种用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物的制备方法：将粉碎过的亚麻荠种子经过脱脂、醇提、酶解、浓缩、冷冻干燥得到亚麻荠提取物Ⅰ；粉碎过的亚麻荠植株经过醇提、酶解、浓缩、冷冻干燥得到亚麻荠提取物Ⅱ，亚麻荠提取物Ⅰ和/或亚麻荠提取物Ⅱ即为亚麻荠提取物。通过构建L‑多巴诱导的B16细胞模型，测定亚麻荠提取物能显著抑制酪氨酸酶的活性和黑色素的形成，所述亚麻荠提取物对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌有较好的抑制作用，这些抗菌活性能抑制皮肤疾病相关细菌，从而减少产品中化学防腐添加剂的用量。本发明亚麻荠提取物具有很好的美白和抗菌活性，能更好作为化妆品原料应用。

Description

一种用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于化妆品原料及制备技术领域，具体涉及一种亚麻荠提取物及其制备方法和作为化妆品原料在制备美白和/或抗菌化妆品中的应用。

背景技术

2021年1月1日实施的《化妆品监督管理条例》，国家鼓励和支持运用现代科学技术，结合我国传统优势项目和特色植物资源支持化妆品新原料的开发。化妆品原料具有美白功效需注册，因此研发难度较大，也需要科研与企业持续的投入。

黑色素的含量及分布决定着皮肤的颜色，黑色素形成的生理过程包括三个阶段：黑色素细胞产生黑色素；黑色素颗粒通过黑色素细胞树枝状突起向角朊细胞转移；转移至角朊细胞的黑色素颗粒随表皮细胞上行至角质层，并随角质层脱落而排泄。由于受紫外线、环境污染、内分泌失调、遗传等因素的影响，黑色素代谢异常，过量的黑色素沉着导致皮肤颜色加深、色斑和肤色不匀等皮肤问题。

酪氨酸酶tyrosinase(TYR, EC.1.14.18.1)是合成黑色素的关键酶，因此寻找酪氨酸酶抑制剂是开发皮肤美白活性成分的重要途径。然而传统的美白活性成分有汞类化合物、类激素和氢醌等，此类化合物易在体内沉积，细胞毒性大、对皮肤刺激性强、致敏性高、容易引起不良反应等缺点，在许多国家的卫生规范中已明令禁用。

皮肤菌群与皮肤健康存在重要的联系，痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等与皮肤健康相关的菌群的失衡可以直接导致出现皮肤红痒、湿疹、痤疮等皮肤问题。因此，改善皮肤菌群使恢复“正常”态是一种有效的护肤手段，化妆品中化学防腐剂对于产品本身会破坏皮肤微生态平衡，需要研究新的化妆品原料及化妆品来改善皮肤菌群使皮肤微生态保持平衡，进而通过短期效应和长期效应起到护肤功效。天然活性成分作为美白抗菌化妆品原料，因其毒副作用小、安全性高，对肌肤温和无刺激，备受人们青睐，已成为美白抗菌化妆品行业的一个发展趋势，也是近几年国内外研究的热点之一。

亚麻荠（Camelina sativa L.）为一年生草本植物，是一种古老的油料作物，属木兰纲，五桠果亚纲，山柑目，十字花科，亚麻荠属(Camelina)。亚麻荠籽油在化妆品里主要作用是柔润剂、皮肤调理剂。前期研究发现：亚麻荠种子中含有丰富的总黄酮、植物甾醇、不饱和脂肪酸、多种氨基酸和微量元素，富含人体必需的脂肪酸和多种天然活性成分，研究发现亚麻荠种子和植株中黄酮类成分含量较高。药理学研究发现，这类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗癌、免疫调节、抑制身体代谢紊乱等方面的作用，同时具有低毒、高活性等优点，具有较大的应用空间。目前围绕亚麻荠美白活性成分组提取工艺、功效评价及美白机理的研究鲜有报道，缺乏亚麻荠美白抗菌活性成分组提取技术和功效评价。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种新的亚麻荠提取物，其可以作为美白和/或抗菌化妆品原料。

本发明还提供了上述亚麻荠提取物的制备方法和作为原料在制备美白和/或抗菌化妆品中的应用，其能够显著抑制酪氨酸酶的活性和黑色素的形成，对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌有较好的抑制作用，可以作为新的化妆品原料，且温和无刺激，无毒副作用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物的制备方法，其包括以下步骤：

（1）亚麻荠提取物Ⅰ的制备

将粉碎过的亚麻荠种子，过筛，用索氏提取法进行脱脂，得到脱脂种子，按料液比1g：15~30mL加入乙醇溶液进行混合，然后加入一定量的生物复合酶一于45-65℃酶解2-5h，超声处理0.5-2h，过滤，收集滤液，旋蒸得到浸膏，冷冻干燥，得亚麻荠提取物Ⅰ；

（2）亚麻荠提取物Ⅱ的制备

将粉碎过的亚麻荠植株，过筛，按料液比1g：20~40mL加入乙醇溶液进行混合，然后加入一定量的生物复合酶二于45-65℃酶解1-3 h，超声处理0.5-2 h，过滤；滤液脱色后旋蒸得到浸膏，冷冻干燥，得亚麻荠提取物Ⅱ；

（3）所述的亚麻荠提取物Ⅰ和/或亚麻荠提取物Ⅱ，即为亚麻荠提取物，提取物中总黄酮含量78%以上。

上述的制备方法，具体的，步骤（1）中，所述乙醇溶液为体积浓度50-70%的乙醇水溶液。

上述的制备方法，具体的，步骤（1）中，所述生物复合酶一由质量比1:1.5-2.5的蛋白酶和果胶酶混合组成，蛋白酶和果胶酶活力均为20000 U/g；生物复合酶一加入量占脱脂种子质量的1.0%-2.5%。

上述的制备方法，具体的，步骤（2）中，所述乙醇溶液为体积浓度60-80%的乙醇水溶液。进一步的，为了提高亚麻荠提取物Ⅱ的产量，过滤后，收集滤渣并按料液比1g：20~30mL加入乙醇溶液浸提0.5-2h，合并滤液，进行脱色。

上述的制备方法，进一步的，步骤（2）中，所述生物复合酶二由质量比1:2-3的蛋白酶和果胶酶混合组成，蛋白酶和果胶酶活力均为20000 U/g；生物复合酶二加入量占亚麻荠植株质量的0.8%-2.0%。

具体的，步骤（1）和步骤（2）的冷冻干燥条件为：真空度20-80 Pa条件下，-20℃~ -40℃冷冻干燥4-6 h。

进一步的，步骤（2）中，滤液中加入脱色剂在50-70℃脱色1-2 h，脱色剂是由质量比1:1-3的硅藻土和活性炭组成的混合物；脱色剂与亚麻荠植株的质量比为1:10~30。

本发明提供了采用上述制备方法制备得到的用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物。

本发明还提供了上述亚麻荠提取物作为化妆品原料在制备美白和/或抗菌化妆品中的应用，即用于不同类型化妆品的开发和研发。

本发明还提供了一种美白和/或抗菌化妆品，其包括上述的亚麻荠提取物。

查阅现有文献发现，有关亚麻荠研究的技术大多为种植技术，尚未有关于亚麻荠提取物作为原料应用在化妆品的相关文献。本发明亚麻荠提取物能够抑制酪氨酸酶的活性和黑色素的形成，对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌有较好的抑制作用。因此，亚麻荠提取物开发作为一种新型的美白抗菌化妆品原料具有重要的研究意义。

和现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1）本发明中亚麻荠提取物是从亚麻荠种子和植株中提取精制得到，能显著抑制酪氨酸酶的活性和黑色素的形成，对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌有较好的抑制作用；

2）本发明亚麻荠提取物总黄酮含量达到78%以上，不同提取物的复配具有很好的美白和抗菌活性，能更好作为化妆品原料进行应用；

3）本发明方法的稳定性和重现性等都比较好。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

下述实施例中，所用仪器部分列举如下：

ME204万分之一电子天平（上海梅特勒·托利多），

AUW220D十万分之一电子天平（日本岛津），

移液枪：100 μL、200 μL、1000 μL(Eppendorf)，

FW-80高速万能粉碎机（北京永光），

HH-6数显恒温水浴锅（常州智博瑞仪器制造有限公司），

冷冻干燥机LGJ-12（北京松源华兴），

超声波提取仪KQ-500E（昆山市超声仪器有限公司），

紫外分光光度计TU1810（北京普析）。

下述实施例中所用材料部分列举如下：

亚麻荠种子、亚麻荠植株（采自河南汤阴），

乙醇、石油醚、正己烷、氢氧化钠、氯化钠等均为市售分析纯，

超纯水，蛋白酶（20000 U/g）和果胶酶（20000 U/g）购自上海源叶生物科技有限公司，

活性炭（100目）、硅藻土、多巴胺、酪氨酸酶等购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

B16小鼠黑色素瘤细胞、痤疮丙酸杆菌ATCC6919、表皮葡萄球菌ATCC12228、化脓性链球菌ATCC19615、金黄色葡萄球菌ATCC29213、铜绿假单胞菌ATCC27853、胰蛋白胨、琼脂、牛肉浸膏、胰酶、胎牛血清、青链霉素混合液（双抗）、RPMI-1640培养基均购自北京索莱宝科技有限公司。

总黄酮含量测定参照中国药典2020年版第一部山楂叶提取物项下总黄酮测定方法测定。

实施例1

一种亚麻荠提取物的制备方法，其包括以下步骤：

（1）将粉碎过的亚麻荠种子，过50目筛，然后按料液比1g：40 mL的量将亚麻荠种子与石油醚在85 ℃索氏提取6 h进行脱脂，获得脱脂亚麻荠种子。将脱脂亚麻荠种子与60%乙醇水溶液按照料液比1g:20mL进行混合，再加入由质量比为1:2.5的果胶酶和蛋白酶组成的生物复合酶一，生物复合酶一添加量为脱脂亚麻荠种子质量的1.5%，混匀，在50℃酶解3 h，超声处理1 h，过滤，收集滤液，滤液旋蒸至近干得到浸膏，真空度30 Pa条件下，-30℃冷冻干燥4 h，得亚麻荠提取物Ⅰ（总黄酮含量78.2%）；

（2）将粉碎过的亚麻荠植株，过50目筛，将亚麻荠植株与75%乙醇水溶液按照料液比1g:30mL进行混合，再加入由质量比为1:2的果胶酶和蛋白酶组成的生物复合酶二，生物复合酶二添加量为亚麻荠植株质量的1.0%，在50 ℃酶解2.5 h，超声处理1 h，过滤；收集滤渣再按照料液比1g:20 mL加入75%乙醇水溶液，提取0.5 h；合并滤液，然后加入由质量比为1:2的硅藻土与活性碳组成的混合物作为脱色剂进行脱色，脱色剂与亚麻荠植株的质量比为1:10，滤液脱色后旋蒸至近干得到浸膏，真空度30 Pa条件下，-30℃冷冻干燥5 h，得亚麻荠提取物Ⅱ（总黄酮含量79%）；

（3）所述的亚麻荠提取物Ⅰ和/或亚麻荠提取物Ⅱ，即为亚麻荠提取物。

实施例2

一种用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物的制备方法，其包括以下步骤：

（1）将粉碎过的亚麻荠种子，过50目筛，然后按料液比1g：40 mL的量将亚麻荠种子与石油醚在85 ℃索氏提取6 h进行脱脂，获得脱脂亚麻荠种子。将脱脂亚麻荠种子与70%乙醇水溶液按照料液比1g:20mL进行混合，再加入由质量比为1:1.5的果胶酶和蛋白酶组成的生物复合酶一，生物复合酶一添加量为脱脂亚麻荠种子质量的1%，混匀，在45℃酶解3 h，超声处理1 h，过滤，收集滤液，滤液旋蒸至近干得到浸膏，真空度30 Pa条件下，-30℃冷冻干燥5 h，得亚麻荠提取物Ⅰ（总黄酮含量78.5%）；

（2）将粉碎过的亚麻荠植株，过50目筛，将亚麻荠植株与70%乙醇水溶液按照料液比1g:25mL进行混合，再加入由质量比为1:3的果胶酶和蛋白酶组成的生物复合酶二，生物复合酶二添加量为亚麻荠植株质量的1.5%，在50℃酶解3 h，超声处理1 h，过滤；然后收集滤渣再按照料液比1g:20mL加入70%乙醇水溶液，提取0.5 h；合并滤液，然后加入由质量比为1:2的硅藻土与活性碳组成的混合物作为脱色剂进行脱色，脱色剂与亚麻荠植株的质量比为1:20，滤液脱色后旋蒸至近干得到浸膏，真空度30 Pa条件下，-30℃冷冻干燥5 h，得亚麻荠提取物Ⅱ（总黄酮含量80%）；

（3）所述的亚麻荠提取物Ⅰ和/或亚麻荠提取物Ⅱ，即为亚麻荠提取物。

实施例3

一种用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物的制备方法，其包括以下步骤：

（1）将粉碎过的亚麻荠种子，过50目筛，然后按料液比1 g：40 mL的量将亚麻荠种子与石油醚在85 ℃索氏提取6 h进行脱脂，获得脱脂亚麻荠种子。将脱脂亚麻荠种子与70%乙醇水溶液按照料液比1g:30mL进行混合，再加入由质量比为1:2的果胶酶和蛋白酶组成的生物复合酶一，生物复合酶一添加量为脱脂亚麻荠种子质量的2%，混匀，在50℃酶解3 h，超声处理1 h，过滤，收集滤液，滤液旋蒸至近干得到浸膏，真空度30 Pa条件下，-30℃冷冻干燥5 h，得亚麻荠提取物Ⅰ（总黄酮含量79.2%）；

（2）将粉碎过的亚麻荠植株，过50目筛，将亚麻荠植株与80%乙醇水溶液按照料液比1g:40mL进行混合，再加入由质量比为1:2的果胶酶和蛋白酶组成的生物复合酶二，生物复合酶二添加量为亚麻荠植株质量的1.0%，在50℃酶解3 h，超声处理1 h，过滤；然后收集滤渣再按照料液比1g:20mL加入80%乙醇水溶液，提取0.5 h；合并滤液，然后加入由质量比为1:2的硅藻土与活性碳组成的混合物作为脱色剂进行脱色，脱色剂与亚麻荠植株的质量比为1:30，滤液脱色后旋蒸至近干得到浸膏，真空度30 Pa条件下，-30℃冷冻干燥4 h，得亚麻荠提取物Ⅱ（总黄酮含量79.5%）；

（3）所述的亚麻荠提取物Ⅰ和/或亚麻荠提取物Ⅱ，即为亚麻荠提取物。

应用实验

将实施例1中的亚麻荠提取物Ⅰ、亚麻荠提取物Ⅱ及两者复配的组合物进行美白和抗菌活性作用试验。

人体皮肤中的黑色素是由黑色素细胞产生，可以通过细胞的树突结构转移至角质形成细胞中，并且能够重新排列分布，因此，伴随角质形成细胞的分化，黑色素可以向上迁移，最终迁移至皮肤角质层，在皮肤表面形成了色素沉积。酪氨酸酶在整个反应中作用重大，抑制酪氨酸酶的活性就能够有效抑制黑色素的形成。皮肤相关的细菌一旦侵入皮肤，造成皮肤微生态破坏：皮肤抵抗力降低，易发炎、感染异常敏感，反复长痘，皮肤屏障作用降低，易干燥、紧绷、发痒，水油失衡等等，不同亚麻荠提取物及其复配组合物具有很好的美白和抗菌活性，能更好作为原料在化妆品进行应用。

1，样品制备

精确称量亚麻荠提取物Ⅰ，加入含5%DMSO的无菌水溶液溶解并配制1000 μg/mL，过0.22 μm滤膜作为待测溶液母液，用RPMI-1640培养基稀释至不同的浓度（分别为400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL），获得不同浓度亚麻荠提取物Ⅰ的完全培养液。

亚麻荠提取物Ⅱ溶液的配制：同上法配制不同浓度亚麻荠提取物Ⅱ的完全培养液。

按照不同浓度比例配制亚麻荠提取物Ⅰ和亚麻荠提取物Ⅱ的复配组合物。

阳性对照组β-熊果苷的配制：加入含5%DMSO的无菌水溶液溶解并配制1000 μg/mL，过0.22 μm滤膜作为待测溶液母液，用RPMI-1640培养基稀释至100 μg/mL。

2，小鼠黑色素瘤细胞B16细胞活性测定

取对数期生长的B16小鼠黑色素瘤细胞，按照3×10⁴个/mL 的浓度接种于96 孔板中，每孔100 μL 培养液（含有10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的RPMI-1640培养基）。37℃、5% CO₂ 环境中培养24 h。弃去上清液，每孔添加含有不同浓度亚麻荠提取物的完全培养液（400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL）和β-熊果苷（100 μg/mL）各100 μL，对照组设定为不含亚麻荠提取物样品的同体积培养液，空白组不接种细胞只加100 μL培养液，每组设定3个重复。采用CCK-8法测定细胞活性。上述细胞于37 ℃，5% CO₂环境中继续培养24 h、48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养4 h 后，测定450 nm 处的吸光值，用空白孔调零，测定并计算细胞活力，细胞活力的计算公式如下：

细胞活力(%)=（样品组吸光值-空白组吸光值）/（对照组-空白组吸光值）×100% 。

亚麻荠提取物作用B16小鼠黑色素瘤细胞后，细胞活性如表1所示。表1的结果显示：作用浓度和处理时间会影响亚麻荠提取物对B16细胞增殖的抑制作用。低浓度的亚麻荠提取物对B16细胞的活性无显著抑制作用，亚麻荠提取物浓度低于400 μg/mL时，最长48 h的处理时间内，B16细胞活力未见明显下降。随着浓度的增加，亚麻荠提取物对B16细胞表现出一定的抑制作用。400 μg/mL 的亚麻荠提取物Ⅰ会显著抑制B16细胞的活性，该浓度下处理24 h，B16细胞的活力降低至88.02%，亚麻荠提取物Ⅱ会显著抑制B16细胞的活性，该浓度下处理48 h，B16细胞的活力降低至88.15%，两种提取物都呈现极显著的差异。不同质量比的亚麻荠提取物组合物在100 μg/mL对B16细胞的活性无显著抑制作用，浓度为100 μg/mL的β-熊果苷（阳性对照）同样极显著的抑制B16细胞的活性，处理24 h 后，细胞活力降至90.15%。

表1 亚麻荠提取物对B16细胞活力测定

3，亚麻荠提取物对B16小鼠黑色素瘤细胞黑色素含量的影响

采用NaOH溶解法测定B16细胞的黑色素含量，取对数期生长的B16小鼠黑色素瘤细胞，调整细胞浓度接种于6孔板（3×10⁴ 个/孔）在37 ℃，5% CO₂环境中培养24 h。吸弃上清液，加入不同浓度的亚麻荠提取物、100 μg/mL的β-熊果苷，每孔加入1 mL，对照组设定为不含亚麻荠提取物样品的同体积培养液，空白组不接种细胞只加1 mL培养液，每组设定3个重复。上述细胞于37 ℃，5% CO₂环境中继续培养24 h、48 h，弃去上清液后用PBS缓冲液冲洗3次。之后加入2 mL浓度为0.2 mol/L的NaOH溶液，80 ℃水浴1 h，彻底溶解细胞团块。测定492 nm处的吸光值，黑色素相对含量计算公式如下：

黑色素相对含量（%）=(样品组吸光值-空白组吸光值)/(对照组吸光值-空白组吸光值)×100%。

亚麻荠提取物作用B16细胞后对其黑色素含量的影响如表2所示。表2的结果显示：基于亚麻荠提取物对B16细胞活力的测定，选定亚麻荠提取物浓度为50、100 μg/mL进行黑色素含量的测定，在此设定浓度下，B16细胞的活性不会受到明显抑制。实验设定的最低浓度的亚麻荠提取物对B16 细胞黑色素合成没有明显的抑制作用。随着亚麻荠提取物浓度的增加，抑制作用逐渐加强，100 μg/mL的亚麻荠提取物Ⅱ处理B16细胞48 h，使得细胞内黑色素含量为72.08%，即亚麻荠提取物对黑色素生成量的抑制率达27.92%。阳性对照组β-熊果苷对黑色素生成量的抑制率达24.69%。亚麻荠提取物Ⅰ和亚麻荠提取物Ⅱ在48h对黑色素生成量的抑制率优于阳性对照药β-熊果苷。因此，亚麻荠提取物是一种潜在的黑色素合成抑制剂。

表2 亚麻荠提取物对B16细胞合成的影响

4，亚麻荠提取物B16细胞酪氨酸酶活性的影响

取对数期生长的B16小鼠黑色素瘤细胞，按照3×10⁴个/mL 的浓度接种于96孔板中，每孔100 μL培养液。37 ℃、5% CO₂环境中培养24 h。弃去上清液，每孔添加含有不同浓度亚麻荠提取物的完全培养液（400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL）和β-熊果苷（100 μg/mL）各100 μL。对照组设定为不含亚麻荠提取物样品的同体积培养液，空白组不接种细胞只加100 μL培养液，每组设定3个重复处理后的细胞继续培养24 h、48 h，吸弃培养液，后用PBS缓冲液冲洗3次。加入50 μL细胞裂解液1% TritonX-100，低温冷冻1 h，取出后室温融化。37 ℃孵育并加入10 μL浓度为1%的多巴胺溶液，反应1 h。测定475 nm处的吸光值，酪氨酸酶相对活力计算公式如下：

酪氨酸酶活力（%）=（样品组吸光值-空白组吸光值）/（对照组吸光值-空白组吸光值）×100%

如表3所示，与对照组相比，亚麻荠提取物对B16细胞酪氨酸酶活性具有显著的抑制作用。在实验设定的浓度范围内，100 μg/mL的亚麻荠提取物Ⅱ处理48 h后，酪氨酸酶活力降低至59.03%，与对照组呈现显著差异（p<0.05）。100 μg/mL的亚麻荠提取物Ⅰ处理48 h后，酪氨酸酶活力降低至61.34%，与对照组呈现显著差异（p<0.05），随着亚麻荠提取物浓度的增大及处理时间的增长，B16细胞酪氨酸酶活性逐步降低，呈现剂量依赖关系。亚麻荠提取物Ⅰ:亚麻荠提取物Ⅱ质量比为1:4，配制浓度为100 μg/mL，酪氨酸酶活力降低至64.21%，对B16细胞酪氨酸酶活性抑制率达到了35.79%。在实验设定范围内，亚麻荠提取物对B16细胞酪氨酸酶活性抑制率为15.66%~40.57%，显示亚麻荠提取物能较好地抑制B16细胞酪氨酸酶活性。

表3 亚麻荠提取物对酪氨酸酶活力的影响

5. 亚麻荠提取物体外抗菌活性的测定

（1） 菌株的复苏

将5种供试菌痤疮丙酸杆菌ATCC6919、表皮葡萄球菌ATCC12228、化脓性链球菌ATCC19615、金黄色葡萄球菌ATCC29213、铜绿假单胞菌ATCC27853，先进行斜面复苏，复苏后接种于固体培养基（牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化钠5.0 g、琼脂20.0 g、蒸馏水1.0L、pH 7.0、121 ℃ 15 min灭菌，下同）上，37 ℃ 培养20 h。

（2） 菌悬液的制备

从固体平板上挑取单个菌落接种到液体培养基（牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化钠5.0 g、蒸馏水1.0L、pH 7.0、121 ℃ 15 min灭菌，下同）中，制成浓度为1×10⁷ CFU/mL的菌悬液，备用。

（3） 最小抑菌浓度的测定

采用倍半稀释法测定各样品的最小抑菌浓度( MIC) 。首先将亚麻荠提取物制成初始质量浓度为的1200 μg/mL水溶液，再用液体培养基依次倍半稀释，总共稀释6个浓度，即各样品的实际检测质量浓度依次为600、300、150、75、37.5、18.75、9.38 μg/mL。以硫酸卡那霉素为阳性对照药，浓度为140、70、35、17.5 、8.75 μg/mL将上述各溶液按质量浓度大小依次加入96 孔板中，每孔100 μL; 再分别加入各供试菌悬液100 μL。每种菌液分别设置阴性组( 加入菌液100 μL 和液体培养基100 μL) 和空白组( 只加液体培养基100 μL) 。将制备好的96 孔板于37 ℃恒温培养18 h，观察结果。没有细菌生长的各孔均呈澄清状，而无细菌生长的孔所对应的最小检测质量浓度即为其MIC。

亚麻荠提取物对5种供试菌的MIC检测结果见表4。从表4中可以看出：5种待测样品中，亚麻荠提取物Ⅱ对5 种供试菌的抑制效果普遍比亚麻荠提取物Ⅰ好（MIC值小）。亚麻荠提取物Ⅱ对化脓性链球菌的抑制效果稍差外（MIC值大），对于其他供试菌的抑制作用则相同。并且和阳性对照药的MIC值接近，亚麻荠提取物Ⅰ:亚麻荠提取物Ⅱ为1:4（质量比）复配的组合物对5 种供试菌的抑制效果也较好，其中对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的MIC值与阳性对照药接近（相当）。

表4 亚麻荠提取物对6种供试菌的MIC值（μg/mL）

（4）最小杀菌浓度的测定

MIC 实验结束后，分别从没有细菌生长的各孔中取少量样液涂布于固体培养基上，37 ℃

培养24 h 后观察结果。完全没有细菌生长的各平板所对应的最小检测质量浓度即为其最小杀菌浓度( MBC) 。

待测样品对5种供试菌的MBC检测结果见表5。由表5可知：5种待测样品中，亚麻荠提取物Ⅱ对5 种供试菌的抑制效果普遍比亚麻荠提取物Ⅰ好，亚麻荠提取物Ⅱ对表皮葡萄球菌的杀菌效果优于阳性对照药硫酸卡那霉素，亚麻荠提取物Ⅱ对化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果稍差。对于亚麻荠提取物Ⅰ:亚麻荠提取物Ⅱ为1:4（质量比）复配的组合物对5 种供试菌的抑制效果也较好，对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的MBC值与阳性对照药接近（相当）。

表5 亚麻荠提取物对6种供试菌的MBC值（μg/mL）

结论：黑色素形成是一个复杂的过程，其中酪氨酸酶作为黑色素合成中的关键酶异常重要，因此，酪氨酸酶在整个反应中作用重大，抑制酪氨酸酶的活性就能够有效抑制黑色素的形成。皮肤菌群与皮肤健康存在重要的联系，痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等与皮肤健康相关的菌群的失衡可以直接导致出现皮肤红痒、湿疹、痤疮等皮肤问题。本发明的实验结果表明：亚麻荠提取物Ⅰ、亚麻荠提取物Ⅱ及两者不同比例复配的组合物均能够显著的抑制黑色素的形成，降低酪氨酸酶活性，可以达到美白效果；同时亚麻荠提取物对5种与皮肤菌群相关的细菌试验结果也表明其具有较好的抗菌杀菌效果。说明本发明亚麻荠提取物可作为新化妆品原料用于制备美白和/或抗菌化妆品。

Claims (10)

1.一种用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）亚麻荠提取物Ⅰ的制备

将粉碎过的亚麻荠种子，过筛，用索氏提取法进行脱脂，得到脱脂种子，按料液比1g：15~30 mL加入乙醇溶液进行混合，然后加入生物复合酶一于45-65℃酶解2-5 h，超声处理，过滤，收集滤液，旋蒸得到浸膏，冷冻干燥，得亚麻荠提取物Ⅰ；

（2）亚麻荠提取物Ⅱ的制备

将粉碎过的亚麻荠植株，过筛，按料液比1 g：20~40 mL加入乙醇溶液进行混合，然后加入生物复合酶二于45-65 ℃酶解1-3 h，超声处理，过滤；滤液脱色后旋蒸得到浸膏，冷冻干燥，得亚麻荠提取物Ⅱ；

（3）所述的亚麻荠提取物Ⅰ和/或亚麻荠提取物Ⅱ，即为亚麻荠提取物。

2.如权利要求1所述用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述乙醇溶液为体积浓度50-70%的乙醇水溶液。

3.如权利要求1所述用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述生物复合酶一由质量比1:1.5-2.5的蛋白酶和果胶酶混合组成，生物复合酶一加入量占脱脂种子质量的1.0%-2.5%。

4.如权利要求1所述用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乙醇溶液为体积浓度60-80%的乙醇水溶液。

5.如权利要求1所述用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述生物复合酶二由质量比1:2-3的蛋白酶和果胶酶混合组成，生物复合酶二加入量占亚麻荠植株质量的0.8%-2.0%。

6.如权利要求1所述用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物的制备方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）的冷冻干燥条件为：真空度20-80 Pa条件下，-20℃~ -40℃冷冻干燥4-6 h。

7.如权利要求1所述用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，滤液中加入脱色剂在50-70℃脱色1-2 h，脱色剂是由质量比1:1-3的硅藻土和活性炭组成的混合物；脱色剂与亚麻荠植株的质量比为1:10~30。

8.采用权利要求1至7任一所述制备方法制备得到的用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物。

9.权利要求8所述用于美白抗菌化妆品原料的亚麻荠提取物在制备美白和/或抗菌化妆品中的应用。

10.一种美白和/或抗菌化妆品，其特征在于，包括权利要求8所述的亚麻荠提取物。